Приложение 5. Инструкция по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус

Приложение 5

Инструкция
по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

Стандартные сыворотки антирезус служат для определения резус - принадлежности крови людей и приготавливаются из крови лиц, сенсибилизированных к резус-фактору, содержащих в крови активные резус - антитела.

Источники получения сыворотки антирезус

Кровь (плазма) для изготовления сывороток антирезус может быть получена: а) от женщин, сенсибилизированных к резус-фактору во время беременности; б) от больных, перенесших трансфузионные реакции или осложнения, которым производят кровопускание в процессе их лечения (обменные трансфузии, плазмаферез) и от тех же лиц после их излечения; в) от доноров, дающих кровь для переливания больным, в тех (редких) случаях, когда у них обнаружены в крови резус-антитела; г) от лиц, специально иммунизированных антигеном резус. (см.Метод.рекоменд. "Иммунизация доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус").

Выявление женщин, сенсибилизированных к резус-антигену
и содержащих в крови резус-антитела

Наиболее часто сенсибилизация к резус-антигену происходит у женщин во время беременности. Выявление таких лиц производится персоналом женских консультаций и родильных домов. Кровь резус-отрицательных женщин исследуют на наличие антител. При выявлении резус-антител сведения о таких лицах передаются в учреждения Службы крови.

Учет лиц, в крови которых содержатся резус-антитела

В тех случаях, когда устанавливается сенсибилизация к резус-антигену, т.е. наличие в крови у женщин резус-антител, таких женщин регистрируют и заводят на них карту "Учета изоимунных лиц". Карты заполняются персоналом родильных домов, в женских консультациях и в учреждениях Службы крови.

Привлечение к донорству лиц, в крови которых содержатся
резус-антитела

У женщин, в крови которых содержатся резус-антитела, может быть взята кровь для изготовления стандартной сыворотки.

Привлечение таких лиц к донорству требует особого подхода. Следует учитывать, что большинство из них перенесло тяжелую психическую травму в связи с болезнью, а иногда и смертью ребенка. Желательно рассказать женщине, что из ее крови будет приготовлена сыворотка-реактив, которую необходимо использовать при лечении детей с таким же заболеванием.

При согласии женщины дать кровь необходимо обследовать состояние ее здоровья и установить возможность и дозы взятия крови.

В дальнейшем, но не ранее, чем через полгода после родов и по окончании периода лактации желательно привлечение женщин, иммунизированных во время беременности, к систематическому донорству, а при падении титра антител - к реиммунизации, в соответствии с "Методическими рекомендациями по иммунизации доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус".

Показатели пригодности крови для изготовления из нее
стандартной сыворотки антирезус

Показателем пригодности крови для приготовления из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. титр резус-антител.

В виду возможного снижения титра антител при обработке сыворотки следует привлекать к донорству лиц, в крови которых содержатся антитела анти-D с титром, превышающим окончательные требования, предъявляемые к стандартным сывороткам. Для полных антител титр должен быть не ниже, чем 1:32, для неполных антител при исследовании их в непрямой пробе Кумбса - не ниже чем 1:128, а при исследовании реакцией с применением желатина в пробирках или реакцией в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:64.

Исходный титр резус-антител при изготовлении стандартного универсального реагента должен быть не ниже 1:32.

Методы и дозы взятия крови

Взятие крови от лиц, сенсибилизированных к резус-антигену предыдущими беременностями или трансфузиями крови, а также от искусственно иммунизированных доноров, состояние здоровья которых соответствует требованиям инструкции, предъявляемым к донорам, дающим кровь для переливания больным, допускается в дозах, предусмотренных этой инструкцией.

Плазму, содержащую резус-антитела, рекомендуется получать также методом плазмафереза, однако только вне периода беременности.

Оплата на усиление питания лицам, из крови которых изготавливается сыворотка антирезус, при любом методе взятия крови и последующего отделения сыворотки или плазмы, производится в тройном размере.

Первичная обработка сыворотки и плазмы

При получении плазмы из крови донора методом плазмафереза, плазма не позже, чем через 2-3 дня должна быть дефибринирована. Для этого плазму переливают из пластикатного мешка во флакон, добавляют в нее 20% раствор хлорида кальция из расчета 3 мл на 100 мл плазмы и содержимое флакона тщательно перемешивают. Через несколько минут после этого, а затем еще раз через 30 минут, флакон с плазмой встряхивают для отделения свертка от стенок флакона и оставляют на 2 часа при комнатной температуре, после чего помещают в холодильник при температуре 4-8°С. На следующий день сыворотку отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют борной кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азидом натрия - 1 г на 1 л.

Если кровь берут обычным путем в сухой флакон, то через несколько минут после взятия крови, а затем еще раз через 30 минут, флакон встряхивают для отделения свертка от стенок и оставляют на 2 ч при комнатной температуре, после чего помещают в холодильник при температуре 4-8°С. На следующий день сыворотку отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют. При высоком титре резус-антител можно получить дополнительное количество сыворотки антирезус путем приготовления смывов со свертка. Для этого сверток измельчают (разрезают на много частей) и заливают его до половины объема изотоническим раствором NаСl или сывороткой группы АВ(IV) с высокими конглютинирующими свойствами, стандартным разводителем или альбумином.

Флакон со свертком, залитым жидкостью, плотно закрывают пробкой и несколько раз переворачивают для того, чтобы лучше вымыть из свертка сыворотку антирезус, а затем помещают в холодильник при температуре 4-8°С. На следующий день сыворотку-смыв сливают в другой сосуд и оставляют в холодильнике до полного оседания эритроцитов, после чего переливают в другой сосуд и полученный смыв исследуют на активность резус-антител. Если титр соответствует требованиям, изложенным в пункте 11, смыв соединяют с первоначально полученной сывороткой или обрабатывают далее отдельно, предварительно добавляя в него борную кислоту из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия - 1 г на 1 л. Приготовление смыва можно повторить. Изотонический раствор NаСl применяется для смывов в тех случаях, когда предполагается последующее использование сыворотки антирезус реакцией агглютинации в солевой среде (в маленьких пробирках) или реакцией конглютинации с применением желатина или полиглюкина.

После такой первичной обработки сыворотку хранят при 4-8°С не менее 2-3 недель и затем приступают к дальнейшим исследованиям.

Исследование сыворотки

Исследование сыворотки следует производить через 2-3 недели после ее заготовки и консервирования ввиду того, что в этот период может происходить снижение титра антител. Исследование начинают с проверки групповой принадлежности сыворотки по системе АВО. Полученные результаты сверяют с паспортными записями на флаконе с сывороткой. Следует учесть, что если исследуется смыв со свертка, полученный сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем группы АВ(IV), то может произойти нейтрализация групповых антител альфа и бета. Если это будет установлено, то делают соответствующие изменения в паспортных записях. Далее определяют в сыворотке присутствие полных и неполных антител с помощью методов, описанных в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие резус-антител".

Для испытания применяется не менее трех образцов стандартных эритроцитов одноименной с испытуемой сывороткой группы или группы О(I), содержащих в том или ином сочетании три антигена резус: D, С и Е, а также два образца резус-отрицательных (ссddее) эритроцитов. Положительный результат с резус-положительными эритроцитами и отрицательный с резус-отрицательными подтверждает наличие в сыворотке резус - антител. После этого сыворотку титруют тем же методом, которым в ней были выявлены антитела. Например, если сыворотка дала положительный результат в солевой среде, ее титруют в солевой среде; если сыворотка дала положительный результат в непрямой пробе Кумбса или в реакции с применением желатина, ее титруют, используя эти методы; если сыворотка оказалась активной при использовании обоих методов, она титруется также с помощью двух методов (методы титрования см. в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие резус-антител").

Сыворотку считают пригодной для дальнейшей обработки и исследования, если в ней выявляют антитела любым методом и если при этом антитела достаточно активны. Активность антител определяется их титром, который на этом этапе исследования должен быть для полных антител не ниже 1:16, а для неполных антител в непрямой пробе Кумбса не ниже 1:64, реакциями с применением желатина или полиглюкина, и в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:32.

Сыворотки сохраняют в холодильнике при 4-8°С еще не менее 2 недель, после чего повторно титруют.

Примечание: в тех случаях, когда сыворотка антирезус принадлежит к группе О-альфа бета(I), А-бета(II) или В-альфа(III) для удобства последующего использования ее рекомендуется абсорбировать, т.е. удалить из нее групповые агглютинины, сделав таким образом ее универсальной.

Если в сыворотке присутствуют слабые антитела анти-С или анти-Е, их необходимо также удалить из сыворотки путем абсорбции.

После абсорбции (нейтрализации) сыворотку антирезус вновь исследуют и титруют как сказано выше.

Способы удаления или нейтрализации антител см. в Методических рекомендациях "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой специфичности".

Повторное титрование сыворотки

Повторное титрование сыворотки производят, используя метод, который дал положительный результат при первом исследовании сыворотки. Если титр антител сохранился или снизился не более чем на одну ступень, но так, что все же остался не ниже цифр, указанных в пункте 8, сыворотку можно подвергнуть стандартизации.

Стандартизация сыворотки антирезус

Стандартизация заключается в исследовании специфичности антител и в определении пригодности ее для практического использования. Для стандартизации сыворотку исследуют с помощью того же метода, в котором оказались активными содержащиеся в сыворотке антитела. Испытание ведется со стандартными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), содержащими различные антигены резус, в том числе каждый из этих антигенов в отдельности: ссDее, Ссddее и ссddЕе, и резус-отрицательными - ссddее. В число резус-отрицательных включают образцы эритроцитов, содержащих и не содержащих факторов Даффи (Fу) и Келл (К). Если при стандартизации сыворотка дает положительный результат со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, независимо от их антигенной структуры, и отрицательный результат с эритроцитами Ссddее, ссddЕе и резус-отрицательными - ссddее, то значит в сыворотке содержатся резус-антитела анти-D. Если в сыворотке таким образом выявлены антитела cпецифичности анти-D, то ее титруют при использовании того же метода.

Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат с некоторыми образцами резус-положительных эритроцитов и с эритроцитами Ссddee или ссddEе, но дает отрицательный результат с эритроцитами ссDее и с резус-отрицательными - ссddее, то это значит, что в сыворотке содержатся резус-антитела анти-С или анти-Е.

Антитела анти-С и анти-Е также титруют, используя метод, при помощи которого они были выявлены.

Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат одновременно со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, а также с эритроцитами Ссddeе и ссddEe, но отрицательный результат со всеми резус-отрицательными эритроцитами ссddее, то это значит, что сыворотка содержит антитела соответственно к двум или трем антигенам резус, т.е. анти-D+С, анти-D+Е или анти-D+С+Е.

Каждое из антител титруют отдельно теми методами, при использовании которых они оказались активными.

Следует отметить, что различные резус-антитела в одной и той же сыворотке бывают полными и неполными и поэтому могут быть соответственно активными в той или иной среде. В этих случаях их титрование следует проводить, используя разные методы.

Если исследуемая сыворотка дала положительный результат избирательно среди резус-отрицательных образцов, это значит, что в ней содержатся другие антитела, например, анти-Даффи или анти-Келл.

Исследование и обработку таких сывороток см. в "Инструкции по изготовлению сывороток редких групп".

Окончательное заключение о пригодности сыворотки

Сыворотка считается стандартной и пригодной для практического использования, если она содержит одно или несколько резус-антител в любой форме (полные или неполные) с титром для анти-D: в солевой среде не ниже 1:16; в непрямой пробе Кумбса - не ниже 1:64; для реакции с применением желатина или полиглюкина.

Ввиду редкости антител анти-С и анти-Е допускается использование таких сывороток с более низким титром при условии хорошо выраженного положительного результата. Сыворотки, отвечающие этим требованиям, считаются стандартными сыворотками данной специфичности.

Назначение сыворотки антирезус

Сыворотка антирезус, признанная стандартной, может быть использована в зависимости от формы установленных в ней антител: реакцией агглютинации в солевой среде, реакцией с применением желатина, реакцией в сывороточной среде на плоскости.

Кроме того сыворотка, содержащая неполные резус-антитела, может быть использована для приготовления стандартного универсального реагента антирезус с применением 33% раствора полиглюкина. Для этого требуется ее дальнейшая обработка (см. п.16).

Во всех случаях сыворотка и реагент, предназначенные для практического использования, должны быть расфасованы и паспортизированы.

Розлив и паспортизация стандартных сывороток антирезус

После стандартизации и заключения о пригодности сыворотки фильтруют и разливают в ампулы или в маленькие флаконы по 2-5 мл, в зависимости от потребности. На флаконы (ампулы) наклеивают этикетки с наименованием учреждения-изготовителя, номера серии, обозначения группы крови по системе АВО, специфичности, формы антител антирезус и срока годности.

Хранение и срок годности стандартной сыворотки антирезус

Расфасованные стандартные сыворотки антирезус хранят в холодильнике при 4-8°С или в замороженном состоянии при - 15°С и ниже.

При хранении в замороженном состоянии сыворотка не изменяет свойств в течение 2 лет.

При размораживании или хранении ее при 4-8°С срок годности устанавливают 4 мес.

Активность резус-антител в большинстве случаев сохраняется и дольше. Поэтому по истечении срока годности сыворотки могут быть проверены (см. п.10) и при сохранении их специфичности и титра срок годности продлевают: для сыворотки, хранящейся в замороженном состоянии, - еще на 1 год, а для сыворотки, хранившейся при 4-8°С, - на 2 месяца.

       /-----------------------\        /-----------------------\

       |Наименование учреждения|        |Наименование учреждения|

       |     изготовителя      |        |     изготовителя      |

       |                       |        |                       |

       |Сыворотка антирезус    |        |Сыворотка антирезус    |

       \-----------------------/        \-----------------------/

   /------------------------------\  /------------------------------\

   |анти-....... неполные антитела|  |анти-.......   полные антитела|

   |для метода ...................|  |для метода ...................|

   |Группа крови .................|  |Группа крови .................|

   |Серия...........   ........ мл|  |Серия...........   ........ мл|

   |                              |  |                              |

   |Годна  до ..................  |  |Годна  до ..................  |

   \------------------------------/  \------------------------------/

Рисунок 1. Форма этикеток для стандартных сывороток антирезус.

На этикетках группы А(II), В(III) и АВ(IV) наносят по диагонали цветные полосы:

для сыворотки группы А(II) - синие;

для сыворотки группы В(III) - красныe;

для группы АВ(IV) и специально приготовленной - универсальной - желтые.

Выдача стандартной сыворотки антирезус

При выдаче стандартной сыворотки антирезус к ней необходимо приложить инструкцию по использованию. Для сыворотки антирезус это особенно важно, так как сыворотки, содержащие антитела, разные по форме (полные и неполные) и приготовленные для разных методов исследования, активны только при применении определенного метода и будут неактивными или неспецифическими при неправильном их использовании. Инструкции по использованию для каждого метода см. дополнения 1, 2, 3.

Изготовление стандартного универсального реагента антирезус
для определения резус-принадлежности в пробирках без подогрева

Стандартный универсальный реагент антирезус пригоден для определения резус-фактора крови, независимо от ее групповой принадлежности по системе АВО. Реагент готовят из сывороток, содержащих неполные резус-антитела, предварительно обработанных, исследованных и признанных пригодными, как стандартные (см.п.п.6-11).

Для изготовления реагента отбирают сыворотки группы АВ(IV) или другой группы, но освобожденные от групповых агглютининов альфа и бета путем удаления или нейтрализации (см. Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой специфичности").

Для изготовления реагента пригодны сыворотки антирезус с титром не ниже, чем 1:32. Если исходные сыворотки имеют более высокий титр, допускается их разведение до титра 1:32 изотоническим раствором NаСl, сывороткой группы АВ(IV) или стандартным универсальным разводителем (см. Методические рекомендации "Приготовление сыворотки - разводителя и стандартного разводителя").

Титрование сывороток производят с применением 33% раствора полиглюкина.

В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначением 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024. Во все пробирки вводят по 2 капли изотонического раствора NаСl.

Затем в первую пробирку вводят той же пипеткой 2 капли исследуемой сыворотки антирезус, из первой пробирки, после перемешивания содержимого переносят 2 капли во вторую, из третьей - в четвертую и т.д. до последней, из которой 2 капли удаляют.

Затем во все пробирки добавляют по 1 капле резус-положительных эритроцитов или их смеси и по 1 капле 33% раствора полиглюкина.

Примечание: смесь эритроцитов готовят из крови 4-6 доноров группы О(I) резус - положительной, взятой не более, чем за 2-3 дня.

Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого, затем наклоняют почти до горизонтали и в таком положении медленно поворачивают по оси так, чтобы содержимое растеклось по стенкам пробирки. Такой контакт сыворотки с эритроцитами при поворачивании пробирок продолжают 3 минуты.

Через 3-5 минут во все пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1-2-кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!)

Результат наблюдают в проходящем свете невооруженным глазом или через лупу.

Оценку результата производят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов в виде комочков или хлопьев на фоне полностью или частично обесцвеченной жидкости.

Последнее разведение, в котором имеется агглютинация эритроцитов, принимают за титр исследуемой сыворотки.

Установив, что титр резус-антител в данном методе не ниже 1:32, переходят к дальнейшему исследованию, для чего готовят пробный образец реагента.

Изготовление пробного образца реагента антирезус

К 2 объемам сыворотки антирезус с неполными антителами добавляют 1 объем 33% раствора полиглюкина, тщательно перемешивают и далее проводят исследование в отношении специфичности и активности.

Исследование на специфичность и активность

Пробный образец реагента исследуют с 2-3 образцами резус-положительных эритроцитов, а также с резус-отрицательными ссddеe группы O(I), А(II) и В(III). Кроме того, в исследование включают эритроциты генотипа Ссddее и ссddЕe. Среди резус-отрицательных должны быть образцы положительные и отрицательные по факторам Даффи(Fу) и Келл(К).

Для исследования устанавливают ряд пробирок по числу образцов эритроцитов, пробирки маркируют. На дно пробирок помещают по 2 капли исследуемого реагента и затем в соответствии с маркировкой в пробирки вводят по 1 капле эритроцитов. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, затем пробирки наклоняют почти до горизонтального положения, медленно поворачивают и т.д., как сказано выше.

Трактовка результата

Результат учитывают по отсутствию или наличию агглютинации эритроцитов и скорости ее наступления в каждой пробирке.

Специфичность оценивают по отсутствию агглютинации с D-отрицательными эритроцитами различного фенотипа в каждой отдельной пробирке.

Если агглютинация произошла во всех пробирках с резус-положительными образцами, а со всеми резус-отрицательными образцами и образцами Ссddeе и ссddЕе - реакция отрицательная, пробный образец считают специфическим.

Активность пробного образца можно оценивать одновременно с оценкой специфичности.

Если агглютинация резус-положительных эритроцитов проявилась при поворачивании наклоненной пробирки в течение 1-й минуты и через 3 минуты после добавления изотонического раствора NаСl агглютинаты образуют крупные хлопья на фоне полностью просветленной жидкости и при этом титр антител, определенный на предыдущем этапе исследования не ниже 1:32, реагент считают пригодным для практического использования.

Изготовление полного объема (серии)
стандартного универсального реагента антирезус

После заключения о пригодности пробного образца можно готовить стандартный универсальный реагент в полном объеме, исходя из потребности. Изготовленный реагент вновь контролируют теми же методами, т.е. титруют и исследуют на специфичность и активность и делают заключение о его пригодности.

После этого реагент фильтруют, разливают по 2-5 мл во флаконы или ампулы, которые тщательно закупоривают (запаивают) и наклеивают на них этикетки с указанием учреждения, изготовившего реагент, название реагента, специфичности, номера серии и срока годности.

                   /--------------------------------------\

                   |        Наименование                  |

                   |  учреждения-изготовителя             |

                   |--------------------------------------|

                   | Универсальный реагент антирезус      |

                   | анти - .........................     |

                   | для метода в пробирках без подогрева |

                   |                                      |

                   | Серия .............       ........мл |

                   |                                      |

                   | Годен до ..................          |

                   \--------------------------------------/

Рисунок 2. Форма этикетки для стандартного универсального реагента антирезус.

Хранение и срок годности

Реагент хранят в холодильнике при 4-8°С.

Срок годности - 6 месяцев. Активность и специфичность реагента контролируют 1 раз в месяц в лаборатории, его изготовившей.

Выдача стандартного универсального реагента антирезус

Реагент антирезус выдается в другие учреждения в комплекте с 33% раствором полюглюкина и с инструкцией по использованию (см. дополнение 2).

Регистрация работы по изготовлению сыворотки и реагента антирезус

Все этапы работы по изготовлению сывороток, предназначенных для разных методов определения резус-принадлежности, а также реагента антирезус, регистрируются в "Журнале регистрации материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки антирезус" и в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки антирезус".

Дополнение 1

Инструкция
по использованию стандартной сыворотки антирезус для определения
резус-принадлежности реакцией с применением желатина.
(Прилагается при выдаче сыворотки)

Реакция с применением желатина пригодна для работы с сыворотками, содержащими неполные резус-антитела.

Общие замечания

При определении резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность сыворотки антирезус по системе АВО.

Сывороткой антирезус или группы АВ(IV) специально приготовленной - универсальной определяют резус-принадлежность в эритроцитах любой группы по системе АВО. Сывороткой антирезус группы O(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах группы O(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы O(I) и А(II) и сывороткой антирезус группы В(III) - в эритроцитах группы O(I) и В(III).

При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что и исследуемая кровь и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.

Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов

Кровь для исследования берут в количестве 5 мл в обычную пробирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.

Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество свободных эритроцитов, которые и следует употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов.

Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого натрия (0,25 мл на 1 мл крови) или другим стабилизатором. В этом случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить доверху изотонический раствор NаСl, содержимое ее перемешать и центрифугировать. Отмытые эритроциты используют для исследования. Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.

Техника реакции

а) В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок объемом не менее 10 мл по количеству исследуемых образцов эритроцитов и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. На двух пробирках каждого ряда надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.

б) В одинаково обозначенные пробирки вводят согласно маркировке по одной капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, в контрольные пробирки: - по одной капле (0,05 мл) стандартных резус-положительных эритроцитов и по 1 капле (0,05 мл) стандартных резус-отрицательных эритроцитов.

в) Во все пробирки добавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения в теплой воде (46-48°С). Перед употреблением желатин следует просмотреть. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойств застудневать при 4-8°С желатин непригоден.

г) Во все пробирки 1-го ряда добавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус.

2-ой ряд служит контролем для исключения возможной неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за счет аутоантител.

д) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками помещают в водяную баню при 46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30-45 минут.

е) По извлечении пробирок из водяной бани или термостата в них доливают 8-10 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1-2-краткого перевертывания пробирок.

Трактовка результатов

Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.

Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.

При положительном результате агглютинаты легко различимы в виде красных комочков на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне жидкости.

При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная слегка опалесцирующая жидкость.

Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, считают резуc - положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также после просмотра результатов во втором ряду. В пробирках второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно. Наличие агглютинации во втором (контрольном) ряду указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, напр., из-за аутоантител и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.

Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует применить сыворотку антирезус с полными антителами в реакции солевой агглютинации или предварительно отмыть эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl, для элюирования с них аутоантител.

Примечание.

1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабо выраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими сериями сыворотки антирезус высокой активности и, по возможности, сывороткой с полными антителами.

2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус - отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус - отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.

                                                          w

     3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е и С   производится

сыворотками,  содержащими  антитела  соответствующей  специфичности.  Эти

антитела могут быть в сыворотке как в чистом  виде,  так  и  в  различных

сочетаниях, в том числе и с анти-D.

Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус - антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа. Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".

Дополнение 2

Инструкция
по использованию стандартного универсального реагента
для определения резус-принадлежности в пробирках без подогрева
(Прилагается при выдаче реагента)

Стандартный универсальный реагент антирезус не содержит групповых агглютининов альфа и бета и поэтому может быть использован для определения резус-антигена D в эритроцитах любой группы системы АВО. Для контроля активности и специфичности реагента антирезус необходимо одновременно с основным исследованием ставить контроль, используя стандартные резус-положительные и стандартные резус - отрицательные эритроциты.

Предварительной обработки исследуемой крови и стандартных эритроцитов не требуется. Может быть использована кровь, взятая непосредственно из места укола пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови, взятой без стабилизатора.

Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.

Техника реакции

а) В штатив устанавливают 2 ряда пробирок по числу исследуемых эритроцитов в каждом ряду и по 2 пробирки для контрольных исследований. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.

б) Во все пробирки 1-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) стандартного универсального реагента антирезус.

Во все пробирки 2-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33% раствора полиглюкина.

2-й ряд служит контролем для исключения возможной неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за счет аутоантител.

в) В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови (эритроцитов) и стандартные резус-положительные (Rh+) и резус-отрицательные (rh-) эритроциты.

г) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки. Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной.

Как правило, агглютинация эритроцитов наступает уже в течение первой минуты, но для образования устойчивости комплекса антиген+антитело и четко выраженной реакции, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабовыраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при поворачивании пробирок проводят не менее 3 минут.

Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 2-3-кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!).

Трактовка результатов.

Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.

При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости, исследуемую кровь относят к резус-положительной (Rh+). При отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное окрашивание) исследуемую кровь можно считать резус-отрицательной (rh-).

Однако эти результаты можно учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами и отрицательной - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, а также после просмотра результатов во 2-м (контрольном) ряду. Во всех пробирках контрольного ряда агглютинации быть не должно.

Наличие агглютинации эритроцитов во втором (контрольном) ряду указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, например, за счет аутоантител и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.

Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует применять другую активную сыворотку антирезус и сыворотку антирезус с полными антителами или предварительно отмытые эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl для элюирования с них аутоантител.

Примечание.

1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими сериями сывороток антирезус высокой активности и параллельно сывороткой антирезус с полными антителами в реакции солевой агглютинации.

2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их на резус-положительных и резус-отрицательных по реагенту анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.

3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.

Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус - антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа.

Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".

Дополнение 3

Инструкция
по использованию стандартной сыворотки антирезус анти-D для определения
резус-принадлежности реакцией агглютинации в солевой среде
(Прилагается при выдаче сыворотки)

Реакция агглютинации в солевой среде пригодна для работы с сывороткой, содержащей полные резус-антитела.

Общие замечания

Определение резус-фактора следует производить двумя сериями стандартных сывороток антирезус. В настоящей инструкции описывается определение двумя сериями сыворотки с использованием одной и той же методики - агглютинации в солевой среде.

При определении резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность сыворотки по системе АВО.

Сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная - универсальная - предназначена для определения резус-принадлежности крови любой группы по системе АВО.

Сывороткой группы O(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы O(I) и А(II) и сывороткой группы В(III) - в эритроцитах группы O(I) и В(III).

При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы O(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.

Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов

Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора лимоннокислого натрия или любого другого стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое их перемешивают и центрифугируют.

Можно брать кровь и без стабилизатора. При этом после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как сказано выше.

Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего одну каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NаСl. Такую взвесь употребляют для исследования.

Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.

Техника реакции

а) в штатив устанавливают два ряда пробирок высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см и с гладким дном округлой формы в каждом ряду по числу исследуемых эритроцитов и по две пробирки для контрольных исследований. Предварительно штатив накрывают листом бумаги, в котором слегка накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется. Можно использовать планшет для иммунологических реакций, имеющий лунки с круглым дном.

б) во все пробирки (лунки) 1-го ряда вносят по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки) 2-го ряда - по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой серии и в оба ряда добавляют по 1 капле изотонического раствора NаСl;

в) в соответственно обозначенные пары пробирок (лунок) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси исследуемых эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси стандартных резус-положительных эритроцитов и по одной капле взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов;

г) содержимое пробирок (лунок) тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37°С на 1 час. (Можно затем оставить планшет при комнатной температуре еще на 1 - 2 часа до учета результатов).

За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в контакт с сывороткой антирезус.

Трактовка результатов

Пробирки (планшеты) рассматривают по продольной оси над источником света закрытым матовым стеклом.

Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.

При положительном результате осадок эритроцитов располагается на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой центральной части.

При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается равномерным слоем без шероховатости и неровностей, иногда с небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой правильно очерченный круг.

Диаметр при отрицательном результате всегда меньше, чем при положительном.

Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D - резус - положительные (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательные (rh-).

Однако результаты можно учитывать как истинные только при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус - отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I).

ГАРАНТ:

Рисунок в базе не приводится

Рисунок 3. Осадок эритроцитов при определении резус-принадлежности.

Примечания:

     1. Изредка встречаются образцы эритроцитов,  дающие  слабовыраженную

реакцию. В этих  случаях  следует  повторно  исследовать  их  несколькими

                                                                      v

сериями  сыворотки  антирезус  высокой  активности.   Антиген  крови D  в

реакции солевой агглютинации не выявляется.

2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е.

В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е, фенотипа ссddее.

3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.

2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е.

В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.

3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.

Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус-антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа.

Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".

"Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года N 05-14/28, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления

организации медицинской

помощи населению

А.И.Вялков