Приложение 3. Инструкция по определению групп крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток

Приложение 3

Инструкция
по определению групп крови системы АВО при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

Введение

Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания антигенных свойств эритроцитов (агглютиногенов) и антител по отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови.

Существуют два групповых агглютиногена - А и В, и два агглютинина - альфа и бета. Различные сочетания этих свойств образуют четыре группы крови: О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) и АВо (IV).

Возможны два способа определения группы крови:

1. Определение группы крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При этом способе в крови устанавливают наличие или отсутствие агглютиногенов и, исходя из этого, делают заключение о групповой принадлежности исследуемой крови.

2. Определение группы крови перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе, так же как и при первом, определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и, кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают наличие или отсутствие групповых агглютининов.

Группа крови у больных и других лиц, которым предполагается сделать переливание крови, определяется сертифицированным специалистом, имеющим специальную подготовку. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определения группы повторяют.

Результат определения группы крови записывается в правом верхнем углу лицевого листа истории болезни с указанием даты и за подписью специалиста, производившего определение.

Группа крови у доноров определяется два раза сертифицированным специалистом: один раз при первичном обращении донора при помощи стандартных сывороток двух различных серий каждой группы; и второй раз при окончательном зачислении в доноры - перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных сывороток (также двух различных серий каждой группы) и стандартных эритроцитов. Результат обоих определений записывается на лицевой стороне донорского журнала (карты) с указанием даты и за подписью лиц, определявших группу крови.

Примечание: При использовании изогемагглютинирующих сывороток с титром не ниже, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сыворотки каждой группы. При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены при первичном определении.

Специальное оснащение

а. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) и стандартная сыворотка группы АВо(IV).

б. Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III).*(6)

в. Изотонический раствор NаСl.

г. Белые фарфоровые или любые другие белые пластинки со смачиваемой поверхностью.

д. Пипетки.

е. Стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и сыворотки.

Подготовительная работа

а. Определение группы крови производят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25°С.

б. Ампулы, флаконы со стандартными сыворотками ставят в штатив с тремя гнездами (или в два штатива - при использовании двух серий сыворотки каждой группы). В левые гнезда ставят сыворотку группы О-альфа(I), в средние - сыворотку группы А-бета(II) и в правые - сыворотку группы В-aльфа(III). В ампулы опускают сухие чистые пипетки. Отдельно ставят сыворотку группы АВо (IV), употребляемую в качестве дополнительного контроля (см. раздел IV, в). Этот набор дополняют пробиркой или флаконом с изотоническим раствором NаСl.

в. Для определения группы крови перекрестным способом, кроме стандартных сывороток, подготавливают также стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в маленький (на три гнезда) штатив в следующем порядке: слева - группы О(I), в середине - группы А(II) и справа - группы В(III).

г. Для промывания стеклянных, пластмассовых палочек и пипеток подготавливают стаканы с водой и с изотоническим раствором NаСl.

Техника определения группы крови при помощи стандартных сывороток

а. На левой стороне пластинки надписывают О-альфа бета[анти-(А+В)], в середине - А-бета(анти-В) и справа - В-альфа(анти-А), на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.

Под соответствующим обозначением группы крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки соответствующей группы. Если используют стандартные сыворотки двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: O-альфа бета[анти-(А+В), А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А)].

Сыворотку берут из ампулы пипеткой, которую тотчас же после того, как из нее была выпущена сыворотка, опускают в ту же ампулу с сывороткой, из которой она была взята.

б. Кровь для исследования берут из места укола мякоти пальца или мочки уха. Капли крови величиной приблизительно 0,01 мл последовательно наносят сухой стеклянной палочкой на пластинку, каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки, с которой она смешивается).

в. Другой стеклянной палочкой перемешивают каплю крови с сывороткой группы О-альфа бета[анти-(А+В)] до тех пор, пока смесь не окрасится равномерно в красный цвет. Другой стеклянной палочкой перемешивают следующую каплю крови с сывороткой группы А-бета(анти-В) и так же поступают с сывороткой В-альфа(анти-А). При использовании двух серий сывороток так же делают во втором ряду. Можно перемешивать кровь с сывороткой одной и той же палочкой, но в этом случае необходимо после размешивания каждой капли промывать палочку в стакане с водой и насухо ее вытирать.

г. После размешивания капель пластинку покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.

Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Хотя агглютинация начинается в течение первых 10 - 30 секунд, наблюдение следует вести и далее - до пяти минут в виду возможности более поздней агглютинации, например, с эритроцитами группы А2(II).

д. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через три минуты, в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора NаСl и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения пяти минут.

Трактовка результатов реакции при определении группы крови
при помощи стандартных сывороток

Реакция гемагглютинации в каждой капле может быть положительной или отрицательной.

При положительной реакции обычно в течение первых 10-30 секунд от начала перемешивания в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные комочки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мелкие комочки постепенно сливаются в более крупные, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка полностью или почти полностью обесцвечивается.

При отрицательной реакции жидкость все время (5 минут) остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживается никаких агглютинатов.

Результаты реакций в каплях с сывороткой одной и той же группы должны совпадать.

Результаты с сыворотками трех групп: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А) могут дать четыре различные комбинации положительных и отрицательных реакций (см.табл.1).

а. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию, т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без признаков агглютинации, это значит, что кровь не содержит агглютиногенов А и В, т.е. принадлежит к группе О(I).

б. Если сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)] и В-альфа(анти-А) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А-бета(анти-В) - отрицательную, это значит, что кровь содержит агглютиноген А, т.е. принадлежит к группе А(II).

в. Если сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)] и А-бета(анти-В) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В-альфа(анти-А) - отрицательную, то исследуемая кровь содержит агглютиноген В, т.е. принадлежит к группе В(III).

г. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что исследуемая кровь содержит оба агглютиногена - А и В, и принадлежит к группе АВ(IV). Однако, в этих случаях для исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых эритроцитов необходимо провести дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВо(IV). Для этого на пластинку наносят большую каплю (0,1 мл) сыворотки группы АВо(IV) (контроль) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл) каплю исследуемой крови. Сыворотку и кровь перемешивают, после чего наблюдают за результатом в течение 5 минут при покачивании пластинки. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле, при наличии ее в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ(IV).

Техника определения группы крови перекрестным способом при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов

а. Определение группы крови перекрестным способом заключается в одновременном определении групповых агглютиногенов в эритроцитах испытуемой крови при помощи стандартных сывороток и групповых агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных эритроцитов.

б. Для определения группы крови перекрестным способом кроме стандартных сывороток используют стандартные эритроциты группы О(I), А(II) и В(III).

в. Кровь для исследования берут из вены или места укола пальца в сухую пробирку. Кровь центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 минут для отделения сыворотки (для лучшего отделения сыворотки через 3-5 минут следует отделить сверток от стенок пробирки, обведя его стеклянной палочкой).

г. Определение производят на белой пластинке, на верхнюю часть которой наносят обозначения слева направо: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А). На верхнем крае надписывают фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.

д. Под соответствующими обозначениями групп крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При использовании стандартных сывороток двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А).

е. На правую часть пластинки также под соответствующими обозначениями наносят по одной маленькой (0,01 мл) капле стандартных эритроцитов в следующем порядке слева направо: О(I), А(II) и В(III).

ж. Из пробирки, содержащей кровь больного, пипеткой извлекают сыворотку (осторожно, чтобы не взболтать эритроциты) и накапывают ее по одной большой (0,1 мл) капле на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна пробирки эритроциты испытуемой крови и наносят их по маленькой (0,01 мл) капле рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки.

з. Во всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (сухой стеклянной палочкой), пластинку покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Агглютинация в каплях со стандартной сывороткой обычно начинается быстро (10-30 секунд). Агглютинация в каплях, в которых сыворотку крови испытывают со стандартными эритроцитами, может наступить поздно (к концу пятой минуты), в связи с возможностью низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке агглютининов.

и. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты в те капли, в которых она наступила, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора NаСl и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения пяти минут.

Трактовка результатов при определении группы крови
перекрестным способом

Учет реакции производится путем сопоставления результатов, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов (см. табл.2).

Результаты реакций, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать, т.е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов, соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут быть выражены в четырех различных комбинациях.

а. Реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие групповых агглютиногенов, т.е. на принадлежность исследуемой крови к группе О(I) (см.раздел IV.а). При этом сыворотка исследуемой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы O(I) и положительную - с эритроцитами групп А(II) и В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютининов aльфа и бета, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе О-альфа бета(I).

б. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногена А (см. раздел IV.б). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп O(I) и А(II), но положительную с эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютинина бета, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе А-бета(II).

в. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови определяется наличие агглютиногена В (раздел IV,в). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп О(I) и B(III), но положительную с эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютинина альфа, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе В-альфа(III).

г. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногенов А и В, и исследование с контрольной сывороткой группы АВ(IV) подтверждает специфичность реакции (см.раздел IV.г). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, что указывает на отсутствие агглютининов в исследуемой крови, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе АВо(IV).

Причины ошибок и меры их предупреждения

Отступление от изложенных правил может привести к ошибочным заключениям о групповой принадлежности исследуемой крови.

Отступлением от правил могут явиться: ошибочный порядок расположения стандартных сывороток или эритроцитов в штативах, ошибочный порядок нанесения их на пластинку, неправильное соотношение количества сыворотки и эритроцитов, несоблюдение времени, необходимого для проведения реакции (5 минут), неиспользование контрольной реакции c сывороткой группы АВо(IV), загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, а также использование недоброкачественных стандартов, например, сыворотки с истекшим сроком годности (недостаточно активной), загрязненной или частично высохшей сыворотки, которая может вызвать неспецифическую реакцию агглютинации и т.д.

Эти отступления и связанные с ними ошибки могут привести к неправильной оценке результата реакции в целом и в каждой отдельной капле. Последнее может заключаться в следующем:

Лицо, определяющее группу крови, считает, что агглютинации не произошло, в то время как она фактически есть или должна появиться.

Лицо, определяющее группу крови, предполагает, что произошла агглютинация, в то время как она фактически отсутствует.

Первая ошибка, т.е. учет реакции как отрицательной при фактическом наличии агглютинации, может произойти:

а) в тех случаях, когда агглютинация начинается поздно или бывает слабо выражена. Это может зависеть от того, что стандартные сыворотки малоактивны, или от того, что эритроциты исследуемого лица обладают слабой агглютинабельностью. При одновременном наличии этих двух причин агглютинация может совсем не появиться, например, если малоактивная сыворотка группы В-альфа(анти-А) не даст агглютинации с эритроцитами группы А(II), если агглютинабельность последних низкая, например, подгруппа А2.

Во избежание этой ошибки необходимо наблюдать за ходом реакции не менее пяти минут и особенно внимательно за теми каплями, в которых еще не наступила агглютинация, а также работать только с активными сыворотками, агглютинирующая способность которых проверена и соответствует требованиям инструкции и в пределах срока ее годности;

б) при избытке крови, если взята слишком большая капля.

Во избежание этой ошибки следует соблюдать соотношение объема исследуемой крови и стандартной сыворотки (или стандартных эритроцитов и исследуемой сыворотки) приблизительно 1:10;

в) при высокой температуре (выше 25°С) окружающего воздуха например, в жаркую погоду (см.раздел II, а).

Во избежание этой ошибки пластинку, на которой определяется группа крови, следует охладить.

Вторая ошибка, т.е. учет реакции как положительной при фактическом отсутствии агглютинации, может произойти:

а) когда эритроциты испытуемой крови складываются в "монетные столбики", которые невооруженным глазом можно принять за агглютинаты. Во избежание этой ошибки необходимо добавление изотонического раствора NаСl (см.раздел III, д) с последующим покачиванием пластинки что, как правило, уничтожает "монетные столбики";

б) когда исследуемые эритроциты дают феномен ауто- или панагглютинации.

Во избежание этой ошибки необходимо не допускать определение групп крови при температуре ниже 15°С (см.раздел II, а) и обязательно использовать контрольные сыворотки группы АВо(IV) (см.раздел IV, г);

в) при использовании недоброкачественной сыворотки, дающей неспецифическую агглютинацию.

Во избежание этой ошибки следует просматривать ампулы (флаконы со стандартной сывороткой и не использовать ее, если в ней имеются помутнение или признаки высыхания.

г) когда пластинку со смесью эритроцитов и сыворотки не покачивают. В этом случае эритроциты, оседая на дно, могут образовать отдельные скопления, симулирующие агглютинацию.

Во избежание этой ошибки необходимо периодически покачивать пластинку, на которой проводится определение (см. раздел III, г и раздел V, з).

Однако и при правильной оценке реакции в каждой отдельной капле можно сделать неправильное заключение о групповой принадлежности, если спутать порядок расположения стандартов в штативе или на пластинке. Поэтому каждый раз в начале работы по определению групповой принадлежности следует тщательно проверять расположение в штативах пробирок со стандартными эритроцитами, а также всех ампул (флаконов) с сывороткой, их групповую принадлежность, номер серии и дату годности.

Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата необходимо повторное определение группы крови при помощи стандартных сывороток других серий. Если результаты также остаются неясными, а определение проводилось только при помощи стандартных сывороток, то следует определить группу крови также и перекрестным способом.

Примечание 1. При определении групповой принадлежности крови больных в лечебных учреждениях могут встретиться трудности, вызванные изменением свойств крови при различных патологических состояниях. Это может выразиться в неспецифической агглютинабельности эритроцитов, например, при аутоиммунной гемолитической анемии, у новорожденных с гемолитической болезнью, у больных циррозом печени, с ожогами, при гнойно-септическом состоянии. При некоторых заболеваниях, например, при лейкозах, наблюдается снижение агглютинабельности эритроцитов, особенно группы А(II), а также снижение активности групповых агглютининов.

В таких случаях определение групповой принадлежности крови больного должно производиться повторно с использованием стандартных сывороток более высокой активности, желательно в лабораторных условиях.

Примечание 2. При использовании для определения групп крови системы АВО моноклональных антител следует руководствоваться специальной инструкцией, которая прилагается к комплектам моноклональных антител при их выдаче.

Изогемагглютинирующие сыворотки группы			Исследуемая кровь принадлежит к группе
Оальфа бета(I) Анти-(А+В)	A-бета(II) Анти-В	B-aльфа(III) Анти-А
- - + + + +	- - - - + +	- - + + - -	О(I) A(II) B(III)
+ + + + + + Контроль с сывороткой группы АВо(IV)			AB(IV)

Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы. Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие ее.

/--------------------------------\  /--------------------------------\

|  Изогемагглютинирующие         |  |  Изогемагглютинирующие         |

|  сыворотки группы              |  |  сыворотки группы              |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

|Oaльфа бета|Aбета(II)| B-aльфа  |  |Oaльфа бета|Aбета(II)| B-aльфа  |

|(A+B)      | Анти-В  | (III)    |  |(A+B)      | Анти-В  | (III)    |

|Анти-(А+В) |         | Анти-А   |  |Анти-(А+В) |         | Анти-А   |

|-----------+---------+----------|  |-----------+---------+----------|

|    -      |    -    |    -     |  |    +      |    -    |    +     |

|    -      |    -    |    -     |  |    +      |    -    |    +     |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

|   Стандартные эритроциты       |  |   Стандартные эритроциты       |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

|  O(I)     |  A(II)  | B(III)   |  |  O(I)     |  A(II)  | B(III)   |

|  -        |    +    |    +     |  |  -        |    -    |    +     |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

| Исследуемая кровь группы       |  | Исследуемая кровь группы       |

|        О(I)                    |  |        A(II)                   |

\--------------------------------/  \--------------------------------/

/--------------------------------\  /--------------------------------\

|  Изогемагглютинирующие         |  |  Изогемагглютинирующие         |

|  сыворотки группы              |  |  сывороткиы групп              |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

|Oaльфа бета|Aбета(II)| B-aльфа  |  |Oaльфа бета|Aбета(II)| B-aльфа  |

|(A+B)      | Анти-В  | (III)    |  |(A+B)      | Анти-В  | (III)    |

|Анти-(А+В) |         | Анти-А   |  |Анти-(А+В) |         | Анти-А   |

|-----------+---------+----------|  |-----------+---------+----------|

|    +      |    +    |    -     |  |    +      |    +    |    +     |

|    +      |    +    |    -     |  |    +      |    +    |    +     |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

|   Стандартные эритроциты       |  |   Стандартные эритроциты       |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

|  O(I)     |  A(II)  | B(III)   |  |  O(I)     |  A(II)  | B(III)   |

|  -        |    +    |    -     |  |  -        |    -    |    -     |

|--------------------------------|  |--------------------------------|

| Исследуемая кровь группы       |  | Исследуемая кровь группы       |

|        B(III)                  |  |        AB(IV)                  |

\--------------------------------/  \--------------------------------/

Таблица 2. Оценка результатов определения групп крови перекрестным методом при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы и стандартных эритроцитов.

"Инструкцию по определению групп крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года N 05-14/27, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления

организации медицинской

помощи населению

А.И.Вялков