Приложение 11. Инструкция по исследованию сыворотки на наличие резус-антител

Приложение 11

Инструкция
по исследованию сыворотки на наличие резус-антител
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)

I. Введение

Резус-антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, они не являются нормальным свойством сыворотки человека, а появляются в крови резус-отрицательных людей лишь при особых условиях.

Условиями, способствующими образованию резус-антител, являются введение резус-отрицательному человеку резус - положительной крови или беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом.

Определение резус-антител наряду с определением резус - принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус - несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью.

Определение резус-антител требуется также при подготовке материала в целях использования для приготовления сывороток антирезус.

Резус-антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные.

Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус-антигены.

Полные антитела, соединяясь с резус-антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется

Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус-антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин), или использование сыворотки для пробы Кумбса, реагирующей с человеческим белком (непрямая проба Кумбса). При всех перечисленных условиях реакция между резус-антителами и эритроцитами, содержащими резус-антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.

Разные методы определения резус-антител требуют различных оптимальных для них температурных условий.

II. Общие замечания

1. Учет специфичности антител. Специфичность стандартных эритроцитов

Наиболее часто при иммунизации резус-отрицательных людей повторными трансфузиями крови или беременностями образуются антитела анти-D, но при этих же условиях могут образоваться и другие резус-антитела. Поэтому при определении антител в сыворотке крови человека эту сыворотку испытывают с резус-положительными эритроцитами, обязательно содержащими антигены резус: D, С, Е, с, е.

Если антигены С и Е в эритроцитах специально не определялись, то число резус-положительных образцов должно быть не менее 20 для того, чтобы среди них обязательно встретились все антигены резус.

В качестве контроля на специфичность реакции, а также для выявления антител анти-с и е в исследование включаются стандартные резус-отрицательные - сcddee эритроциты и, если возможно, собственные эритроциты лица, сыворотка которого испытывается.

Такое исследование является предварительным. Для уточнения специфичности требуются дополнительные специальные исследования (см. п.IХ).

2. Учет формы антител

Чаще всего при иммунизации резус-антигеном образуются неполные антитела: иногда одновременно с ними образуются и полные. Кроме того, встречаются случаи, в которых у человека образуются только полные резус-антитела.

Поэтому определение резус-антител следует производить не менее чем двумя методами, одним из которых обязательно должен быть метод солевой агглютинации, выявляющий полные антитела, а другим - любой метод, выявляющий неполные антитела.

III. О выборе метода выявления резус-антител

Ниже в п.III, IV, V, VI описаны различные методы исследования сывороток. Из них непрямая проба Кумбса (см.III), реакция с применением желатина (см.IV) и реакция с применением полиглюкина (см.V) выявляют неполные резус-антитела, и для этой цели может быть использован любой из них.

Метод исследования сыворотки в солевой среде (см.VI) выявляет полные резус-антитела и должен обязательно использоваться одновременно с любым из упомянутых выше.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте документа допущены опечатки и имеются в виду разделы IV, V, VI и VII соответственно

IV. Исследование сыворотки на наличие неполных резус-антител
непрямой пробой Кумбса

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления эритроцитов берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки доливают доверху изотоническим раствором NаСl, затем содержимое пробирок перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки остаются отмытые эритроциты, которые и применяют для исследования сыворотки.

2. Техника исследования

а. В штатив устанавливают и нумеруют пробирки высотой 4-10 см с внутренним диаметром 0,5-0,8 см (первые размеры удобнее). Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) испытуемой сыворотки.

в. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают маленькую каплю (0,01 мл) эритроцитов и переносят ее в пробирку с испытуемой сывороткой согласно нумерации пробирок.

г. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и помещают для инкубации в термостат на 45 мин. при температуре +37°С. За это время резус-антитела, если они имеются в испытуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах.

д. После инкубации в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют, после чего надосадочную жидкость отсасывают.

Такое отмывание эритроцитов повторяют 3-4 раза.

е. В каждую пробирку к отмытым таким образом эритроцитам добавляют 4-7 капель изотонического раствора NаСl для получения 5% взвеси (так как при отмывании эритроциты частично захватываются, интенсивность взвеси контролируют глазом).

ж. Одну каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью и к каждой капле прибавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки, приготовленной для пробы Кумбса.

з. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (стеклянной палочкой или углом предметного стекла), после чего пластинку слегка покачивают. При этом наблюдают результат (наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов).

Агглютинация обычно начинается в течение первых 10-30 сек, но при слабом титре резус-антител может наступить до 20 мин.

3. Трактовка результата

Наличие агглютинации в каплях с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на присутствие в сыворотке неполных резус-антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус-антитела - анти-D, С, Е, с, и е - не выявлены.

Определение специфичности выявленных антител см. п.IХ.

4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела

а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.

б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) изотонического раствора NаСl.

в. В первую пробирку (с обозначением 1:2) вводят три капли (0,15 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания ее содержимого переносят три капли в следующую и т.д. до последней пробирки, из которой три капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения испытуемой сыворотки от 1:2 до 1:1024.

г. Во все пробирки добавляют пастеровской пипеткой по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных резус - положительных эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4-5 резус-положительных лиц и приготовленных так же, как готовят стандартные эритроциты.

д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив помещают на 45 мин. в термостат при температуре +37°С.

е. После инкубации эритроциты отмывают и из них готовят 5% взвесь. Затем из каждой пробирки переносят одну каплю (0,05 мл) взвеси на белую пластинку и к каждой капле взвеси прибавляют одну каплю (0,05 мл) сыворотки для пробы Кумбса, которую смешивают с эритроцитами. Далее в течение пяти минут наблюдают результат при покачивании пластинки.

ж. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация (время наблюдения 5 мин), принимается за титр выявленных неполных резус-антител. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.

V. Исследование сыворотки на наличие неполных
резус-антител с применением желатина

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления эритроцитов берут не более, чем за 2-3 дня до исследования в количестве 3-5 мл в обычные пробирки без стабилизатора. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. При этом обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество эритроцитов, которые и применяют для исследования. Эритроциты берут со дна пробирки пастеровской пипеткой: если при этом захватывается небольшое количество собственной сыворотки, это не влияет на ход реакции.

Если эритроцитов, оставшихся свободными после свертывания крови, недостаточно, то допускается интенсивное встряхивание свертка для отделения дополнительного количества эритроцитов.

Можно брать кровь с цитратом натрия. В этом случае эритроциты необходимо отмыть изотоническим раствором NаСl.

Для установления титра антител эритроциты готовят ех tempore. В пробирку к одной части эритроцитов добавляют 9 частей 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. При этом получается 10% взвесь эритроцитов в желатине.

2.Техника исследования

а. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

б. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.

в. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. (Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойства застудневать при температуре 4-8°С желатин не пригоден).

г. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 мин.

д. В пробирки по извлечении из водяной бани наливают 5-8 мл изотонического раствора NаСl. Содержимое пробирок перемешивают путем одно - двукратного перевертывания их и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

3. Трактовка результата

Результат реакции просматривают на свет.

Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.

Для этого каплю содержимого пробирки помещают с помощью стеклянной палочки на предметное стекло и просматривают под малым увеличением.

Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в испытуемой сыворотке неполных резус - антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус-антитела анти-D, С, Е, а также с и е - не выявлены.

Определение специфичности выявленных антител см. п.IХ.

4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела

а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.

б. Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl.

в. В первую пробирку этой же пипеткой вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания две капли переносят во вторую, из второй - в третью, из третьей - в четвертую и так до последней пробирки, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения сывороток от 1:2 до 1:1024.

г. Во все пробирки добавляют по две капли стандартных резус - положительных эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4-5 резус-положительных лиц и приготовленных, как сказано ниже в виде 10% взвеси в желатине.

д. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при температуре +46-48°С на 10 мин. или в суховоздушный термостат на 30 мин.

е. По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по 5-8 мл изотонического раствора NаСl и наблюдают результат. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимается за титр выявленных неполных резус-антител.

Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжать разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.

VI. Исследование сыворотки на наличие неполных антител с применением
полиглюкина (в пробирках без подогрева)

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления эритроцитов берут не более чем за 2-3 дня до исследования в обычные пробирки. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Может быть использована любая кровь: непосредственно взятая из пальца, эритроциты из осадка в пробирке после образования свертка и консервированная, отмытая изотоническим раствором NаСl.

2. Техника исследования

а. В штатив устанавливают пробирки вместимостью 8-10 мл, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

б. Во все пробирки вводят по две капли исследуемой сыворотки.

в. Согласно нумерации в пробирки вводят по одной капле стандартных эритроцитов.

г. Во все пробирки вводят по одной капле 33% раствора полиглюкина.

д. Пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого, затем наклоняют почти до горизонтального положения и медленно поворачивают по горизонтальной оси так, чтобы содержимое растекалось по их стенкам. Контакт эритроцитов с исследуемой сывороткой при поворачивании пробирок продолжают три минуты.

е. Через 3-5 мин в пробирки наливают 3-4 мл изотонического раствора NаСl, осторожно перемешивают содержимое путем 2-3-кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать!) и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

3. Трактовка результатов

Результаты просматривают на свет невооруженным глазом.

Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в исследуемой сыворотке резус-антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные антитела анти-D, С, Е, а также с и е не выявлены.

Определение специфичности антител см.п.IХ.

VII. Исследование сыворотки на наличие полных антител
в реакции агглютинации в солевой среде

1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов

Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут в количестве 1-2 мл (и более, смотря по потребности) в пробирки вместимостью 8-10 мл, содержащие изотонический раствор лимонно-кислого натрия (из расчета 0,25 мл на 1 мл крови). Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию и инициалы лица, от которого взята кровь.

После взятия крови в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, затем содержимое их перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды.

Можно брать кровь и без стабилизатора. В этом случае после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как сказано выше.

Из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь в других пробирках, взятых по числу образцов стандартных эритроцитов и так же пронумерованных.

Для приготовления 2% взвеси в эти пробирки капают по 2,5 мл (49 капель) изотонического раствора NаСl и в каждую пробирку в соответствии с ее нумерацией переносят одну каплю эритроцитов. Содержимое пробирок перемешивают для получения равномерной 2% взвеси эритроцитов, которая применяется для исследования сыворотки.

2. Техника исследования

а. В штатив устанавливают ряд маленьких пробирок (высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см, с гладким дном округлой формы) по числу образцов эритроцитов, с которыми испытывается сыворотка. Предварительно штатив покрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пробирки на бумаге пишут порядковый номер, а также фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь.

Вместо пробирок можно использовать планшеты для иммунологических реакций с лунками, имеющими закругленное дно.

б. Во все пробирки (лунки планшета) вводят по одной капле (0,05 мл) испытуемой сыворотки и по одной капле изотонического раствора NаСl.

Штатив с пробирками (планшет) встряхивают для перемешивания их содержимого.

в. В пробирки (лунки), согласно их нумерации и обозначению, вводят по одной (0,05 мл) капле 2% взвеси эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.

г. Содержимое снова перемешивают и штатив (планшет) помещают для инкубации в термостат при +37°С на один час и затем оставляют на столе при комнатной температуре на 2-3 часа.

д. После инкубации штатив с пробирками (планшет) вынимают и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

3. Трактовка результата

Результат реакции учитывают при помощи лупы с 6-8-кратным увеличением по форме осадка эритроцитов на дне пробирки (лунки) (см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности крови методом агглютинации в солевой среде").

Наличие агглютинации с резус-положительными образцами эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывают на присутствие в сыворотке полных резус-антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что полные резус антитела анти-D, С, Е, а также с и е не выявлены.

Определение специфичности см. п.IХ.

4. Титрование сыворотки, содержащей полные резус-антитела

а. В штатив устанавливают 10 маленьких пробирок для разведения сывороток 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024. Можно использовать планшет для иммунологических реакций.

б. Во все пробирки (лунки) капают по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl.

в. В первую пробирку (лунку) (с обозначением 1:2) вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. После перемешивания из первой пробирки (лунки) переносят две капли во вторую, из второй - в третью и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1: 1024.

г. В каждую пробирку (лунку) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси стандартных эритроцитов или смеси, приготовленной от 4-5 резус-положительных лиц. Эритроциты для взвеси готовят, как сказано выше.

д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив (планшет) помещают в термостат при температуре +37°С на один час.

е. После инкубации штатив (планшет) вынимают из термостата и наблюдают результат.

Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимают за титр выявленных полных резус-антител.

Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В таких случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.

VIII. Феномен зоны

При очень высокой степени иммунизации организма образующиеся резус-антитела иногда дают феномен зоны. Этот феномен заключается в том, что сыворотка крови таких лиц, будучи взята неразведенной или в небольшом разведении (1:2), может не дать или дать слабую положительную реакцию при ее испытании с резус-положительными эритроцитами. Однако, если такую сыворотку развести, то при некотором разведении (чаще всего 1:8, 1:16, иногда и более) резус-антитела в ней становятся активными и дают хорошо выраженную положительную реакцию. Реже всего феномен зоны бывает выражен в методе конглютинации с желатином или при испытании сыворотки непрямой пробой Кумбса. Поэтому, а также ввиду большей ее чувствительности, проба Кумбса является очень ценной реакцией для выявления неполных резус-антител.

Если все методы, включая непрямую пробу Кумбса, не выявляют в сыворотке резус-антител, а в анамнезе у лица, кровь которого испытывается, есть указания на сенсибилизацию к резус - антигену, то для исключения феномена зоны следует испытать эту сыворотку, взятую в разведениях. Для этого сыворотка разводится и испытывается, как указано для каждого метода в разделах "Титрование сыворотки".

Если при наблюдении результата в каких-либо разведениях сыворотки отмечается положительная реакция, следовательно, в испытуемой сыворотке есть антитела. В этих случаях для дальнейшего исследования сыворотки ее следует развести, при этом выбрать то разведение, в котором наблюдалась наиболее выраженная положительная реакция. В качестве разводителя при исследовании применяют изотонический раствор NаСl. Исследование разведенной сыворотки проводится как описано выше для каждого метода. При установлении высоты титра учитывается общее разведение нативной сыворотки, начиная с 1:2.

IХ. Специфичность антител

Сыворотки, давшие положительный результат со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, могут содержать как "чистые" антитела анти-D, так и одновременно антитела к нескольким антигенам: анти-С+D, анти-D+Е или анти-С+D+Е.

В некоторых случаях исследуемые сыворотки, содержащие резус-антитела, могут вызвать агглютинацию избирательно - не всех образцов резус-положительных эритроцитов. Это может быть связано с тем, что в испытуемой сыворотке имеются антитела не анти-D (наиболее часто встречающиеся, а анти-С или анти-Е).

Положительный результат может также наблюдаться и с резус-отрицательными эритроцитами за счет других антигенов системы резус - с, е или антигенов других систем.

Для выяснения специфичности резус-антител необходимо специальное исследование сыворотки с набором стандартных эритроцитов, включающих редкие группы ссDее, Сcddeе, ссddЕе, а также резус-отрицательные образцы (сcddeе), включающие как содержащие, так и не содержащие антигены Келл (К) и Даффи (Fу). С ними же проводится и титрование сыворотки.

Х. Общее заключение

1. Заключение о наличии в сыворотке резус-антител можно сделать при положительном результате, полученном любым методом исследования.

2. Заключение об отсутствии в сыворотке резус-антител можно сделать только при отрицательном результате, полученном при исследовании не менее чем двумя методами, одним из которых является любой метод, выявляющий неполные резус - антитела, а другим - реакция агглютинации в солевой среде, выявляющая полные резус-антитела. При этом следует учитывать возможный феномен зоны.

"Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года N 05-14/30, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.

Начальник Управления организации медицинской помощи населению

А.И.Вялков