Приложение 1. Средства и методы санации

Приложение 1

Средства и методы санации

Препарат	Способ приготовления	Метод санации
Очищенный гексахлорофен Для приготовления 100 г При локализации носи- 2,2-диокси 3,5,6,3,56 1%- ной мази требуется тельства в носу 1% гексахлордифенил метан- вазелина медицинского гексахлорофеновой мазью бифепольное соединение. 99 г, очищенного с помощью ватного там- Гексахлорсфен - белый, гексахлорофена 1 г. От- пона смазывают передние мелкокристаллический вешенное количество гх отделы носовой полости порошок, с температурой небольшими порциями до- в течение 1 минуты, плавления 163-164 град, бавляют в вазелин при производя мягкий массаж молекулярный вес - постоянном помешивании крыльев носа для равно- 406,9. Препарат хорошо (20 -30 минут) до полу- мерного распределения растворим в органи- чения однородной мази (количество мази ческих растворителях, массы. Готовую мазь на одну обработку около 70 град. спирте, в воде фасуют в соответствую- 1 г). Такую обработку не растворим, нейтрали- щую тару. Хранят мазь в проводят 1 раз в сут- зуется растворами, име- банках из темного стек- ки в течение 5-6 ющими щелочное значение ла или в защищенном от дней.(при ежедневной рН выше 8,0. света месте. работе персонала.) У Гексахлорофен (гх) об- дежурящих в течение су- ладает высоким бактери- ток - 3 раза в сутки в цидным действием в от- течение трех очередных ношении вегетативных дежурств с перерывом форм микроорганизмов и между ними не более грибов. Гексахлорофен 3-ех дней (всего прово- стойкий при хранении дят 9 обработок). препарат. Его хранят в Персонал, работающий 12 сухом и прохладном часов в смену санируют месте. Гх относится к двухкратно: в начале и высокотоксичным вещест- конце работы смены. Об- вам, при введении в же- работку проводят в те- лудок 50% животных по- чение четырех дежурств гибает от дозы 150 с промежутками не более мг/кг веса. Он хорошо двух дней (всего прово- всасывается через не- дят 8 обработок). поврежденную и повреж- Кратность обработок 1 денную кожу. Раздражаю- цикл в квартал. щие свойства чистого гх выражены умеренно и в рекомендуемых концент- рациях практически не проявляются. Гх явля- ется слабым аллергеном, При длительном постоян- ном применении без соответствующих мер предосторожности он мо- жет накапливаться в ор- ганизме, поэтому его используют строго по назначению врача. Для санации слизистой носа применяют 1% мазь их на вазелиновой основе. 2. Трибромсалициланилид (Трибаск). Зарубежные Для приготовления 100 г Мазь закладывают в нос названия: диафан, 3%-ной мази требуется дважды в день в течение бромсаииан, темасепт. вазелина медицинского 5-6 дней. Трибаск обладает широ- 97 г, трибаска - 3 г. ким спектром антимик- Отвешенное количество робного действия в от- трибаска тщательно ношении золотистого растирают в вазелине. стафилококка, бактери- остатическая концентра- ция 6,32 мкг/мл, бакте- рицидная -1,6 мкг/мд, в отношении крошечной па- лочки - бактерицидная и бактериостатическая концентрация - 40 мкг/мл. Препарат устой- чивая при длительном хранении и автоклавиро- вании. Трибаск (3,41,5 - трибромсалициланилид) обладает высокой актив- ностью в отношении ста- филококков, устойчивых к широко применяемым антибиотикам, а также значительным фунгицид- ным эффектом. Санацию стафилококковых носите- лей среди медперсонала и больных проводят 3% мазью. Трибаск на вазе- линовой основе. Не от- мечено побочных явле- ний. Мазь не вызывает неприятных ощущений и раздражений слизистой носа 3. Хлорофиллипт. Представляет собой Готовят 2%-ный масляный При локализации носи- сложное органическое раствор. тельства в носу, зака- соединение, в состав пывают 2%-ный масляный которого входит хлоро- раствор хлорфиллипта филл "а" и хлорофилл трижды в день в течение "в". Это порошок ярко- 6-7 дней. Для санации зеленого цвета, горько- зева используют 1% ватого вкуса, не раст- спиртовый раствор хлор- ворим в воде, растворим филлипта (20-30 мл пре- в органических раство- парата на 100 мл воды). рателях. В медицинской Полоскание зева прово- практике препарат дят 3 раза в день в те- используется в виде чение 6-7 дней. спиртового и масляного растворов. Спиртовой раствор представляет собой прозрачную и жид- кость яркозеленого цве- та,образующего с водой флуоресцирующий раст- вор, масляный раствор - густую жидкость яркозе- леного цвета. Хф обла- дает антибактериальной (бактериостатической и бактерицидной) актив- ностью в отношении ан- тибиотикоустойчивых стафилококков. Хф при- меняют при лечении за- болеваний, вызванных антибиотикоустойчивыми стафилококками и при санации стафилококковых носителей. При примене- нии препарата возможно появление аллергических реакицй. Препарат вы- пускается в виде 1% и 0,25% спиртового раст- вора и 2% масляного раствора. Препарат хра- нится в стеклянной гер- метической и закрытой посуде, в сухом, прох- ладном и защищенном от света месте 4. Лизоцим Антибиотическое вещест- во ферментного характе- ра находится в слезах, Готовят следующим обра- При локализации носи- мокроте слюне, сыворот- зом: предварительно це- тельства в носу прово- ке, лейкоцитах, костном лые яйца протирают дят обработку передних мозгу, хрящах, сердце, спиртом (скорлупа). За- отделов носа 1% лизо- печени, легких, почках тем яичные белки отде- цимной мазью или зака- и т.д. Лизоцим обладает ляют от желтков и поме- пывают 0,1% лизоцима по бактериостатической де- щают в мерный стакан. 2-4 капли в каждую ноз- йствием не только в от- Белки разводят 0,5%-ным дрю. Санацию проводят ношении сапрофитов, но стерильным физиологи- ежедневно в течение 6 и ряда патогенных мик- ческим раствором в 2 суток по 3 раза в день. робов (стафилококки, раза, взбалтывают, раз- Полоскание зева 0,1% стрептококк, гонококк, водят, а затем в 15 раствором кристалли- менингококк, палочки раз. Побученную смесь ческого или жидкого ли- сибирской язвы, холер- подкисляют 1% (или 5%) зоцима. ный вибрион, брюшноти- лимонной кислотой до рН фозная палочка и 4,4-4,6, доводят до ки- т.д.д). пячения и кипятят 5 ми- нут (обязательно бесп- рерывно помешивая). Го- рячей смеси дают остыть. Охлажденную смесь нейтрализуют СаСО3 (мелом) до рН 7,0-7,2. Дают мелу осесть. Лизоцим содержится в надосадоч- ной жидкости. Надоса- дочную жидкость отфиль- тровывают дважды до по- лучения прозрачной жид- кости, разливают в сте- рильные флаконы и зак- рывают. Лизоцим хра- нится при Т + 4 град.С не более 5 дней. 5. Стафилококковый бак- Для санации носа дважды териофаг (выпускается в день на 15-20 минут Горьковским н-и ин-том закладывают ватные там- эпидемиологии) поны, обильно смоченные стафилококковым бакте- риофагом. Для санации зева проводят полоска- ние 3 раза в день в те- чение 6-7 дней. 6. Эурациллин Эурациллин, желтый или Для приготовления вод- Ежедневно 1 раз в сутки зеленовато-желтый мел- ного раствора: 1 часть полоскание зева и про- кокристаллический поро- фурациллина растворяют тирание тампоном сли- шок без запаха, горько- в 5000 частях изотони- зистых переднего отдела го вкуса, очень мало ческого раствора хлори- носа в течение 6-7 растворим в воде да натрия или дистилли- дней. (1:4200), мало- в спир- рованной воды. Для те, растворим в щело- ускорения растворения чах. Представляет анти- рекомендуют применение бакте- кипящей воды или риальное средство, горячей. При хранении действующее на ряд растворы фурациллина грамположительных и могут приобретать бурую грамотрицательных мик- окраску. Изменение цве- робов: стафилококки, та препарата и раство- стрептококки, дезинте- ров не изменяет их ак- рийную и кишечную па- тивности. лочку, палочку парати- фа, возбудителя газовой гангрены и др. В кон- центрации 1:9000 - 15:4200 оказывает бак- терицидное действие. Резистентность мироор- ганимов к препарату развивается медленно. Не раздражает тканей. 7. Риванол. Желтый кристаллический Готовят 1:5000 раство- Ежедневно 1 раз в сутки порошок горького вкуса, ры полоскание зева и про- без запаха. Малораство- тирание тампоном сли- рим в холодной воде зистых передних отделов (1:50), легче в горя- носа в течение 6-7 чей, мало растворим в дней. спирте (1:110). Водные растворы настойки, осо- бенно на свету стано- вятся бурыми. Пользо- ваться следует свежеп- риготовленными раство- рами. Оказывает проти- вомикробное действие, главным образом при ин- фекциях, вызванных кок- ками особенно стрептококками Препарат мало токсичен, не вызывает раздражения тканей. Применяют как наружное профилактическое и ле- чебное антисептическое средство в отолоринго- логии. При воспалении слизистой оболочки рта, зева, носа назна- чают полоскание 0,1% раствором. 8. Борная кислота. Бесцветные блестящие Готовят 1% водные раст- Ежедневно 1 раз в сутки слегка жирные на ощупь воры. полоскание зева и про- чешуйки или белый мел- тирание тампоном перед- кокристаллический поро- них отделов носа в те- шок без запаха. Раство- чение 6-7 дней. рима в холодной воде (1:25) и легко (1:4) в кипящей воде, раствори- ма (1:25) в спирте. Водные растворы имеют слабокислую реакцию. Применяют наружно как асептическое средство в виде водных растворов (2-4%) для полоскания полости рта, зева и для промывания глаз. 9. Раствор Люголя Раствор йода в водном растворе йодида калия Готовят из расчета: 1 Ежедневно 1 раз в сутки Состав: йода 1 часть, чайная ложка на 200 мл полоскание. калия йодидд воды. 2 части, воды 17 частей. 10. Люголь в глицерине. Применяют раствор Люго- Готовят из расчета: Смазывать зев 1 раз в ля наружно,главным об- йода - 1 часть, калия сутки в течение 6-7 разом для смазывания йодида - 2 части, гли- дней. слизистой оболочки церина - 94 части, воды глотки, гортани. - 3 части. 11. Калий марганцево- кислый. Темно или красно-фиоле- Готовят 0,01% растворы Ежедневно 1 раз в сутки товые кристаллы или на воде. (раствор розо- полоскание в течение мелкий порошок с метал- вокрасного цвета). 6-7 дней. лическим блеском. Раст- ворим в воде (1:18 в холодной и 1:3,5 в ки- пящей). Образует раст- вор темно-пурпурного цвета. При взаимо- действии с органически- ми (уголь,сахар,танин) и легко окисляющимися веществами может прои- зойти взрыв. Является сильным окислителем. Применяют как антисеп- тическое средство на- ружно в водных раство- рах для промывания ран (0,1-0,5%), для по- лоскания рта и горла (0,01-0,1%). 12. Настой листьев эв- калипта. Высушенные листья куль- Отвар готовят следующим Ежедневно 1 раз в сутки тивируемых деревьев эв- образом 10г листьев за- полоскание. калипта содержат эфир- ливают стаканом холод- ное масло (не менее ной воды и кипятят на 2,5% в цельных листьях слабом огне в течение 15 и 1,5% в резаных минут, остужают и про- листьях), сложные эфи- цеживают. Для полоска- ры, органические кисло- ний и ингаляций берут 1 ты, дубильные и др. ве- столовую ложку на ста- щества. Отвар и настой кан воды. эвкалипта применяют в качестве асептических средств для полоскания верхних дыхательных пу- тей. Является слабым аллергеном.

Методики постановки реакций, характеризующих принадлежность
выделенного штамма стафилококка к виду золотистого стафилококка

I. Определение плазмокоагулирующей активности

Для реакции может быть использована свежеприготовленная или сухая цитратная плазма крови кролика *. Человеческая плазма менее пригодна для постановки реакции. В ней могут содержаться лекарственные препараты, консерванты, антитела, препятствующие выделению стафилококковой коагулазы.

Для приготовления цитратной кроличьей плазмы у кролика берут из сердца 8,0 мл крови и вносят ее в пробирку с 2,0 мл стерильного 5% лимонно-кислого натрия (предварительно лимонно-кислым натрием смачивают внутренние стенки пробирки). Смесь перемешивают вращением пробирки и ставят в холодильник. После полного осаждения форменных элементов крови, плазма отсасывается в стерильную пробирку и пригодна для постановки реакций в течение 1 - 1,5 недель при условии ее хранения в холодильнике при +4 град.С.

При использовании сухой плазмы, годными к употреблению являются только те ампулы, целость которых не нарушена. В каждой ампуле содержится 1 мл высушенной кроличьей плазмы. Перед употреблением ампулу вскрывают и добавляют 1 мл стерильного физиологического раствора для растворения содержимого ампулы. Растворение сухой плазмы происходит медленно и требует осторожного помешивания пастеровской пипеткой.

Для реакции применяют плазму в разведении 1:5 в количестве 0,5 мл (на 1 мл плазмы добавляют 4 мл стерильного физиологического раствора).

Разведенную плазму разливают в стерильные пробирки (без пробок) по 0,5 мл и в каждую вносят по одной петле 18-20 часовой агаровой культуры стафилококка (или к 0,5 мл плазмы добавляют 0,5 мл 18 часовой бульонной культуры стафилококка).

Контроль реакции ставится с заведомо коагулазоположительной и коагулазоотрицательной культурой. Кроме того, для исключения самопроизвольного свертывания плазмы необходимо также ставить контроль незасеянной плазмы. Пробирки помещают в термостат при 37 град.С и проверяют наличие свертывания плазмы через 3 часа, затем пробирки вынимают, оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов. Окончательный учет реакции проводится на следующий день.

Оставлять реакцию в термостате более 3 часов не рекомендуется, поскольку при длительной инкубации в термостате может наступить разжижение образовавшегося сгустка за счет действия фибринолизина. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы - от небольшого сгустка, взвешенного в плазме, до полного неподвижного сгустка. Реакция в контроле должна бить выражена четко: наличие сгустка с культурой золотистого стафилококка и отсутствие его в 2 других пробирках.

РКП может быть поставлена в ускоренной модификации, предложенной Ульянищевой Л.Н. и Кучуриным А.В., которая сводится к следующему: сразу же после обвивки с чашки на скошенный агар колоний подозрительных на стафилококк, в пробирку добавляется 0,5 мл плазмы в разведении 1:5. Плазму следует добавлять стерильно, внося ее по стенке противоположной скошенному агару. Пробирки помещают в термостат при 37 град.С на 18-20 часов,после чего производят учет реакции. Верхняя часть скошенного агара с выросшей культурой может быть использована в дальнейшем для определения других свойств выделенного штамма. Для постановки реакции не рекомендуется использовать свежеприготовленный скошенный агар, который имеет конденсат, дающий дополнительное разведение плазмы.

Если культура обладает плазмокоагулирующей активностью, то в пробирке образуется сгусток плазмы. Отсутствие сгустка свидетельствует об отрицательной реакции плазмокоагуляции. К каждому опыту необходимо ставить контроли, как отмечено выше. Опыты, давшие сомнительный результат в контроле, подлежат повторению. Постановка РНП в ускоренной модификации позволяет на сутки раньше получить ответ о принадлежности выделенного штамма к тому или иному виду стафилококка.

II. Определение ДНК-азной активности

Для постановки реакции используется 2% агар на переваре Хоттингера или приготовленный из сухого питательного агара (рН 8,6). Агар разливают во флаконы по 150,0 мл. По мере надобности агар растапливают и в него добавляется ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) из расчета 2 мг на 1 мл среды. Во флакон, содержащий 150,0 мл среды, следует добавить 300,0 мг ДНК. Предварительно ДНК растворяют в дистиллированной воде, подщелоченной IN NaOH. Растворение ДНК в воде без добавления щелочи происходит не полностью. Агар с добавленной ДНК стерилизуют текучим паром в течение 30 минут. Стерильная среда может храниться в холодильнике в течение 1,5-2 месяцев. Перед разливом чашек агар растапливают, добавляют хлористый кальций из расчета 0,8 мг на 1 мл среды.(на 150,0 мл среды следует добавить 1,2 мл продажного стерильного 10% хлористого кальция). На хорошо подсушенную чашку засевают полоской от 10 до 20 культур стафилококка. Чашки помещают в термостат при 37 град.С 18-20 часов, после чего их заливают 5,0-7,0 мл IN НСl. Учет реакции: проводится после 7-10 минутного контакта кислоты со средой, которая перед учетом реакции сливается.

Соляная кислота, реагируя с ДНК, содержащейся в среде, образует непрозрачный белый преципитат. Если исследуемый штамм выделяет в среду ДНК-азу, то последняя деполимеризует ДНК. Вследствие этого при обработке соляной кислотой вокруг таких культур образуется прозрачная зона, содержащая продукты расщепления ДНК, которые не осаждаются соляной кислотой. Хотя ширина прозрачных зон вокруг засеянных колоний может быть различной, чашечный метод определения ДНК-азной активности, является качественным тестом. При оценке реакции на ДНК-азу возможны следующие варианты:

1. Наличие четкой зоны просветления среды - положительная реакция.

2. Полное отсутствие зоны просветления среды- отрицательная реакция.

3. Наличие нечеткой, небольшой зоны просветления среды - сомнительная реакция. В данном случае реакцию необходимо повторить.

Определение ДНК-азной активности можно проводить не только у суточных культур, но без предварительного пересева их после 7-10 дневного хранения в холодильнике.

В настоящее время показана принципиальная возможность использования для определения ДНК-азной активности не только высокополимерной ДНК, но и натриевой ее соли, получаемой из селезенки рогатого скота, производства Олайнского завода химических реактивов Латвийской ССР.

С целью сокращения расхода ДНК, рекомендуется использовать двухслойный метод определения ДНК-азной активности, предложенный А.А.Трояшкиным. Сущность этого метода заключается в том, что ДНК вносится лишь в верхний слой среды, налитый в чашку Петри. Методика постановки реакции:

1. К 100 мг натриевой соли ДНК добавляют 10 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 0,2 N раствора NaOН и осторожно встряхивают. Пробирку оставляют при комнатной температуре или в термостате до следующего дня. Для ускорения растворения ДНК пробирку можно поместить в кипящую водяную баню. Готовый раствор ДНК имеет вид и консистенцию нативного яичного белка (рабочий раствор ДНК).

2. В расплавленный 2% агар (рН 7,2-7,4), разлитый в пробирки по 10,0 мл добавляют по 1 мл рабочего раствора ДНК и 0,1 мл продажного стерильного 10% раствора хлористого кальция. Смесь тщательно перемешивают и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 20 минут, или дробно - три дня подряд по 20 минут в кипящей водяной бане. Агар с ДНК можно хранить 1,5-2 месяца в холодильнике, не допуская высыхания.

3. Чашки с 2% питательным агаром следует хорошо подсушить. Столбик агара с ДНК растапливают в водяной бане и выливают равномерно вторым слоем на агар и ставят на ровную поверхность. После застывания второго слоя чашки снова подсушивают. Посев испытуемых культур, режим термостатирования и учет результатов проводятся, как описано выше.

Наличие ДНК-азной активности является простым, удобным и весьма специфическим тестом дифференциации золотистого стафилококка и эпидермального стафилококка. ДНК-азная активность обнаруживается у 97-98% штаммов золотистого стафилококка.

III. Определение ферментации маннита в анаэробных условиях

Для реакции можно использовать среду, приготовленную из сухого агара с индикатором ВР, содержащую маннит (пропись см. ниже). Среду разливают в пробирки по 4,0 мл и стерилизуют. По мере надобности пробирки со средой регенерируют и добавляют по 2,0 мл стерильного вазелинового масла. Когда среда остынет, уколом (до дна) производят посев испытуемой культуры. Пробирки помещают в термостат при 37 град.С на 5 суток. В случае разложения маннита среда приобретает синий цвет по всему столбику агара.

Способность разлагать маннит в аэробных условиях обнаруживается у 94-96% штаммов золотистого стафилококка.

IV. Определение лецитовителлазной активности

При использовании для первичного посева среды, содержащей желток, специального дополнительного определения лецитовителлазной активности у стафилококка проводить нет необходимости. В случае выделения культуры с других сред в необходимости определения у нее этого признака, следует на чашку с ЖСА посеять испытуемую культуру штрихом или бляшкой. Чашки инкубируют в термостате при 37 град.С в течение 18-20 часов. При положительном результате вокруг колоний стафилококка образуется радужный венчик, что обусловлено выделением фермента лецитовителлазы и разложением лецитина, находящегося в среде. Реакцию следует учитывать в отраженном свете. Лецитовителлазной активностью обладает 60-75% штаммов золотистого стафилококка человеческого происхождения и 5-10% штаммов стафилококка животного происхождения.

V. Определение пигментообразования

Пигмент колоний стафилококка может варьировать от ярко-золотистого, к желтому, кремовому до белого. Пигментообразование лучше проявляется на свету, при посеве культур на агар, содержащий 10% снятого молока.

Следует отметить, что золотистый пигмент образуют не только золотистый стафилококк; колонии некоторых эпидермальных стафилококков и микрококков могут иметь аналогичную окраску. В то же время золотистые стафилококки могут вырастать на агаре в виде белых колоний.

VI. Определение гемолитической активности

В настоящее время показано, что 60-70% эпидермальных стафилококков на кровяном агаре образуют четкие зоны гемолиза. Поэтому определение гемолитической активности штамма не может служить четким дифференциально-диагностическим тестом для золотистого стафилококка и эпидермального стафилококка. В случае, если имеется необходимость определения альфа-гемолитической активности у выделенных штаммов необходимо использовать 3-5% кровяной агар, содержащий эритроциты кролика, т.к. альфа-гемолизин стафилококка не лизирует эритроциты других животных и слабо лизирует эритроциты человека. Гемолитическая активность стафилококков животного происхождения может быть определена на 3-5% кровяном агаре, содержащем эритроциты барана. Чашки с исследуемыми культурами выдерживают 24 часа в термостате при 37 град.С, и 24 часа в холодильнике при +4 град.С.

VII. Определение фаготипа золотистого стафилококка

Методика фаготипирования стафилококков подробно изложена в наставлении по применению типовых стафилококковых бактериофагов, прилагаемых к Международному набору, выпускаемому ИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.

Фаготипированию должны подвергаться только золотистые стафилококки. При этом следует руководствоваться следующими правилами: золотистые стафилококки выделенные из верхних дыхательных путей у персонала родильных домов, должны подвергаться фаготипированию в обязательном порядке. Золотистые стафилококки, выделенные от больных, подвергаются фаготипированию по эпидемическим показаниям.

Для фаготипирования используются Международный набор из 22 умеренных фагов, которые разделены на 4 группы:

I группа - фаги 29, 52, 52А, 79, 80.

II группа - фаги 3А, 84, 3С, 55, 71.

III группа - фаги 6, 85, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А.

IV группа - фаги 42Д,

Вне групп - фаги 81, 187.

При проведении фаготипирования необходимо руководствоваться следующим:

1. Первым этапом фаготипирования является приготовление соответствующих разведений фaга. К каждой ампуле с высушенным фагом добавляют по 1,0 мл щелочного бульона Хоттингера, Мартена, мясопептонного бульона (рН 7,6). Поскольку фаги высушиваются в объеме

                                                              -3

0,1 мл, при добавлении 1,0 мл бульона  получают  разведение 10   Если  на

                                                           -3

этикетке ампулы указанное тест-разведение соответствует 10      (1:1000),

то для получения разведения фага, равного 100ТР, в данную ампулу необходимо добавить 1,0 мл бульона. Полученное разведение фага 1:10 будет соответствовать 100ТР. Если на этикетке ампулы указанное

                                       -3

тест-разведение  фага  соответствует 10   (1:10000),  то  для   получения

разведения фага, равного  100ТР,  в  данную  ампулу  необходимо  добавить

1,0 мл бульона, и полученное разведение фага 1:10 развести еще в 10  раз.

С этой целью к           0,1 мл разведения 1:10 добавляют 0,9 мл бульона.

Полученное разведение соответствует 100ТР.

Фаготипирование рекомендуется начинать дозой фага 100ТР. Фаги в разведении 100ТР могут храниться в холодильнике при +4 град.С в течение 1,5-2 месяцев. Для предохранения высыхания пробирку с фагом следует закрывать стерильной резиновой пробной.

При приготовлении разведения фага для ампулы берут отдельную пипетку. После добавления бульона фаг быстро растворяется в ампуле и его переносят этой же пипеткой в стерильную пробирку. На последней подписывают столбиком порядковый номер фага, его название (тип), конечное разведение и тест-разведение:

 Например:      1                  или              19

                29                                  83А

                   -3                                  -4

                10                                  10

                100ТР                               100ТР

Для фаготипирования можно использовать не только 3-4 часовую, но и 18-20 часовую бульонную культуру.

3. Для приготовления среды использовать как 1,2% агар, приготовленный на бульоне Хоттингера, так и сухой питательный агар или агар Д (рН 7,6), с добавлением 0,4% глюкозы. Непосредственно перед разливом чашек в агар добавляют 0,2 мл стерильного продажного 10% раствора хлористого кальция на 100 мл среды. Чашки подсушивают в термостате.

4. На подсушенные среды наносят бульонную культуру и засевают ее газоном, избыток культуры отсасывают пипеткой. Чашки с посевом вновь подсушивают. Поскольку на среду наносится массивный газон культуры, воздушное загрязнение среды не может при этом играть существенной роли. Для удобства работы можно закрывать чашки картонными крышками.

5. Дно подсушенных чашек со средой расчерчивают на 22 квадрата или на поверхности агара агглютинационной пробиркой делают 22 кружка-насечки. В каждый квадрат или кружок оттянутой до капилляра пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего фага всегда в одном и том же порядке. Наносить фаг следует таким образом, чтобы не коснуться пипеткой поверхности среды и избежать тем самым переноса культуры на другую чашку со средой или пробирку с типовым фагом. Набирать в пипетку фаг следует над пламенем горелки.

Если количество исследуемых культур невелико, фаг можно наносить не пипеткой, а петлей, каждый раз прожигая ее.

Более удобно наносить фаг репликатором. В этом случае на хорошо подсушенную чашку наносят сначала фаг, вновь подсушивают, после чего наносят газоном исследуемую бульонную культуру. Избыток культуры удаляют пипеткой, чашки подсушивают, закрывают крышкой, переворачивают и помещают в термостат. Инкубируют при 37 град.С в течение 18-20 часов, либо 5-6 часов при 37 град.С и до следующего утра при комнатной температуре.

6. При учете результатов фаготипирования отмечают наличие лизиса тем или иным фагом на ++++, +++ и ++ креста. При учете отмечают ++++ - сливной (полный) лизис.

+++ - полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса)

++ - наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний фага.

+ - почти полное отсутствие лизиса.

- - полное отсутствие лизиса.

Некоторые фаги вызывают как бы утончение роста культуры в месте нанесения фага, т.е. феномен ингибиции (подавление), обозначаемое "О". Ингибиция относится к слабой реакции, но ее наличие должно обязательно отмечаться в рабочем журнале.

Штамм считается типируемым, если хотя бы один фаг вызвал сильную реакцию на ++++, +++ или ++ креста. Стафилококковые штаммы чаще лизируются не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную фагомозаику. Результаты фаготипирования регистрируются в журнале, с указанием дозы фага, вызвавшей лизис и степени лизиса.

Например: 100ТР - ЗС++++/55+++/71++++.

В ответе степень лизиса не обозначается, указывается только фагомозаика данного штамма - 3С/55/71.

При определении идентичности штаммов следует ориентироваться на следующее: если культуры стафилококков, типированные в один и тот же день, дают фагомозаику не различающуюся или различающуюся на одну сильную реакцию, то их следует считать идентичными. Если культуры стафилококка, типированные в один и тот же день, обнаруживают разницу на 2 и более сильные реакции, штаммы следует признать разными. Однако этот результат является ориентировочным и в каждом отдельном случае при решении вопроса об идентичности выделенных культур следует уточнить место их выделения, характеристику патогенных свойств, отношение к антибиотикам, эпидемическую ситуацию. Следует отметить, что внутри одной группы идентичные штаммы могут иметь различие более, чем в одну сильную реакцию.

В настоящее время примерно 30-40% выделенных культур золотистого стафилококка не чувствительны к используемым типовым фагам (так называемые нетипируемые штаммы золотистого стафилококка). Идентичность таких штаммов может быть установлена весьма ориентировочно на основании антибиограммы.

VIII. Определение фосфатазной активности

В 100 мл растительного и остуженного до 40 питательного агара добавляют 50 мг паранитрофенилфосфата. Смесь разливается стерильно в чашки (по 10-12 мл на чашку). Чашки с застывшим агаром подслушивают и на каждую из них точечным посевом наносятся исследуемые культуры (16-20 культур). Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37 град.С. Появление интенсивного желтого окрашивания вокруг посевов регистрируется как положительная реакция.

Обязательным является постановка контролей со штаммами стафилококка, заведомо обладающими и не обладающими фосфатазной активностью.

Реакция фогес-Проскауэра (в модификации Баррита).

Исследуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка. После 3 дней роста при 37 град.С 1,0 мл культуры переносят в пробирку и прибавляют 0,6 мл альфа-нафтола (5% раствор в абсолютном спирте) и 0,2 мл КОН (40% раствор) и взбалтывают. В положительном случае через 2-5 минут наступает розовое окрашивание. У штаммов, дающих сильную реакцию, окраска становится интенсивной и через 30 минут - 1 час переходит в малиновую. В отрицательных случаях розового окрашивания не наступает и раствор принимает цвет меди. (КОН + альфа-нафтол).