Приложение 9. Методика оценки иммунобиологической безопасности вакцин

1.1. Определение фагоцитарной активности макрофагов

Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от 3-5 мышей опытной и контрольной групп и помещают в среду 199, содержащую 5 ME гепарина в 1 мл, в пробирки, стоящие на льду. Не используют экссудаты, содержащие эритроциты. После осаждения (150 g, 10 мин) клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота с антибиотиками (100 ед/мл). Концентрацию клеток доводят до 1,0-2,0х106 кл/мл и суспензию разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат при температуре (37+-2)°С с содержанием 5% СО2. Через 60 мин смывают неприлипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды и оставляют на 18-24 ч в термостате с 5-7% СО2 при температуре (37+-2)°С.

Клетки для исследования фагоцитоза можно получать также на половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5-2 мл КПЭ.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, дрожжеподобные грибы Candida albicans или лабораторный штамм Staphylococcus (N 9198) или любые другие микробные клетки.

Эритроциты барана (ЭБ) *(1) трижды отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия, осаждая на центрифуге при 800 g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ную взвесь ЭБ на среде 199.

Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре (90+-2)°С в течение 45-60 мин микроорганизмов отмывают путем центрифугирования не менее 3-х раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия, ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по стандарту оптической мутности. Взвесь разводят средой 199 до концентрации, соответствующей предварительно установленному соотношению (1,0-2,0(9) кл/мл).

В чашки Петри, содержащие КПЗ, наливают 1 мл свежей среды и вносят по 1 мл взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов. Через 30-60 мин чашки ополаскивают холодным раствором Хенкса, подсушивают и фиксируют 10 мин метанолом. Окрашивают азур-эозином по Романовскому-Гимзе.

Учет результатов. Просматривают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.

Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством частиц на один фагоцит.

1.2. Исследование селезенки

После забоя животных во время вскрытия проводят макроскопическое и микроскопическое изучение селезенки, оценивают степень ее кровенаполнения и отека, измеряют величину и массу органа.

1.3. Исследование клеточного состава и пролиферативной активности клеток селезенки

Из селезенки готовят взвесь клеток, 0,2 мл такой взвеси подвергают центрифугированию, осадок разводят в 0,2 мл цельной декомплементированной сыворотки крови, ресуспендируют, подвергают повторному центрифугированию и из осадков готовят мазок на предметном стекле, аналогично мазку крови. Далее мазок высушивают, фиксируют 10-15 мин в метаноле и окрашивают по методу Романовского-Гимза.

Морфологическое исследование проводят при увеличении 100х10 (масляная иммерсия), подсчитывая в 2000 клеток % клеток разных рядов кроветворения и среди них % делящихся клеток (митозов).

Кроме того, в селезенке оценивают состояние белой и красной пульпы: выраженность лимфоидных фолликулов, их величину, активность реактивных центров, а также Т- и В-зависимых зон, развитие гиперплазии последней, степень миэлоза пульпы селезенки, определяют характер восстановительных процессов.

1.4. Получение взвеси клеток селезенки

Мышей забивают с помощью хлороформа. Извлекают селезенку, взвешивают ее на торсионных весах, осторожным раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе готовят взвесь клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки. Полученную суспензию фильтруют через 2 слоя капроновой сетки.

0,5 мл взвеси спленоцитов отмывают 5 мл среды 199 путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g, надосадок удаляют, а осадок разводят средой 199 с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед/мл) до исходной концентрации. Необходимо подчеркнуть, что клетки селезенки каждой мыши следует использовать индивидуально, не создавая клеточных цулов. Для сравнения результатов следует использовать среднегрупповые величины.

Примечание. Для пересчета G на число оборотов, соответствующее данной центробежной силе, следует пользоваться формулой:

              Gx10(5)

     N = Sqrt -------, где

              (1,1-R)

N - число оборотов в мин;

R - радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-верографина с клетками, см;

G - центробежная сила.

1.5. Определение количества Т-клеток (цитотоксический тест)

Принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целость клеточной мембраны. Образовавшиеся отверстия в мембране лимфоцитов позволяют прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) проникнуть внутрь клетки и окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.

Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов мыши разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в лунке панели смешивают 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл) и 20 мкл комплемента кролика в разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл), 20 мкл комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (37+-2)°С 25-30 мин. В каждую пробирку или лунку добавляют по 100 мкл раствора трипанового синего *(2). Через 30-60 сек помещают взвесь из лунки в счетную камеру.

Учет результатов. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

                 % убитых клеток в опыте - % убитых клеток в контроле

     ЦТИ = 100 x ----------------------------------------------------

                       100 - % убитых клеток в контроле

Оценка результатов. ЦТИ указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции. Так, например, если при исследовании клеток селезенки ЦТИ составил 32%, можно заключить, что 32 % этих клеток составляют Т-лимфоциты.

1.6. Определение количества В-лимфоцитов (цитотоксический тест)

Общее количество всех В-клеток определяется в цитотоксическом тесте с коммерческой поликлональной специфической сывороткой против В-лимфоцитов мыши. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти-Т-сывороткой.

1.7. Определение гиперчувствительности немедленного типа:
феномен Овери у морских свинок

Феномен Овери - кожная анафилаксия, при которой происходит быстрое повышение проницаемости капилляров кожи под влиянием реакции антиген-антитело.

Опыты проводят на белобоких морских свинках массой 200-300 г.

Исследуемую вакцину вводят по следующей схеме. Сенсибилизирующие инъекции вакцины: первая подкожно, две последующие с интервалом в 1 сут. - внутримышечно в область бедра. Доза препарата, вводимого на одну инъекцию, равна дозе, предлагаемой для введения человеку. Разрешающую инъекцию проводят внутрикожно на 18-25 день после первой сенсибилизирующей инъекции. Для разрешающей инъекции вводят препарат в дозе, равной или превышающей в 5-10 раз однократную сенсибилизирующую дозу.

Контролем служат несенсибилизированные животные, получившие только разрешающую инъекцию вакцины.

Через 5-7 мин опытной и контрольной группе внутрисердечно или внутривенно вводят 0,5-1,0 мл 1%-ного водного раствора голубого Эванса.

Учет результатов. Через 20 мин в опытной группе, в случае развития анафилаксии от препарата, на месте введения разрешающей его дозы появляется синее пятно. У животных контрольной группы пятно не должно появляться.

2.1. Методы получения материалов для исследования иммунного статуса.

2.2. Методы выявления аллергизирующего действия вакцин, развития аутоиммунных реакций.

2.3. Изучение иммунного статуса.

     АФП = количество фагоцитирующих клеток в 1 мкл х ФЧ