Приложение 3. Методические указания по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов

Приложение 3

к приказу Минздрава РФ

от 23 декабря 1998 г. N 375

Методические указания
по микробиологической диагностике менингококковой инфекции
и бактериальных менингитов

1. Показания к лабораторному исследованию

ГАРАНТ:

См. также Методические указания МУК 4.2.1887-04 "Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.

Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных менингитов осуществляется бактериологическим методом путем выделения и идентификации возбудителя, серологическим путем выявления специфических антигенов в жидкостях организма (ликвор, кровь, синусоидальная жидкость и др.) или антител в сыворотке крови (Приложение 5). Лабораторное обследование проводят с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям. С диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной формой заболевания, стертой формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и менингиты иной этиологии.

По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией.

2. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и других
гнойных бактериальных менингитов

В связи с тем, что наряду с менингококками, наиболее частыми этиологическими факторами гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) могут быть пневмококки, а у детей младшего возраста H.influencae и др. возбудители, представляется целесообразным изложение основных дифференциально-диагностических признаков и методов выделения этих микроорганизмов. По классификационной систематике бактерий Bergey (1 том, 1984 г.), менингококки принадлежат к семейству Neisseriaceae роду Neisseria. Род нейссерий включает два вида патогенных микроорганизмов: N.meningitidis и N.gonorrhoeae, остальные представители этого рода являются резидентной флорой слизистых оболочек. К последним относятся пигментообразующие, объединенные в один вид N.subflava, а также N.sicca, N.mucosa, N.flavescens, N.lactamica. Катаральный диплококк выделен в род Branhamella, включающий: B.catarrhalis, B.caviae, B.ovis и B.cuniculi.

Менингококки требовательны к условиям культивирования. При росте требуют повышенной влажности и 5-10% содержания С02 в воздухе, чувствительны к малейшим отклонениям температуры. В качестве источника нативного белка рекомендуется применять сыворотку крупного рогатого скота, лошадиную или кровь любого другого животного. Основой для приготовления сред могут служить бульоны на основе гидролизата мяса по Хоттингеру, эритрит-агар, агар АГВ, сухой питательный агар специального назначения, выпускаемый Дагестанским институтом питательных сред или "Аминопептид для микробиологических питательных сред" (жидкий, производства Ставропольского мясоконсервного комбината, ТУ-92-14/356-80). Сухие питательные агары, а также сыворотка крови должны быть обязательно проверены на пригодность для культивирования менингококка. Проверку производить со свежевыделенной культурой или эталонным штаммом менингококка, хранившемся в высушенном состоянии.

Идентификация вида N.meningitidis основана на комплексе морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических признаков (табл.1).

Таблица 1

Культуральные и биохимические свойства нейссерий и Br.catarrhalis

Возбу- дитель

Отношение к условиям культивирова- ния Рост на

За- ви- си- мо- сть рос- та от С02 при пep- вич- ном вы- де- ле- нии

Об- ра- зо- ва- ние пиг- мен- та

Сахаролитическая активность

Об- ра- зо- ва- ние по- ли- са- ха- ри- да на ara- pe с 5% са- ха- ро- зы

Редук- ция**

сы- во- ро- точ- ном агa- pe 37°С

бес- сы- во- ро- точ- ном ага- ре 37°С

сре- де с 0,2% жел- чи

глю- коза

маль- тоза

са- ха- ро- за

лак- тоза

фру- кто- за

ни- тра- тов

ни- три- тов

N.gon- orrhe- ae

+

-

-

+

-

К

-

-

-

-

-

-

-(+)

N.men- ingit- idis

+

-

-

+

-

К

К

-

-

-

-

-

-

N.sub- flava

+

+(-)

+

-

+

К

К

-

-

-

-

-

+

N.per- flava

+

-

+

-

+

К

К

К

-

К

+

-

+

N.fla- va

+

+(-)

+

-

+

К

К

-

-

К

-

-

+

N.sic- ca

+

+(-)

+(-)

-

+(-)

К

К

К

-

К

+

-

+

N.muc- osa

+

+

+

-

-

К

К

К

-

К

+

+

+

N.fla- vesce- ns

+

+(-)

+

-

+

-

-

-

-

-

+

-

+

N.lac- tamica

+

+

+

-

+

К

К

-

К

-

-

+

+

Br.ca- tarrh- alis

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

     Обозначения: К    - образование кислоты

                  (-)  - редко

                  **   - тест   используют   как   дополнительный     при

                         дифференциации непатогенных нейссерий.

Примечание: приготовление некоторых питательных сред, приготовление реактивов для исследования редукции нитратов и нитритов, постановка этих реакций и учет см. приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений."

При первом выделении клеткам менингококков свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии менингококков на сывороточном агаре бесцветны, круглые с ровным краем, опалесцирующие, выпуклые, имеют маслянистую консистенцию, легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся консистенцию. Некоторые штаммы, выделенные из СМЖ, могут обладать слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при выращивании на сывороточном arape с 5% сахарозы образовывать крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания культуры.

Менингококки делятся на следующие серогруппы: A, B, C, X, Y, Z, 29E, D, W135, К, H, L, У. Проведение серологического группирования менингококков является обязательным для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям и B.catarrhalis в отличии от гемофилов и пневмококков, что может служить дифференцирующим признаком при их идентификации в сочетании с другими (табл.2)

Таблица 2

Свойства основных возбудителей менингитов, учитываемые
через 24 часа от начала бактериологического исследования

Морфология клеток	Интенсивность роста на агаре		Изменение цвета "шоколад- ного" агара вокруг колонии	Обра- ботка коло- нии 3% КОН*	Ок- раска по Граму	Наличие**			Подозре- ваемые микроор- ганизмы
	20% сыворо- точном	"шоко- лад- ном"				ок- си- да- зы	ка- та- ла- зы	уре- азы
Капсульные полиморф- ные кокки			-	+	-		+	-	Neisseria meninqi- tidis
Мелкие по- лиморфные палочки	-	++++	-	+	-	-	+	+	Haemophi- lus inf- luenzae
Капсульные удлиненные парные кокки			желто- зеленый	-	+		-	-	Strepto- coccus pneumoni- ae
Цепочки и пары из кокков			зеленый	-	+		-	-	Strepto- coccus B, D, viri- dans
Мелкие па- лочки "частоко- лом" и под углом			зелено- коричне- вый	-	+		+	-	Listeria monocyto- genes
Пары и це- почки кок- кобактерий			-	+	-		+	+	Acineto- bacter calcoace- ticum

Примечание: * В каплю 3% раствора КОН вносят петлю (колонию) культуры, эмульгируют. Образование в капле студенистой массы, тянущейся за петлей указывает на наличие грамотрицательной флоры (-), крошащуюся консистенцию образует грамположительная флора (+).

** Постановка реакции на оксидазу, каталазу, уреазу. (см. приказ МЗ СССР N 535 от 22.04.85)

Заболевания, где этиологическим агентом являются гемофилы, характеризуются воздушно-капельным механизмом передачи, что обеспечивает им широкое распространение. Из всех представителей этого рода наибольшей патогенностью обладают H.influenzae, впервые описанные Пфейффером в 1892 г. Этот возбудитель имеет несколько специфических серотипов (a, b, c, d, e, f), из которых тип "b" (Hib) является наиболее частым агентом тяжелых генерализованных форм заболеваний, особенно у детей до 5 лет. ГБМ у взрослых могут быть обусловлены другими серологическими типами.

Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются высокотребовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве фактора, способствующего их росту используют кровь различного происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей может служить "шоколадный" агар.

Для проведения бактериологической диагностики гнойных бактериальных менингитов необходимо обеспечить забор материала от больных в полном объеме с соблюдением: сроков забора, доставки патологического материала и условий транспортировки.

В бактериологическую лабораторию доставляется материал в следующем объеме:

1. Ликвор для первичного посева, бактериоскопии и серологических исследований в количестве не менее 1,0 мл.

2. Ликвор в 0,1% полужидком агаре (среда "обогащения") для бактериологического накопления культуры. 0,5 мл ликвора засевается в 5,0 мл полужидкого агара немедленно у постели больного.

3."Толстая капля" крови для бактериоскопии.

4.Кровь в жидкой питательной среде (10.4.4.) или в 0,1% полужидком агаре (среда обогащения) для бактериологического накопления культуры. 5,0 мл крови засевают в 50,0 мл среды обогащения.

5. Кровь в количестве не менее 2-х мл для серологических исследований (РПГА, ВИЭФ, ЛА и др.)

ГАРАНТ:

См. также микробиологические методы исследования спинномозговой жидкости

Материал для бактериологических и серологических исследований доставляется в бактериологическую лабораторию немедленно после забора в теплом виде (t=37°C) в специально оборудованных контейнерах.

При невозможности немедленной доставки допускается хранение патологического материала в условиях термостата при 37°С в течение 18 часов.

3. Бактериологическое исследование спинномозговой
жидкости больного

3.1. 1-й день исследования. Спинномозговую жидкость (СМЖ) в количестве 2-5 мл берут у больного сразу же при поступлении в стационар (желательно до начала антибактериальной терапии) с соблюдением всех правил асептики. Взятие ликвора проводится персоналом в масках.

Первую порцию СМЖ (около 1,0 мл) берут в отдельную пробирку для проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования наливают в стерильную пробирку (не менее 1,0 мл) и частично засевают в 0,1% полужидкий агар (0,5 мл СМЖ добавляют в 5 мл 0,1% полужидкого агара). Касаться руками краев канюли, иглы и краев пробирок нельзя. Ватно-марлевую пробку полагается держать на весу за ее наружную часть.

СМЖ исследуют немедленно при доставке в лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3-0,5 мл материала и по 2-3 капли засевают на поверхность 2-х чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна чашка содержит "шоколадный" агар, вторая - сывороточный. Посевы ставят в термостат при 37°С и создают условия повышенного содержания С02 в атмосфере термостата. Пробирка с ликвором в полужидком агаре инкубируется в термостате.

Нативная спинномозговая жидкость, оставшаяся в пробирке, исследуется в серологических реакциях и используется для приготовления мазков*(1).

Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно четко, поэтому они окрашиваются метиленовым синим или по Граму в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет установить наличие бактерий, вызывающих гнойный менингит. Морфология менингококков описана выше. H.influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой.

Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми красителями, при этом капсула остается неокрашенной и заметна только на окрашенном фоне*(2). Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа. При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2-3 капли засеять в чашку с питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам.

3.2. 2-й день исследования. Независимо от результатов бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с отсутствием роста инкубируют одни сутки. Готовят препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3% раствором КОН и биохимические тесты - на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.

Морфология менингококковых колоний на сывороточном агаре описана во всех руководствах по микробиологии. На "шоколадном" arape колонии нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют цвета Среды. На основании микроскопии мазков из колоний и результатов первичных биологических тестов возможна выдача предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов.

Гемофилы на "шоколадном" агаре дают довольно обильный рост. Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2-2,0 мм. легко снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени выраженности, а также нити разной длины и короткие цепочки. На сывороточном arape H.influenzae не растет*(3). Крупные (3-5 мм колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на энтеробактерии. Candida и P.aeruginosa растут обильно на всех средах, не изменяя цвета "шоколадного" агара.

Колонии пневмококков на обеих средах - мелкие (диаметром 0,1-1,0 мм), иногда плоские, с вдавлением в центре. На "шоколадном" агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип альфагемолиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно отличить от колоний стрептококков группы В, зеленящих стрептококков, энтерококков (S.feacalis), которые в редких случаях могут вызвать менингит, особенно у детей 1 года.

В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2-3 пар. Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительности (табл.1,2). Определение чувствительности энтеробактерий и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков при добавлении 20% сыворотки. H.influenzae и пневмококков - при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями*(4).

В таблице 2 суммировано минимальное число признаков, достаточное для того, чтобы выделенные из СМЖ бактерии предположительно отнести к тому или иному таксону (от семейства до вида) и избрать дальнейший путь идентификации. На этом этапе возможна выдача окончательного ответа, при положительной реакции со специфическими антисыворотками для H.inftuenzae, N.meningitidis и Str.pneumoniae.

Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор чашки и инкубируют при 37°С.

Колонии, подозрительные на пневмококки, стрептококки и др. отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.

Если число выросших колоний мало (1-2), то их отсевают на чашку с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.

При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, а также изредка и в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (E.coli, S.marcescens, K.pneumoniae, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P.aeruginosa), Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, различные стрептококки - гемолитические группы В, "зеленящие" и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.

При подозрении на энтеробактерии*(5), синегнойную палочку*(6), стафилококк*(7) и Ac.calcoaceticum проводят исследования в соответствии с имеющимися методическими материалами *(8)

При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L.monocytogenes помимо признаков, указанных в табл.2 характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L.monocytogenes образует краевую зону гемолиза на агаре с 5% бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.

Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 Ме/мл пенициллина и стрептомицина.

Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным, "шоколадным" агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда "обогащения").

При отрицательных результатах высев со среды "обогащения" повторяют через 1-2 дня в течение 5 дней инкубации в термостате.

При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.

3.3 3-й день исследования. Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором КОН. Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию (см.табл.1), серогруппирование идентифицированной культуры, а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).

Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).

Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) по микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительные пробы*(9) (см.табл.3).

Таблица 3

Дифференцирующие свойства стрептококков, вызывающих менингит

Виды	S.pneumoniae	S.faeca- lis (гр.Д)	S.agalac- tiae (гр.В)	"Зеленя- щие"*
Гемолиз на 5% кровяном агаре	альфа	альфа, бета, гамма	бета	альфа
CAMP - тест**	-	-	+	-
Лизис на кровяном агаре вокруг диска с 20% желчью	+	-	-	-
Рост после прогрева при 60%С, 30 мин.	-	+	-	-
Разложение маннита	+ или -	+	-	-

Примечание:

* В группу "зеленящих" стрептококков относятся 9 видов малоизученных стрептококков.

** Приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г.

На один из двух секторов кровяного агара с ростом колоний накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при 37°С на 1-2 часа. По истечении этого времени вокруг диска колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста шириной 1-2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м секторе кровяного агара используют для постановки пробы на чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было сделано ранее).

При отрицательных результатах пробы на чувствительность к желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов, дифференцирующих стрептококки (см.табл.3).

В этот же день ставят пробы для идентификации других возможных возбудителей, а также тест на лекарственную чувствительность (если это не было сделано на 2-й день).

3.4 4-й день исследования. Учитывают результаты посевов с целью дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и Br.catarrhalis и чувствительности к химиопрепаратам (если это не было сделано на 3-и сутки). Возможна выдача положительного ответа. Культуру менингококков, выросшую на сывороточном агаре при температуре 37°С, можно использовать для серологической идентификации менингококков в реакции агглютинации или в реакции преципитации в arape, а также для определения лекарственной устойчивости.

Учитывают результаты проб на лекарственную чувствительность и прочие свойства у других возбудителей, выдают окончательный положительный ответ.

4. Бактериологическое исследование крови

При подозрении на менингококцемию или сепсис проводят бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс-метода диагностики рекомендуется приготовление мазка "толстой капли" из крови, взятой из вены или пальца.

В препарате "толстой капли" менингококки имеют преимущественно такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке, имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно-синий цвет лейкоциты и между ними множество мелких, темно-синих, располагающихся кучками, парно и по одному, кокков. Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.

Кровь, взятую стерильно из вены, засевают на 0,1% полужидкий агар или жидкую питательную среду в отношении 1:10, т.е. 1-2 мл крови можно посеять в пробирку с 7-10 мл полужидкого агара или 5-10 мл крови засеять во флакон с 50 мл среды (10.4.4). После суточной инкубации материал высевают на сывороточный агар и "шоколадный" в чашки Петри. При наличии роста готовят препараты для микроскопии. При отрицательном результате рекомендуется инкубация в течение недели с высевами через день. Выделение и идентификацию гемокультур проводят также, как при исследовании спинномозговой жидкости.

5. Бактериологическое исследование экссудата из петехий

При менингококцемии иногда удается обнаружить менингококки непосредственно в экссудате кожных петехий.

Для этого вначале обтирают кожу вокруг петехий 70% спиртом. В случае образования некроза в центре петехии экссудат можно взять прокаленной и остуженной бактериологической петлей из некротизированных участков. При неповрежденной коже экссудат берут стерильной тонкой иглой, соединенной со шприцем, в котором имеется 0,1-0,2 мл физиологического раствора. Физиологический раствор вводят в толщу петехии и отсасывают обратно.

Посев экссудата производят в чашки Петри с сывороточным агаром, содержащим антибиотики ристомицин или линкомицин (п.п.10.1., 10.2) для подавления кожной флоры. Из остатка экссудата готовят препараты-мазки. Мазки из содержимого петехий можно приготовить в виде отпечатков. Для этого стерильной петлей осторожно скарифицируют поверхность петехий, затем прикладывают несколькими местами предметное стекло (стерильное), фиксируют пламенем горелки, окрашивают. На основании данных микроскопии возможна выдача предварительного ответа.

Засеянные чашки инкубируют при 37°С 24 часа (в случае отсутствия роста 48 часов); подозрительные на менингококки колонии отсевают и изучают по описанной схеме (п.3).

6. Бактериологическое исследование носоглоточной слизи на менингококк

1-й день исследования. Исследуемый материал - слизь с задней стенки глотки - берут натощак или через 3-4 часа после еды стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке. Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2-3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не должен касаться зубов, слизистой щек, языка и язычка.

Материал может быть засеян на месте его взятия на чашку Петри с питательной средой, или средой обогащения*(10), или взят смоченным тампоном, который затем доставляют в лабораторию (п.10.6). При посеве на чашку материал втирают на поверхности небольшого участка (1 х 2 см) Среды всеми сторонами тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по всей площади, отведенной для посева.

Используют сывороточный агар с добавлением в него антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков. Для этой цели применяется ристомицин или линкомицин в оптимальной концентрации (п.п.10.2, 10.3). На одну чашку можно засеять две пробы. Однако встречаются отдельные штаммы менингококков, более чувствительные к линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину чашки с сывороточным агаром без линкомицина.

При отсутствии линкомицина или ристомицина можно использовать диски с этими антибиотиками. Диски (не более 2-х) накладывают непосредственно на поверхность засеянного сывороточного агара. В этом случае на 1 чашку сеют только одну пробу. Через одни сутки вокруг диска, в зоне 1 см, рост грамположительной флоры будет подавлен, что увеличивает возможность выделения колоний нейссерий.

Засеянные чашки доставляют в лабораторию, тщательно защищая их от охлаждения, в зимнее время применяя грелки (35-40°С) и немедленно помещают в термостат при температуре 37°С.

Тампоны с исследуемым материалом, погруженные в полужидкую или транспортную среду, доставляют в лабораторию, также тщательно защищенными от охлаждения. Тампоны в 0,1% полужидком агаре (обогащения) помещают в термостат для подращивания флоры. Смоченные тампоны или тампоны в транспортной бульонной среде засевают на чашку с сывороточным агаром, лишенным ингибитора, без предварительного подращивания. Посев делают отжатым тампоном, как описано выше. Засеянные чашки помещают в термостат.

При транспортировке материала на короткие расстояния (1-2 часа езды до лаборатории) применение транспортных сред не рекомендуется. При транспортировке в течение 2-4 часов уместно применение тампонов, смоченных питательной средой. При транспортировке в течение 3-х часов и более тампоны перевозят погруженными в транспортную среду.

Полужидкая среда обогащения может использоваться независимо от сроков транспортировки.

2-й день исследования. Просматривают чашки, засеянные накануне, визуально и под лупой - микроскопом МБС, подозрительные колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее 3-5 колоний). Внешний вид колоний менингококков описан выше. На средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные бактерии, преимущественно представители нейссерий. При отсутствии роста в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр их через 40-48 часов после посева. В эти же сутки делают высев из полужидкой (0,1%) Среды обогащения на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.

3-й день исследования. Изучают рост чистых культур, отсеянных из отдельных колоний в предыдущий день. Культуры, колонии которых имеют желтый пигмент различной интенсивности, а также характеризующиеся "сухим" ростом, отбрасывают. Следует иметь в виду, что на сывороточном агаре колонии менингококков могут выглядеть желтоватыми из-за оттенка среды. Поэтому для обнаружения пигмента их необходимо просматривать при дневном освещении.

Для дальнейшего исследования на менингококки оставляют только непигментированные культуры, дающие нежный влажный рост. Из них готовят мазки, проводят микроскопию чистой культуры. В первых генерациях для менингококков характерны полиморфизм и вариабельность окраски, что не наблюдается у непатогенных нейссерий. После микроскопии дальнейшую идентификацию культур проводят по выше описанным тестам (п.3.1, 3.2)

Если рост культуры из отсеянных колоний достаточно обильный, то в эти сутки ставят реакцию агглютинации с группоспецифическими сыворотками (п.2)

4-й день исследования. Просматривают посевы, сделанные в предыдущий день. Учитывают результаты роста на бессывороточном и желчном агаре (при температуре 37°С), сахаролитическую активность, ставят реакцию с водным раствором Люголя на продукцию полисахарида, проводят окончательную серологическую идентификацию менингококков по реакции агглютинации.

В этот же день выдают окончательный положительный или отрицательный ответ. Результаты бактериологического исследования с полужидкой среды, соответственно, будут получены на сутки позднее.

7. Исследование трупного материала

Патологоанатомическое вскрытие желательно проводить в наиболее ранние сроки после смерти. Для бактериологического исследования направляют кровь, ликвор, кусочки головного мозга (или гной, взятый тампоном с мягкой мозговой оболочки, в случаях менингококцемии - из печени, селезенки, легкого, надпочечников и т.д.). Кровь берут стерильно из правого сердца, после вскрытия скальпелем, с помощью стерильной пипетки с грушей в количестве 7-10 мл. Из них 2-3 мл засевают в 25 мл 0,1% полужидкого агара, а оставшиеся- 5-7 мл используют для других исследований (серологических, в ВИЭФ и т.д.). Для посевов можно использовать, также сгустки крови из крупных сосудов.

Ликвор берут стерильной пипеткой из околооболочечного пространства (во время извлечения головного мозга из полости черепа), в стерильную пробирку в количестве 3-5 мл и немедленно высевают на чашки с питательными средами. В количестве 0,1 мл исследуемый материал наносят в центр чашки и распределяют по ее поверхности покачиванием, растирать шпателем не рекомендуется. Бактериологическое исследование ликвора и крови проводят в соответствии с п.п.3.1 и 3.2. Надо иметь в виду, что рост на чашках может быть смешанным из-за попадания непатогенной микрофлоры, поэтому к общепринятому набору питательных сред следует добавить чашку сывороточного агара с антибиотиком (ристомицин, линкомицин) (п.п.10.2, 10.3.).

Гной с мозговых оболочек берут стерильным ватным тампоном и засевают газоном или штрихами на чашки с шоколадным сывороточным агаром и в пробирку со средой обогащения, делают 2 мазка на предметных стеклах, один из которых красят метиленовым синим, другой - по Граму.

Для взятия материала из мозга и других органов к месту разреза прикасаются раскаленным шпателем, материал берут из глубины разреза стерильным ватным тампоном. Посев производят обычным способом на те же плотные и жидкие питательные среды. Выросшие культуры дифференцируют в соответствии с п.п.3.1 и 3.4.

Помимо посевов из мозга, целесообразно проводить изучение мазков отпечатков с поверхности мягких мозговых оболочек. После подсушивания и фиксации над пламенем горелки (при длительном хранении - в ацетоне) мазки окрашивают и просматривают.

8. Сохранение и транспортировка выделенных культур

Идентифицированные культуры уничтожают или передают по требованию в специализированные НИИ или опорные базы.

N.meningitidis, Str.pneumonie быстро гибнут во внешней среде. Их можно сохранить в течение 5-6 недель методом посева на столбики из оптимальных для каждого микроорганизма питательных сред: для N.meningitidis - сывороточный агар, для Str.pneumonien- кровяной агар. Культуру засевают уколом в столбики и ставят в термостат при температуре 37°С. Через 24 часа при появлении роста культуры по ходу укола и в виде бляшки на поверхности Среды в пробирку наливают 1,5-2 мл стерильного вазелинового масла и в таком виде хранят, транспортируют, не допуская охлаждения. Засеянный материал из одной пробирки можно использовать многократно для пересева. Для сохранения культуры пневмококков ее засевают на скошенный кровяной агар, без инкубации при 37°С, и держат в течение 4-6 дней при температуре от +4°С до +22°С. Для получения свежей культуры с поверхности засеянного агара делают соскоб и пересевают на свежую среду такого же состава, ставят в термостат на сутки при температуре 37°С.

Группоспецифическая активность менингококков сохраняется в течение 2-х недель, а пневмококков -1 неделю.

H.influenzae также быстро гибнет. Жизнеспособность гемофилов можно продлить до 1 месяца, для чего делают обильный посев на скошенный "шоколадный" агар и после суточной инкубации создают полную герметизацию. Такую культуру для пересева используют только однократно. Дегерметизация приводит к гибели субкультуры.

9. Сроки выдачи ответов и их формулировка

9.1 При бактериологическом обследовании ликвора и крови сроки выдачи и формулировка ответов таковы:

на 1-й день на основании прямой бактериоскопии ликвора и толстой капли крови дают предварительный ответ, в зависимости от результата формируется в трех вариантах:

а) при наличии в мазках большого числа морфологически типичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены грамотрицательные кокки (или грамположительные палочки), сходные по морфологии с менингококками, или пневмококками, или H.influenzae. Исследование продолжается."

б) при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены единичные (или парные) клетки кокков (или палочек и т.д.). Исследование продолжается." в) при отсутствии каких-либо бактериальных клеток пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии бактерий не обнаружено."

На основании результатов серологических реакций (ВИЭФ, ЛА и др.) ликвора дают ответ, который в зависимости от результатов формулируют следующим образом:

а) при выявлении специфического антигена пишут: "В спинномозговой жидкости выявлен специфический антиген (менингококковый, пневмококковый и H.influenzae тип "В" и др.)".

б) при отрицательном результате пишут: "В спинномозговой жидкости специфические антигены не выявлены".

на 2-й день выдают ответ также предварительного характера, который в зависимости от результатов бактериологического исследования формулируют следующим образом:

а) при росте бактерий, типичных по морфологическим и культуральным свойствам для нейссерий и других родов, пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) получен рост нейссерий (или стафилококков, стрептококков, грамотрицательных палочек и др.). Изучение культуры продолжается".

б) при наличии четко выраженной реакции агглютинации выросшей культуры с одной из специфических сывороток (табл.2) и положительной бактериоскопии мазка может быть дан окончательный положительный ответ: "При исследовании спинномозговой жидкости (кровь) получен рост (H.influenzae, N.meningitidis, Str.pneumoniae и др.)".

в) при отсутствии роста пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) роста бактерий не обнаружено. Исследование продолжается."

на 3-й день на основании культурально-биохимических свойств бактерий, отсеянных с чашки на 2-й день, выдают окончательный ответ: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура менингококков серогруппы А, В и т.п. (или негруппируемая)". В редчайших случаях "M.catarrhalis или непатогенные нейссерии".

В этот же день может быть дан предварительный ответ о росте (или его отсутствии) бактерий в результате высева из среды обогащения. Формулировка та же, что и при оценке результатов прямого посева с чашки. В этот же день выдают окончательный положительный ответ на пневмококки, который формулируют: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура Str.pneumoniae."

на 4-й день может быть выдан окончательный положительный ответ о видовой принадлежности нейссерий, выросших при прямом посеве, а также других бактерий.

На этом же этапе, как и в следующие дни (вплоть до 5-го дня), может быть выдан окончательный положительный ответ, полученный в результате высева из Среды обогащения. Формулировка та же (см. 3-й день).

Окончательный отрицательный ответ выдают не ранее 5-го дня, когда при последнем высеве из среды обогащения (на 5-й день ее инкубации) не обнаруживают роста бактерий. Его формулировка: "При инкубации спинномозговой жидкости (крови) на среде обогащения в течение 5 дней бактерий выделить не удалось."

9.2. При бактериологическом исследовании отпечатков-мазков из петехий больного или кусочков ткани трупного материала дают предварительный ответ, который в зависимости от результатов формулируется в трех вариантах (п.9.1).

При бактериологическом исследовании трупного материала, кусочков тканей, крови, жидкости из полостей и т.д. в зависимости от результатов, формулировку ответа см. п.9.1. Окончательный отрицательный ответ выдается не ранее 5-го дня с момента посева исследуемого материала.

9.3. При бактериологическом исследовании слизи из носоглотки выдают только окончательные ответы. Сроки выдачи и формулировки следующие: на 4-й день при выделении культуры менингококка выдают положительный ответ: "В носоглоточной слизи обнаружены менингококки определенной серогруппы или негруппируемые."

В случаях добавочного отсева колоний с чашек, а также при использовании полужидкой среды обогащения сроки выдачи ответа соответственно отодвигаются на сутки. При отсутствии роста менингококков в посевах выдают отрицательный ответ: "В носоглоточной слизи менингококк не обнаружен."

10. Приготовление красок, питательных сред, описание методов

Приготовление агаровых питательных сред кровяного, шоколадного, полужидкого агара, "обогащения" ликвора (см. приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г.)

10.1.Сывороточный агар.

В качестве основы используют 1,2-1,5% агар /рН=7,4/, приготовленный на бульоне из рыбного гидролизата, бульоне из перевара Хоттингера/аминный азот в бульоне 150-180 мг/мл/ или на сухом питательном агаре специального назначения. К 80 мл расплавленного и остуженного до температуры 50°С агара добавляют 20 мл инактивированной при температуре 56°С в течение 30 минут сыворотки, консервированной хлороформом, или без консерванта (при инактивировании сыворотки консервант улетучивается). После перемешивания среду разливают в чашки. Среда годна к употреблению только в течение 48 часов при хранении ее в холодильнике. Перед посевом чашки, хранившиеся в холодильнике, должны быть подсушены и подогреты до температуры 37°С.

10.2.Сывороточный агар с ристомицином.

К 80 мл расплавленного и остуженного агара (такого же, как и для приготовления сывороточного агара) добавляют 20 мл сыворотки и 0,1 мл. раствора ристомицина, содержащего 20.000 ед/мл (конечная концентрация антибиотиков 20 ед/мл питательной среды).

В связи с испытываемыми трудностями в снабжении ристомицином рекомендуется простой метод, позволяющий экономно расходовать антибиотик. Препарат разводят стерильным физиологическим раствором до рабочей концентрации и затем разливают по стерильным пенициллиновым флаконам или центрифужным пробиркам под ватными или резиновыми пробками и замораживают в морозильной камере. Количество рабочего раствора во флаконах или пробирках зависит от потребности лаборатории.

Рабочий раствор сохраняют в морозильной камере до момента использования. В случае необходимости раствор оттаивают и добавляют в среду. Например, во флакон, содержащий 100 мг (100 000 ед.) ристомицина, вносят 5 мл стерильного физиологического раствора. Полученное разведение препарата является рабочим. Его удобно разлить по 0,5 мл и заморозить В таком состоянии препарат может храниться несколько месяцев.

10.3.Сывороточный агар с линкомицином.

К 80 мл расплавленного и остуженного агара добавляют 20 мл сыворотки и 0,5 мл раствора линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл.

Конечная концентрация антибиотика в среде - 5 мкг/мл питательной среды. Раствор линкомицина можно хранить при температуре +4°С в течение 6 месяцев.

10.4. Желчно-сывороточный агар.

5,0 мл сухой бычьей желчи*(11) растворяют в 100,0 мл дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят рН до 7,2-7,4, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд. К 80 мл расплавленного и охлажденного до 50°С питательного агара добавляют 4,0 мл стерильного раствора желчи, перемешивают, затем добавляют 20,0 мл сыворотки животных, снова хорошо перемешивают и разливают по чашкам Петри. Конечная концентрация желчи в среде - 0,2%. Посев испытуемых культур нейссерий производят штрихами на сектора чашки.

10.5. Плотные среды с углеводами.

Готовят на той же питательной основе, что и предыдущие. К 75 мл агаровой основы добавляют 0,9 г одного из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и 3,9 мл раствора индикатора фенолового красного. Агар стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 минут или однократно в течение 30 минут при 0,5 атм.

Перед употреблением среду растапливают в водяной бане, охлаждают до температуры 48-50°, добавляют 20 мл инактивированной нормальной сыворотки и разливают в чашки. На 1 чашку можно посеять не более 6 культур. Сектор с посевом должен быть узким, у основания не более 1 см, а расстояние между ними не менее 2-3 см.

Таким образом, каждую культуру засевают на 1/4- 1/8 пяти чашек с различными углеводами. Учет результатов производят через 24 часа инкубации в термостате. При разложении какого-либо углевода с образованием кислоты красный цвет среды в секторе посева меняется на ярко-желтый.

Приготовление раствора индикатора фенолового красного (фенол-рот).

Смешивают 0,4 г порошка фенол-рот с 16 мл 0,1 N NaOH и выдерживают в термостате до полного растворения при частом встряхивании. Затем раствор доводят до объема 200 мл дистиллированной водой, разливают во флаконы и стерилизуют при 1 атм. в течение 20 минут.

 10.6.Транспортные среды для выделения менингококков из носоглоточной

слизи.

10.6.1.Бульон для приготовления смоченных тампонов.

Бульон готовят на любой питательной основе с добавлением 20% сыворотки животных и ристомицина из расчета 20 ед/мл Среды. Используют ватные тампоны на алюминиевых стержнях, вмонтированные в пробирку (п.6.6.). Перед выездом за материалом тампоны пропитывают бульоном из расчета 10-12 тампонов в 5 мл бульона, соблюдая стерильность. Тампоны к месту взятия материала и обратно в лабораторию доставляют, предохраняя их от холода. Длительность транспортировки материала с момента взятия до посева в питательную среду не должна превышать 3-х часов.

10.6.2.Приготовление жидких транспортных сред с линкомицином.

Используют любой питательный бульон или 2% пептонную воду, рН=7,2-7,6. К 100 мл стерильного бульона добавляют 0,5 мл линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл. Конечная концентрация линкомицина - 5 мкг/мл. Среда сохраняется в холодильнике не более 2-х суток. Непосредственно перед взятием носоглоточной слизи (можно в помещении, где находятся обследуемые лица) среда без огня разливается по 1,0 мл в стерильные пробирки. Перед погружением тампона пробку извлекают, тампон вставляют в пробирку так, чтобы материал был погружен в среду; пробирку со вставленным тампоном снова закрывают. Пробирки транспортируют в вертикальном положении при температуре не ниже 22°С. По доставке в лабораторию тампоны отжимают о стенки пробирки и производят посев на сывороточный агар без антибиотиков в чашки Петри. На одной чашке можно разместить 2 посева. Транспортные среды с линкомицином применяют при необходимости транспортировки материала в течение более 3-х часов.

10.6.3. Приготовление полужидкой среды обогащения для носоглоточной слизи.

К 80 мл полужидкого питательного агара добавляют 20 мл любой сыворотки и 0,1 мл раствора ристомицина, содержащего 20 000 ед/мл (конечная концентрация 20 ед/мл питательной среды). Среду разливают в пробирки по 3 мл, выдерживают 2 суток в термостате для контроля и затем хранят в холодильнике.

10.7."Двухфазная " питательная среда.

Питательная среда содержит не только х, гамма факторы, необходимые для роста Н.influenzae, но витамины, что способствует росту других микроорганизмов, в том числе менингококков и пневмококков.

В этой связи среда может быть использована только для посева "стерильного" материала, взятого из закрытых полостей (СМЖ, кровь, эксудат и т.п.) со всеми предосторожностями от возможного загрязнения.

В основу двухфазной среды взята питательная среда "шоколадный агар" на триптическом переваре (Хоттингера, триптикоза - соевый и др.). При добавлении крови животного среда прогревается в течение 10 мин. при 65-80°С двукратно, употребление крови человека требует прогревания среды в течение 15 мин. при температуре 100°С (что разрушает анти-Y фактор в этой крови). Среда разливается в пробирки по 5,0 мл или флаконы по 50,0 мл и скашивается.

После затвердения "косяков" в пробирки добавляют по 3,0 - 5,0 мл, а во флаконы по 50,0 мл бульона на переваре "Хоттингера", к которому добавляется гретая кровь и экстракт пекарских дрожжей*(12).

Среда для употребления хранится в холодильнике, перед внесением в нее патологического материала согревается в термостате. Засеянные у постели больного пробирки тотчас доставляются в лабораторию. При невозможности осуществить доставку немедленно они помещаются в термостат с последующей передачей в лабораторию. В лаборатории из "двухфазной" среды делают посев на чашки с агаром. Уже через 3-4 часа жидкая часть среды мутнеет от роста в ней культуры, из которой можно сделать мазок для микроскопирования.

11. Методы серологической идентификации менингококков
или их антигенов

11.1 Реакция агглютинации на стекле (см. Инструкцию по применению сывороток).

11.2 Реакция агглютинации в полистироловых пластинах.

При постановке реакции агглютинации (РА) используют полистироловые пластины или большие стекла. Для каждой испытуемой культуры менингококков используют один ряд лунок пластины. Число горизонтальных лунок соответствует числу агглютинирующих группоспецифических сывороток. Жидкую сыворотку каждой серогруппы в лунке разводят вдвое (1 капля сыворотки плюс 1 капля взвеси культуры). В отдельной лунке каждого ряда готовят взвесь испытуемых культур. Для этого запаянной изогнутой пастеровской пипеткой бактериальную массу снимают с чашки Петри и тщательно эмульгируют в физиологическом растворе. Для получения оптимальной рабочей густоты к взвеси добавляют по 1,0 мл физиологического раствора. Взвесь разносят по 1 капле в горизонтальные лунки. Пластины встряхивают в течение 1 мин. руками или шуттеле-аппарате.

Учитывают реакцию в течение первых 3-х мин. Контролем служит лунка, в которой готовят исходную взвесь бактерий в физиологическом растворе.

 11.3 Реакция преципитации для  определения серогруппы менингококков  и

метод    встречного    иммуноэлектрофореза    (ВИЭФ)    для   определения

специфического антигена в СМЖ (экспресс-диагностика*(13)

11.3.1 Приготовление агара.

Из дальневосточных сортов агар-агара готовят 2% взвесь на дистиллированной воде. В случае непрозрачного раствора агара, в него добавляют 10% раствор NaCl: из расчета 50 мл на 1 л раствора агара. Профильтрованный растопленный агар разливают в ванночки слоем в 1 см, в застывшем состоянии нарезают квадраты размером 1 х 1 см и завязывают в марлю. Сначала его промывают проточной водопроводной водой в течение 24-48 часов, затем сутки - дистиллированной, которую заменяют 3-4 раза. Отмытый агар отжимают от воды, помещают в колбу и разогревают на кипящей водяной бане, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют дистиллированную воду до первоначального объема, т.е. до концентрации, равной 2%. К горячему 2% агару добавляют равный объем "камерного" веронал-мединалового буфера, разведенного в 2 раза дистиллированной водой, и кипятят в водяной бане до полной гомогенизации смеси. К остывшему до 60 агару добавляют тимол или крезол из расчета 1: 10000. Полученный 1% раствор агара на веронал-мединаловом буфере используют для постановки реакции ВИЭФ. Для реакции микропреципитации используют 1% агар, приготовленный на физиологическом растворе.

 11.4    Реакция   микропреципитации   для   определения   серогруппы

менингококков.

В чашку Петри или стеклянную пластинку размером 9 х 12 см наливают 20 мл, а на предметное стекло - 5 мл расплавленного 1% агара на физиологическом растворе. В застывшем arape с помощью металлических трубок просекают отверстия (лунки) диаметром 3 мм, из которых агаровые пробки удаляют путем отсоса этой же трубкой или острием иглы. Расстояние между центрами лунок 0,5 см.

Лунки в агаре располагают следующим образом: в центральную лунку пастеровской пипеткой наливают сыворотку, в периферические - прогретые при температуре 100°С в течение 15 минут взвеси испытуемых культур. Микробную кипяченую взвесь можно хранить в холодильнике в течение 2-х недель. Для реакции микропреципитации используют не разведенные сыворотки.

Концентрация испытуемой суточной культуры менингококка, выращенной на 20% сывороточном агаре, должна составлять 30-60 единиц, т.е. быть в 3-6 раз гуще оптического стандарта мутности в 10 единиц. Чашки Петри или стеклянные пластины с лунками, заполненными сывороткой и антигенами, помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) на 24-48 часов при температуре 20-22°С. По окончании срока учитывают реакцию. Реакция проявляется только со штаммами менингококков гомологичной серогруппы в виде линии преципитации.

 11.5 Метод ВИЭФ

У больного гнойным менингитом, желательно до применения химиотерапии, берут СМЖ, которую исследуют на присутствие специфического полисахаридного антигена. Для этого используют аппарат для иммуноэлектрофореза ПЭФ-3 или другой любой марки. В аппарат заливают "камерный" вероналмединаловый буфер, содержащий в 1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,45 веронала (веронал надо греть на водяной бане до полного его растворения) рН = 8,6. Приготовленный 1% агар (п.11.3.1), растопленный и остуженный до 60°С, наносят в количестве 20 мл на поверхность стеклянной пластинки, размером 9 х 12 см, помещенную на горизонтальный столик. После застывания агара пробойником или металлической трубкой, диаметр которой равен 3 мм, высекают 2 параллельных ряда отверстии на расстоянии 3 мм друг от друга, по числу групповых сывороток. Ряды располагают перпендикулярно к направлению силы тока.

Антисыворотки вносят в лунки, расположенные со стороны анода (+), а спинномозговую жидкость в лунки со стороны катода (-). Сыворотку вносят в отдельную лунку. В отдельную лунку помещают заведомо положительный контроль, который позволяет оценить правильность постановки теста. В качестве контроля используют менингококковую вакцину серогруппы А или C с гомологичноq сывороткой, в концентрации 10-20 мкг/мл. Приготовленную пластинку помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 20-30 мин. при силе тока 12-15 МА на 1 стекле. Аппарат работает при комнатной температуре. При положительной реакции через 10 мин. после выключения тока, между лунками (с одной из сывороток и ликвором) появляются линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. В случае, когда антигена мало, линии преципитации проявляются на следующие сутки (пластинка находится во влажной камере). Для ускорения этого процесса в тот же день, можно 2-3 раза пропускать ток через пластину в течение 5-10 минут, т.е. время анализа увеличивается до 60 мин. Формулировку ответа на ВИЭФ см.п.9.1.

12. Приготовление и стерилизация тампонов для взятия
носоглоточной слизи

Для взятия носоглоточной слизи используют ватные тампоны, укрепленные на металлической проволоке. Лучше всего применять проволоку из малоокисляемого металла (алюминия) диаметром 2-3 мм. Проволоку изгибают под углом 135° на расстоянии 1-2 см от конца, на которой накручивают ватный тампон; 5-10 таких проволок завертывают в бумагу и стерилизуют сухим жаром или в автоклаве. Можно использовать также стерильные ватные тампоны на проволоках, вмонтированных в пробирку.

13. Создание повышенной концентрации углекислоты
при культивировании посевов на чашках Петри и в пробирках

(рекомендуется при первичном выделении менингококков из ликвора, крови и получении биомассы).

Для создания повышенной концентрации С02 можно использовать любой сосуд с притертой крышкой, например, эксикатор. Засеянные чашки помещают внутрь сосуда вверх дном, там же укрепляют зажженную свечу высотой 2-3 см и закрывают крышкой, которой может служить и простое большое стекло. К моменту затухания свечи в сосуде создается повышенная концентрация С02 (7-10%). После этого сосуд с посевами помещают в термостат.

Руководитель Департамента

госсанэпиднадзора

А.А.Монисов