Приложение 5. Методические указания по использованию реакции непрямой гемагглютинации для выявления антител при менингококковой инфекции

Приложение 5

к приказу Минздрава РФ

от 23 декабря 1998 г. N 375

Методические указания
по использованию реакции непрямой гемагглютинации
для выявления антител при менингококковой инфекции

1. Показания к проведению серологических исследований

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами*(15) серогрупп А, В и С проводят в следующих случаях:

а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике (в начале заболевания, на 7 и 15 день болезни).

б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;

в) при проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения с целью определения соотношения серонегативных и серопозитивных контингентов;

г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.

2. Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)
с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами

Реакцию непрямой гемагглютинации можно ставить как макро-, так и микрометодом, причем, в последнем случае используют только микротитраторы системы "Такачи".

Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.

Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1-2 часов при комнатной температуре.

При постановке РНГА можно использовать многоканальные пипетманы с указанными объемами ингредиентов.

2.1. Необходимые реагенты и приборы:

- эритроцитарные менингококковые серогруппы А, В и С диагностикумы;

- сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические А, В и С *(16);

- нормальная кроличья сыворотка*(17), сухая кроличья плазма или бычий сывороточный альбумин*(18);

- исследуемый материал (сыворотка крови человека);

- полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки или микротитраторы с V-образными лунками (системы "Такачи");

- термостат для поддержания температуры 37°С;

- водяная баня для поддержания температуры 56°С;

- потенциометр для измерения рН растворов;

- пипетки стеклянные мерные (ГОСТ 20-292-74);

- дозаторы пипеточные П1 на 0,5; 0,05 (2Т2.933.053 ТО);

- хлорид натрия (NaCl),

- натрий фосфорно-кислый двузамещенный (Nа2НРО4-12H2O);

- калий фосфорно-кислый однозамещенный (КН2Р04);

- дистиллированная вода.

2.2. Подготовка ингредиентов.

2.2.1. Приготовление исходного забуференного физиологического раствора рН 7,2 (ЗФР).

     В 0,5 л дистиллированной воды растворяют:

     хлорида натрия (NaCl)                                 - 8,65 г

     натрия фосфорно-кислого двузамещенного (Na2HPO4х2Н2О) - 1,92 г

     калия фосфорно-кислого

     однозамещенного (КН2РО4)                              - 0,44 г

     Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой.

После растворения солей проверяют рН раствора, который должен быть равен 7.2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.

2.2.2. Стабилизирующий буфер.

В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный альбумин (БСА).

Используемая НКС не должна давать неспецифической (спонтанной) реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Инактивированную при +56°С в течение 30 минут НКС или плазму добавляют к ЗФР из расчета 1,0 мл на 100,0 мл (получают 1% раствор), БСА не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0,5%.

2.2.3. Взятие крови.

Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики: при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.

После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +4°С. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.

Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток проводят в стабилизирующем буфере.

3. Учет реакции

Реакцию оценивают по общепринятой 4-х плюсовой системе (см. Наставление по применению эритроцитарных менингококковых диагностикумов).

За титр противоменингококковых антител принимают максимальное разведение сыворотки крови, в котором наблюдают четко выраженную агглютинацию эритроцитов с интенсивностью не менее чем на 2+, при условии, что в предыдущих лунках реакция шла на 4+ или 3+. Сыворотки крови с разведения 1:5 и выше с четко выраженной агглютинацией эритроцитов, оценивают как положительные.

4. Рекомендуемые сроки, кратность обследования
и трактовка серологических результатов

При выборе оптимальных сроков и кратности обследования больных ГФМИ и для правильной трактовки серологических результатов необходимо принимать во внимание ряд факторов, влияющих на уровень антител: возраст больного, преморбидный фон, клиническую форму, тяжесть и период болезни; сопутствующие заболевания, серологические особенности возбудителя. При менингококковой инфекции, также как и при других инфекционных заболеваниях, правильная оценка результатов серологических исследований может быть дана только при их сопоставлении с эпидемиологическими и клиническими данными.

Оптимальные сроки взятия крови у больного ГФМИ - первые дни болезни (1-3 день), вторая третья и последующие недели болезни. Первую сыворотку крови необходимо брать сразу же при поступлении больного в стационар, последующие через 7-10 дней.

4.1. РНГА при генерализованных формах менингококковой инфекции.

4.1.1. РНГА с диагностикумами А и С.

Антитела к группоспецифическим полисахаридам менингококков серогрупп А и С при ГФМИ можно выявить уже в первые дни болезни. Число серопозитивных лиц среди взрослых больных составляет в эти сроки около 40%. Максимальный уровень антител отмечается на 2-3-ей неделях болезни, с 4-5 недели уровень антител постепенно снижается.

За условно-диагностический титр антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С у детей старше 3-х лет и взрослых принимают положительную реакцию в разведении сыворотки крови 1:40-1:80, т.к. у лиц, не инфицированных менингококками в момент обследования, антитела в таких титрах встречаются сравнительно редко (9-11%).

У детей в возрасте до 1 года продукция антител выражена слабо, в связи с чем положительные реакции наблюдают обычно в более поздние сроки (со 2 недели болезни).

У детей моложе 3-х лет за условно-диагностический титр антител к полисахаридам А и С принимают положительную реакцию в разведении 1:20 и выше, т.к. при отсутствии менингококковой инфекции у детей этого возраста антитела или не обнаруживаются, или встречаются в единичных случаях в титрах не выше чем 1:5-1:10.

Интенсивность антителообразования не одинакова при различных клинических формах менингококковой инфекции. При менингококцемии и сочетанных формах (менингококцемия + менингит) уровень антител обычно выше, чем при других формах болезни.

При тяжелом течении ГФМИ и особенно при инфекционно-токсическом шоке противоменингококковые антитела обнаруживаются в низких титрах, а в отдельных случаях не выявляются вообще. При очень тяжелом течении болезни особенно при наличии тяжелых осложнений (отек и набухание мозга) антителообразование выражено слабо: в остром периоде болезни обнаруживают около 10% серопозитивных проб с низкими титрами (1:5-1:10). В дальнейшем, при улучшении состояния больных титры антител и число серопозитизных проб может возрастать.

Обнаружение уже на 1 неделе болезни антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С в титре 1:160 и выше подтверждает менингококковую этиологию заболевания. В некоторых случаях такие титры антител, обнаруженные на 1 неделе болезни, могут сохраняться и в более поздние сроки заболевания. Хотя у данных больных не наблюдается сероконверсии, высокие показатели РНГА могут служить достаточным основанием для серологического подтверждения диагноза ГФМИ.

Диагноз ГФМИ определяется как этиологически подтвержденный при наличии динамики (четырехкратного и более) нарастания уровня антител. При двукратном нарастании титра антител - диагноз оценивается как подтвержденный лишь при выраженной клинической картине.

Число этиологически подтвержденных случаев ГФМИ методом РНГА может достигать: у взрослых 80%, у детей, в среднем 70% (в возрастной группе детей до 3-х лет - 60%, в старших возрастных группах - 80%).

4.1.2. РНГА с диагностикумом серогруппы В.

При интерпретации серологических данных, полученных при работе с эритроцитарным диагностикумом на основе полисахарида менингококков серогруппы В, необходимо учитывать следующие моменты.

Изучение иммуноструктуры населения с помощью РНГА с диагностикумом серогруппы В представляет определенные сложности из-за сходства химической структуры В-полисахарида менингококка и капсульного полисахарида E.coli К1. Существует возможность наличия перекрестных реакций, что усложняет интерпретацию результатов относительно менингококка серогруппы В. Диагностикум может быть использован для подтверждения диагноза ГФМИ при исследовании сывороток крови в динамике - взятой в начале заболевания и через 2, 3 недели.

Генерализованные формы менингококковой инфекции, обусловленные менингококками серогруппы В, наиболее часто (до 60%) диагностируются у детей первых трех лет жизни, у которых антителообразование выражено слабо. При ГФМИ у взрослых, в большинстве случаев, в первые дни болезни уровень антител к менингококкам серогруппы В составляет 1:20-1:40, с последующей сероконверсией на 2-3 неделях. В отдельных случаях (14%) содержание антител на 2-3 неделях болезни может достигать титров 1:640 - 1:1280 и выше.

4.1.3. Групповая специфичность РНГА.

При постановке РНГА с набором эритроцитарных диагностикумов может выявляться одновременное присутствие антител к нескольким полисахаридам. В таких случаях серогруппу менингококков, вызвавших заболевание у данного больного, определяют по динамике нарастания уровня антител к одному из полисахаридов. При этом разница показателей парных сывороток должна быть не меньше чем на два разведения. При получении одинаковых титров антител к двум полисахаридам в условно-диагностических титрах, диагностируется ГФМИ без установления серогруппы возбудителя.

4.2.   РНГА  при  локализованных  формах  менингококковой   инфекции

(назофарингит и бактерионосительство).

При локализованных формах менингококковой инфекции серологические исследования не следует рассматривать как метод диагностики, поскольку вопрос о носительстве или менингококковом назофарингите решается на основании бактериологического обследования. Но в ряде случаев при проведении исследований в очагах ГФМИ серологические данные могут послужить дополнительным тестом, ретроспективно подтверждающим клинико-эпидемиологический диагноз менингококковой инфекции. При этом следует проводить обязательное исследование парных образцов сывороток крови, полученных с 10-14 дневным интервалом.

При назофарингите антителообразование более выражено, чем при бактерионосительстве. У больных назофарингитом менингококковой этиологии в 90% случаев выявляются противоменингококковые антитела, причем в 50% случаев с титрами от 1:40 и выше. Среди бактерионосителей независимо от серогруппы выделенного возбудителя специфические антитела определяют в 65% случаев, а с титрами от 1:40 и выше у 30% носителей.

В сыворотках крови, полученных от носителей, так же как и от больных (см. п.4.1.3.), могут выявляться антитела к нескольким полисахаридам менингококков. Нарастание антител к гомологичной серогруппе чаще отмечают при носительстве менингококков серогруппы А. В отдельных случаях динамика антител (сероконверсия) не позволяет серологически установить доминирующую серогруппу менингококков. В этом случае определяют носительство без установления серогруппы.

4.3. РНГА при иммуно-эпидемиологических исследованиях.

Целью иммуно-эпидемиологических исследований является определение числа лиц вероятно восприимчивых к менингококковой инфекции и групп риска. Анализ проводят по числу серопозитивных и серонегативных лиц с учетом существующей эпидемической ситуации.

Например, в период эпидемического неблагополучия увеличивается число серопозитивных лиц и соответственно уменьшается число серонегативных к эпидемической серогруппе менингококков. В период спорадической заболеваемости, наоборот, растет число серонегативных лиц.

При проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения объем репрезентативных выборок устанавливается эпидемиологом в соответствии с численностью и возрастным составом коллектива, района, населенного пункта.

Определяемый фоновый уровень противоменингококковых антител связан с заболеваемостью менингококковой инфекцией на данной территории и уровнем носительства. Наиболее высокий уровень антител в разные эпидемические периоды определяют к менингококкам серогруппы В, что, возможно, отражает их серологическое родство с E.coli К1, моракселлой, непатогенными нейссериями. При этом число серопозитивных проб с титрами антител 1:20 и выше может достигать 90%.

К менингококкам серогруппы С уровень антител наименьший, число серопозитивных сывороток с титром антител 1:20 и выше составляет 8%.

Уровень антител к менингококкам серогруппы А дает достаточно четкую характеристику эпидемиологической ситуации и отражает широту циркуляции возбудителя.

Анализ серологических результатов эпидемиологических исследований проводят на основании расчета следующих показателей:

а) процента серонегативных проб, полученных с каждым из эритроцитарных диагностикумов (А, В и С), который может отражать число вероятно восприимчивых лиц к менингококковой инфекции;

б) процента серопозитивных проб (все серопозитивные сыворотки крови, начиная с разведения 1:5 и выше), из числа которых выделяют пробы с титрами антител:

- в возрастной группе до 3-х лет с 1:10 и выше к полисахаридам А и С, с 1:20 и выше к полисахариду В;

- в старших возрастных группах детей и у взрослых с 1:20 и выше к полисахаридам А и С, с 1:80 и выше к полисахариду В. Процент сывороток крови с указанными выше уровнями антител отражает доминирующие на данной территории серогруппы менингококков.

4.4.  Применение  РНГА для оценки эффективности  вакцинопрофилактики

менингококковой инфекции.

Формирование поствакцинального иммунитета носит группоспецифический характер. В связи с этим, в зависимости от используемой для профилактики менингококковой вакцины, серологические исследования для оценки эффективности вакцинации проводят с применением РНГА с гомологичным эритроцитарным диагностикумом.

При вакцинации взрослых специфические противоменингококковые антитела к полисахариду А выявляют в высоких титрах (1:40-1:640 и выше) не менее чем у 80% привитых уже на 3-4 неделе после вакцинации. На протяжении последующих 6-8 месяцев у привитых титры антител несколько снижаются, но сохраняются на повышенном уровне не более двух лет.

Руководитель Департамента

госсанэпиднадзора

А.А.Монисов

*(1) Группоспецифические сыворотки производит Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток.

*(2) Описание морфологии колоний и морфологии культуры других бактерий см. в соответствующих методических рекомендациях.

* (3) Подробная идентификация микробов рода H.influenzae изложена в Методических рекомендациях "Современные методические подходы к микробиологической диагностике гемофильной инфекции". Утверждена МЗ России, Санкт-Петербург, 1992 г.

*(4) "Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в aгаре с использованием дисков. Утверждена МЗ СССР в 1983 г. N 2675-83.

ГАРАНТ:

Взамен "Методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков" N 2675-83 действуют Методические указания МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.

*(5) Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями, утвержденными МЗ СССР, 1984 г.

*(6) Методические рекомендации "Обнаружение и идентификация синегнойной палочки в объектах окружающей среды", утвержденных МЗ СССР, 1982 г.

*(7) Инструкция по бактериологическому обследованию на выявление носителей патогенного стафилококка и проведение санации. Приложение к приказу МЗ СССР N 720, утвержденных в 1978 г.

*(8) Приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г.

*(9) Методические рекомендации "Микробиологические методы обследования пульмонологических больных" утвержденных МЗ СССР, 1981 г.

*(10) Материал можно исследовать в соответствии с методическими рекомендациями: Выделение менингококка от больных и бактерионосителей (Оренбург, 1984 г.) N 3083, утвержденных МЗ СССР 15.08.84. Для этого тампон погружают в среду Игла или среду 199, без антибиотиков.

*(11) Желчь сухая, выпускается Московским мясокомбинатом.

*(12) Методические рекомендации "Современные методические подходы к микробиологической диагностике гемофильной инфекции. "Утверждены Минздравом России, 1992 г.

*(13) Используют только те коммерческие сыворотки в "Наставлении" к которым сказано, что они пригодны для постановки реакции преципитации.

*(14) В нашей стране кроме отечественной вакцины зарегистрирована и разрешена к применению полисахаридная менингококковая вакцина А+С (менинго А + С) производства "Пастер Мерье Коннот" Франция.

*(15) Характеристика эритроцитарных менингококковых диагностикумов, выпускаемых производственным предприятием МНИИ-ЭМ им. Г.Н.Габричевского Минздрава РФ, условия их хранения и техника постановки реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации подробно изложены в Наставлении по применению диагностикумов, которое вложено в упаковку препаратов.

*(16) Входят в набор эритроцитарных менингококковых диагностикумов.

*(17) Нормальную кроличью сыворотку получают от здоровых кроликов.

*(18) Кроличья плазма и бычий сывороточный альбумин - коммерческие препараты.