Отраслевой стандарт ОСТ 59.01.003.48-85 "Система стандартов безопасности труда. Воздух рабочей зоны. Допустимое содержание микроорганизмов, используемых для борьбы с вредителями сельского хозяйства. Методы контроля" (утв. Главным управлением микробиологической промышленности при СМ СССР 28 августа 1985 г.)

2.1. Отбор проб воздуха рабочей зоны осуществляют прибором для бактериологического анализа воздуха, обеспечивающего аспирацию воздуха 20...40 л/мин. и время работы при отборе одноразовой пробы до 30 минут.

2.2. Погрешность данного прибора зависит от погрешности показания ротаметра, которая на превышает 5%.

2.3. Улавливающая эффективность прибора составляет от 50% для частиц в Д50 = 3,6 мкм, до 95% для частиц с большим Д50.

3.1.* Оборудование и посуда

     Прибор для бактериологического анализа воздуха. Модель 818  (Щелевой

прибор Кротова) по ТУ 64-1-791-77

     Автоклав вертикальный по ГОСТ 9586-75

     Секундомер по ГОСТ 5072-79 тип СОС пр. 2Б-2 кл.2

     Аспирационный психрометр по ГОСТ 6353-52 тип МВ-4М

     Барометр мембранный метеорологический по ГОСТ 23696-79

     Термостат электрический суховоздушный по ТУ 64-1-1382-76 тип ТС

     Шкаф сушильный электрический круглый по ТУ 64-1-1411-81

     Микроскоп биологический по ГОСТ 8284-79 тип МБИ-3

     Лупа с увеличением 10(х) по ГОСТ 25706-83

     Спиртовка лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336-82

     Чашки биологические (Чашки Петри) по ГОСТ 25336-82

     Пробирки стеклянные по ГОСТ 10515-80 тип ПБ

     Пипетки на 1, 5, 10 мл по ГОСТ 20292-74

     Стекло предметное по ГОСТ 9284-75

     Стекло покровное по ГОСТ 6672-75

     Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76

     Весы лабораторные равноплечие по ТУ 25-06.385-80 3 кл. ВЛР-1 кг

3.2. Реактивы

     Мясо-пептонный бульон по ГОСТ 20730-75

     Агар микробиологический по ГОСТ 17206-84

     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72

     Пептон сухой ферментативный по ГОСТ 13805-76

     Физиологический раствор (0,85% раствор хлористого натрия)

     Глюкоза по ГОСТ 6038-79

     Калий фосфорнокислый двузамещенный по ГОСТ 2493-75

     Натрий хлористый по ГОСТ 4233-74

     Калий гидроокись по ГОСТ 6-01-301-74

     Альфа-нафтол по ГОСТ 5838-79

     Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300-72

     Малахитовый зеленый по ТУ 6-09-1551-77

     Метиленовая синь Леффлера по ТУ 6-09-2044-77

     Пиронин (Сафронин) по ТУ 6-09-2047-77

     Иммерсионное масло по СТУ 81-05-79-69

     Вазелин по ОСТ 18-91-72

3.3. Питательные среды, растворы и их рецептура

Желточный агар: к 500 мл мясо-пептонного питательного агара, охлажденного до 45°С, добавляют эмульсию 2-х яичных желтков в 10 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Мясо-пептонный агар: мясо-пептонный бульон - 1 л, агар - 20 гр, рН устанавливают 7,2 - 7,4 и разливают во флаконы. Стерилизация при 120°С 20 минут. Второй рецепт: питательный агар заводского изготовления - 1 л готовят по прописи на этикетке, мясо-пептонный бульон - 0,5 л, рН 7,2 - 7,4.

Глюкозо-фосфатный бульон Кларка: вода дистиллированная - 100 мл, пептон - 0,5 г, глюкоза - 0,5 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,5 г, натрий хлористый - 0,5 г. Смесь разливают в пробирки с ватными пробками по 10 мл среды, рН среды 7,4. Стерилизация при 112°С 15 минут.

Эмульсия яичных желтков: физиологический раствор - 10 мл, желток - 2-х яиц. Тщательно перемешивают.

4.1. Подготовка посуды

Для анализа используют чашки Петри, входящие в пазы подвижного диска пробоотборного аппарата (наружный диаметр чашки 100+-2 мм, высота 20+-2 мм). Перед использованием чистые чашки Петри и пробирки с ватными пробками упаковывают в бумагу или пенал и стерилизуют в сушильном шкафу при 160°С 1,5 - 2,0 часа или автоклаве при 1 атм 15 - 20 минут.

4.2. Подготовка питательного субстрата

Питательные среды приготавливают в соответствии с пунктом 3.3. Желточный агар разливают в стерильные чашки Петри, расположенные на строго горизонтальной поверхности, до покрытия всей поверхности дна чашки Петри тонким, не более 2 - 3 мм, слоем. На дне чашки отмечают наименования среды.

4.3. Подготовка прибора к работе

Прибор протирают чистой мягкой тряпкой, проверяют предохранитель, сетевой шнур питания, вилку, держатели чашки Петри, замки крышки прибора.

Устанавливают прибор на ровной горизонтальной поверхности и подключают к электросети. Крышку прибора закрывают. Прибор включают и проверяют работу ротаметра, затем прибор выключают.

5.1. Контроль микробиологической обсемененности воздушной среды предприятий осуществляют в точках согласно приложения N 6 "Точки контроля микробной обсемененности воздушной среды предприятий" ОСТа 59.01.003.01-80.

5.2. Прибор устанавливают в точке контроля на ровной горизонтальной поверхности в зоне дыхания на высоте 1,5 м.

5.3. Перед отбором пробы воздуха, в каждой контрольной точке, протирают спиртом наружную и внутреннюю стороны крышки прибора, поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора.

5.4. Прибор подключают к электросети. На подвижный диск устанавливают чашку Петри со стерильной и питательной средой, одновременно снимая с нее крышку, крышку прибора закрывают.

5.5. Запрещается соприкосновение крышки со средой.

5.6. Прибор включают, ротаметром устанавливают расход аспирируемого воздуха 30 л/мин. Одновременно с прибором включают секундомер для отсчета времени отбора пробы. Время аспирации воздуха зависит от предполагаемой концентрации искомой группы бактерий в воздухе, но не должно превышать 15 минут.

5.7. Прибор выключают, после остановки диска, открывают крышку прибора, быстро снимают чашку Петри и закрывают ее крышкой от данной чашки.

5.8. На дне чашки отмечают наименование точки контроля или ее номер, время суток и дату отбора пробы.

5.9. Одновременно с отбором пробы воздуха проводят измерения температуры и относительной влажности воздуха, давления окружающей среды. Отмечают отклонения в режиме работы технологического оборудования от регламента, условия отбора пробы.

5.10. Чашки Петри после отбора пробы воздуха помещают вверх дном в термостат при 28-30°С.

5.11. Идентификацию Bac. thuringiensis производят на основании морфологических особенностей колоний и клеток бактерий их образующих, наличия у последних подвижности, спор и кристаллов, способности продуцировать лецитиназу и ацетон.

5.12. Колонии просматривают через 24 и 48 часов. Отмечают морфологические признаки колоний, характерные для Bac. thuringiensis. На желточном агаре эти микроорганизмы образуют крупные серо-белые или кремового цвета, распластанные со слегка изрезанными краями без врастания в среду колонии. Окружение колонии зоной белого коагулянта указывает на способность культуры микроорганизмов продуцировать лецитиназу.

5.13. Выборочно из типичных и всех подозрительных колоний для группы Bac. thuringiensis приготавливают микроскопические физические препараты и окрашивают культуру по Граму.

5.14. Клетки Bac. thuringiensis имеют форму палочек с обрубленными или слегка закругленными концами, размером 2-7 х 0,8-2,0 мк, грам-положительные, подвижные перетрихи.

5.15. На основании признаков, указанных в п.5.12. и п.5.14. проводят предварительный количественный учет искомой группы бактерий.

5.16. Для выявления подвижности клеток бактерий и образования ими ацетоина небольшое количество исследуемой суточной культуры с агаризованной среды вносят в пробирки, соответственно, с мясо-пептонным бульоном и глюкозо-фосфатным бульоном Кларка. Пробирки помещают в термостат при 30°С.

5.17. Подвижность клеток определяют микроскопированием 18-ти часовой культуры, выращенной на мясо-пептонном бульоне. С этой целью каплю бульона культуры наносят на предметное стекло. Во избежание быстрого высыхания препарата края покровного стекла перед наложением на предметное стекло тонко смазывают вазелином. В поле зрения наблюдается характерное для Bac. thuringiensis перемещение клеток.

На мясо-пептонном бульоне искомая культура образует равномерную муть, хлопьевидный осадок белого цвета и пленку белого цвета на поверхности.

5.18. Образование ацетоина выявляют реакцией Фогес-Проскауэра. Для этого к 1 мл 24-часовой культуры, выращенной на глюкозо-фосфатном бульоне, добавляют 0,6 мл 6% раствора альфа-нафтола и 0,2 мл 40% раствора едкого калия. Пробирки хорошо встряхивают и помещают на 1 час в термостат при 30°С. Розовое или рубино-красное окрашивание среды указывает на образование ацетоина.

5.19. Через 48 часов инкубации культуры на агаризованной среде в чашке Петри проводят выявление спор и кристаллов. Микроскопический препарат готовят внесением в каплю дистиллированной воды нанесенной на предметное стекло культуры микроорганизмов и тщательным ее распределением на поверхности стекла на площади 1 см2. Затем мазок высушивают на воздухе и фиксируют сухим жаром, проводя 2 - 4 раза над пламенем горелки, и окрашивают по методу Пешкова в модификации Моторной. С этой целью мазок покрывают метиленовой синью Леффлера и в течении 3 минут держат над пламенем до появления паров, затем краску смывают водопроводной водой, добавляют пиронин (сафронин) и выдерживают 1 минуту, затем снова промывают водой. При микроскопировании препарата споры голубого цвета, а кристаллы - красного.

Споры у Bac. thuringiensis овальной, эллипсовидной или сферической формы, расположены в клетке центрально или субтерминально. Размер спор 0,7-0,9 х 1,5-1,9 мк. Кристаллические включения могу быть разнообразными по форме и размерам: 0,4-0,8 х 1,0-1,4 мк. Чаще всего кристаллы представляют собой восьмигранники с ромбовидной поверхностью. Споры и кристаллы в культуре представляют собой обычно отдельные друг от друга образования, освобожденные из лизирующей клетки.

5.20. После подтверждения указанными основными тестами принадлежности культур к Bac. thuringiensis проводят окончательный учет колоний, образованных ими.

5.21. В качестве дополнительных тестов, при необходимости, изучают: протеолитические свойства - разжижение желатина, гидролиз казеина, уреазную активность, гидролиз крахмала, образование эскулитина и ферментацию сахаров и спиртов на средах Гисса (сахароза, силипин, манноза, целлобиоза).

5.22. Если рост Bac. thuringiensis на питательной среде в чашке Петри не выявлен, то это указывает на отсутствие активно развивающихся микроорганизмов этой группы в отобранном объеме воздуха. В этом случае общий объем анализируемого воздуха одноразовых, последовательно отобранных проб в одной точке должен быть на менее 1 м3.

6.1. Определяют действительный расход воздуха (Q) по формуле:

     Q        = Q  - дельта                                           (1)

      действ.    0          Q

     Величина поправки расхода воздуха (дельта Q) к показаниям  ротаметра

прибора будет

                             гамма      -  гамма

                                   раб.          кал.

     дельта Q = Q  ---------------------------------------------

                 0  2 гамма      +  1,5 (гамма      - гамма     )     (2)

                            кал.               раб.         кал.

     где:

         дельта Q   - величина поправки  расхода  воздуха  к   показаниям

                      ротаметра прибора;

         Q          - величина расхода    воздуха,    определяемая     по

          0           показаниям ротаметра, л/мин;

         гамма      - плотность воздуха при  работе  с  прибором,  кг/м3.

               раб.   Определяется по  таблице (Справочное приложение) по

                      величине температуры (погрешность +-1°С) и давлению

                      (+-0,1 кПа) окружающей среды;

         гамма      - плотность воздуха при калибровке ротаметра,  кг/м3.

               кал.   Определяется по  таблице (Справочное приложение) по

                      величине температуры  и   давлению,   при   которых

                      осуществляется градуировка    ротаметра    прибора,

                      указанные в инструкции по его эксплуатации.

6.2. Погрешность показания ротаметра прибора не превышает 5% максимального значения шкалы ротаметра при температуре окружающей среды от +10 до +30°С, относительной влажности 65+-15%, атмосферном давлении 99,9+-3,9 кПа.

6.3. Общий объем аспирируемого воздуха равен произведению объема воздуха, проходящего через прибор, на время его отбора.

6.4. Результаты измерения оценивают по величине концентрации клеток микроорганизмов в 1 м3 воздуха рабочей зоны, равной отношению произведения количества выросших на питательной среде в чашках Петри колоний Bac. thuringiensis на 1000 к общему действительному объему аспирируемого воздуха.

6.5. Полученные результаты подвергаются статистической обработке в соответствии со статистическими методами обработки лабораторных и экспериментальных данных (Марков А.М., Поляков Л.Е. Санитарная статистика. Л., Медицина, 1974, с.61-72).

6.6. Пример расчета

Через прибор пропускают воздух с расходом 30 л/мин (Q0) в течение 2-х минут (t); число выросших колоний, образованных Bac. thuringiensis - 180 (n).

Условия отбора проб воздуха: температура окружающей среды +16°С и давление 760 мм.рт.ст. (101,33 кПа).

В описании к прибору, указаны условия градуировки ротаметра, например, 22°С и давление 760 мм.рт.ст. (101,33 кПа).

Количество бактерий в КСЕ/м3 воздуха** равно:

             n х 1000

     Х = ------------------

         (Q  - дельта ) х t                                           (3)

           0         Q

Для проведения расчета необходимо вычислить дельта Q. Предварительно по таблице "Плотность воздуха в кг/м3" находим величину плотности воздуха при работе с прибором (гамма раб.) и при калибровке ротаметра прибора (гамма кал.) и подставляем в формулу (2).

                            1,21 - 1,18               0,03

     дельта Q = 30 х --------------------------- = ------------ =  0,012

                     2 х 1,8 + 1,5 (1,21 - 1,18)   2,36 + 0,045

     Количество Bac. thuringiensis в воздухе равно по формуле (3).

            180 х 1000

     Х = ---------------- = 3001,21 КОЕ/м3

         (30 - 0,012) х 2

7.1. При работе с неидентифицированными микроорганизмами необходимо руководствоваться "Инструкцией по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий отрасли", согласованной с ЦК профсоюза рабочих химической и нефтехимической промышленности (Пост. секретариата от 30.08.77 г., протокол N 7) и утвержденной Главным управлением микробиологической промышленности при Совете Министров СССР 29 июня 1977 года.

7.2. При практическом применении прибора для бактериологического анализа воздуха необходимо применять следующие меры безопасности: замену предохранителей и щеток электродвигателя производить только при выключенном приборе; прибор не заземлять, так как он выполнен по классу защиты II (ГОСТ 12.2.025-76); не включать прибор при открытой крышке; не открывать крышку прибора до полной остановки двигателя.

7.3. При работе с автоклавом следует руководствоваться "Правилами по эксплуатации и техники безопасности при работе на автоклавах", утвержденными Министерством здравоохранения СССР 30 марта 1971 года.