Вход
Методические указания МУК 2.3.2.721-98 "2.3.2. Пищевые продукты и пищевые добавки. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище" (утв. Главным Государственным санитарным врачом РФ 15 октября 1998 г.)
-
Приложения к разделу "Нутрицевтики"
-
Приложение N 1. Биологически активные добавки к пище - источники белка и аминокислот
-
Приложение N 2. Биологически активные добавки к пище - источники липидов (эссенциальные и неэссенциальные липидные компоненты пищи)
-
Приложение N 3. Биологически активные добавки к пище - источники углеводов
-
Приложение N 4. Биологически активные добавки к пище - источники витаминов
-
Приложение N 5. Биологически активные добавки к пище - источники минеральных веществ
-
Приложение N 6. Оценка эффективности биологически активных добавок к пище, содержащих железо
-
Приложение N 7. Биологические активные добавки к пище, способствующие выведению из организма чужеродных и токсичных веществ, продуктов обмена веществ
-
Приложения к разделу "Парафармацевтики"
-
Приложение N 1. Оценка эффективности биологически активных добавок к пище, применяемых в качестве ингибиторов образования N-нитрозаминов
-
Приложение N 2. Оценка влияния биологически активных добавок к пище, предлагаемых в качестве защитных средств от ионизирующего излучения
-
Приложение N 3. Оценка эффективности БАД к пище, рекомендуемых для профилактики и вспомогательной терапии при заболеваниях печени
-
Приложение N 4. Оценка эффективности БАД к пище, рекомендуемых для профилактики и в качестве вспомогательных средств при лечении сердечно-сосудистых заболеваний
-
Приложение 1. Определение содержания эфедрина
Методические указания МУК 2.3.2.721-98
"2.3.2. Пищевые продукты и пищевые добавки.
Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище"
(утв. Главным Государственным санитарным врачом РФ 15 октября 1998 г.)
Дата введения: 1 января 1999 г.
ГАРАНТ:
См. Методические рекомендации МР 2.3.1.1915-04 "Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ", утвержденные Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 2 июля 2004 г.
См. санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.1290-03 "Гигиенические требования к организации производства и оборота биологически активных добавок к пище (БАД)", утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17 апреля 2003 г.
1. Область применения
1.1. Методические указания предназначены для органов государственной исполнительной власти и органов местного самоуправления, предприятий, организаций, учреждений и иных юридических лиц (далее - организации), граждан предпринимателей без образования юридического лица, должностных лиц и граждан, деятельность которых осуществляется в области обращения БАД, для организаций санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации (далее - госсанэпидслужбы России), осуществляющих государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также для других организаций, уполномоченных на осуществление государственного контроля за безопасностью и эффективностью БАД.
1.2. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях в отношении биологически активных добавок к пище, применяются на этапах экспертизы и регистрации биологически активных добавок к пище, а также при разработке и постановке их на производство, промышленном производстве, хранении, транспортировании, закупке, ввозе в страну и реализации (далее - при обращении БАД), при разработке нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.
1.3. За качество, безопасность, заявленные свойства, эффективность и рекламу выпускаемой биологически активной добавки к пище полную ответственность несет производитель.
1.4. Гигиенические требования к веществам, материалам, в том числе вспомогательным и упаковочным, контактирующим с биологически активной добавкой к пище, устанавливаются специальными санитарными правилами и нормами.
2. Нормативные ссылки
2.1. Закон РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 19 апреля 1991 года.
2.2. "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" от 22 июля 1993 года.
2.3. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" и Кодекс РСФСР об административных правонарушениях" от 9 января 1996 года.
2.4. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 года N 625.
2.5. Положение о Государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июля 1998 г. N 680.
2.6. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации N 117 от 15.04.97 "О порядке экспертизы и гигиенической сертификации биологически активных добавок к пище".
2.7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации N 21 от 15.09.97 "О государственной регистрации биологически активных добавок к пище".
3. Термины и определения
Пищевые продукты - продукты, используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде.
Биологически активные добавки к пище - композиции натуральных или идентичных натуральным биологически активных веществ, предназначенных для непосредственного приема с пищей или введения в состав пищевых продуктов с целью обогащения рациона отдельными пищевыми или биологически активными веществами и их комплексами.
Нутрицевтики - биологически активные добавки к пище, применяемые для коррекции химического состава пищи человека (дополнительные источники нутриентов: белка, аминокислот, жиров, углеводов, витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон).
Парафармацевтики - биологически активные добавки к пище, применяемые для профилактики, вспомогательной терапии и поддержки в физиологических границах функциональной активности органов и систем.
Качество биологически активных добавок к пище - совокупность характеристик, которые обусловливают потребительские свойства, эффективность и безопасность биологически активных добавок к пище.
Безопасность биологически активных добавок к пище - отсутствие опасности для жизни и здоровья людей нынешнего и будущих поколений.
Эубиотики - биологически активные добавки к пище, в состав которых входят живые микроорганизмы и (или) их метаболиты, оказывающие нормализующее воздействие на состав и биологическую активность микрофлоры пищеварительного тракта. Пробиотики - синоним понятия эубиотики.
4. Общие положения
4.1. Методические указания "Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище" (далее по тексту используются сокращенные термины - методические указания и БАД) устанавливают гигиенические требования по определению безопасности и эффективности для человека биологически активных добавок к пище и сырья для их производства, а также требования по соблюдению указанных нормативов при разработке нормативной и технической документации на них и обращения БАД.
4.2. Настоящие методические указания разработаны на основании закона РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", "Основ законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан", федерального закона "О внесении изменений и дополнений в закон Российской Федерации "О защите прав потребителей", Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положения о Государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, Приказа Минздрава России N 117 от 15.04.97 "О порядке экспертизы и гигиенической сертификации биологически активных добавок к пище", Постановления Главного государственного санитарного врача Российской Федерации N 21 от 15.09.97 "О государственной регистрации биологически активных добавок к пище".
4.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого, научно-обоснованного подхода к оценке эффективности и безопасности биологически активных добавок к пище на этапах разработки, экспертизы, регистрации и обращения БАД.
4.4. Требования настоящих методических указаний должны выполняться при разработке государственных стандартов, нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.
Проекты нормативной и технической документации должны быть согласованы с организациями госсанэпидслужбы России в соответствии с утвержденным порядком.
4.5. Гигиеническая экспертиза биологически активных добавок к пище проводится специально уполномоченными организациями в порядке, утвержденном Министерством здравоохранения Российской Федерации, на основании нормативных и методических документов Государственной системы санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации.
4.6. При разработке новых видов биологически активных добавок к пище и их усовершенствовании, а также при разработке (изменении) технологических процессов юридическими лицами, осуществляющими разработку, обеспечивается обоснование их соответствия заявленным медико-биологическим эффектам, срокам годности, показателям качества и безопасности продукции, требованиям по их соблюдению на этапах обращения, а также методам контроля.
4.7. Разработчик новой биологически активной добавки к пище и (или) ее производитель обязаны включить в нормативную и техническую документацию показатели ее качества и безопасности, гигиенические нормативы, требования по обеспечению указанных нормативов в процессе производства, хранения, транспортирования и реализации продукции, а также требования к ее упаковке и маркировке, срок годности и методы контроля качества и безопасности продукции.
4.7.1. Производство биологически активных добавок к пище должно осуществляться в соответствии с нормативной и технической документацией и отвечать требованиям санитарных правил и норм в области обеспечения качества и безопасности.
4.7.2. Качество и безопасность каждой партии (серии) биологически активных добавок к пище подтверждается производителем в удостоверении о качестве.
4.8. Постановка на производство новых биологически активных добавок к пище, производство БАД допускается только после проведения регистрации данной биологически активной добавки к пище в соответствии с процедурой, устанавливаемой Министерством здравоохранения Российской Федерации.
4.9. Постановка на производство биологически активных добавок к пище, не являющихся новыми, но впервые осваиваемых на предприятии, допускается только при наличии:
- регистрационного удостоверения на данные БАД;
- гигиенического заключения, выданного уполномоченными организациями госсанэпидслужбы России о соответствии условий производства санитарным правилам и нормам, требованиям по обеспечению качества и безопасности БАД, установленным в технической документации, а также регламентируемыми в "Регистрационном удостоверении".
4.10. Импортируемые на территорию Российской Федерации биологически активные добавки к пище должны отвечать требованиям действующих в Российской Федерации санитарных правил и гигиенических нормативов, если иное не оговорено международными соглашениями.
4.10.1. Безопасность и эффективность импортируемых БАД к пище определяется на основании гигиенической экспертизы конкретного вида импортируемой продукции и оценке ее соответствия действующим санитарным правилам и гигиеническим нормативам Российской Федерации с учетом соответствия БАД требованиям безопасности, установленным для такой продукции в стране ее происхождения.
4.10.2. Показатели качества и безопасности, гигиенические нормативы, которым соответствует предполагаемый к ввозу вид БАД и которым должна соответствовать импортируемая в страну продукция, устанавливаются в Регистрационном удостоверении.
4.10.3. Организации, осуществляющие производство и поставку импортируемых на территорию Российской Федерации биологически активных добавок к пище, обязаны зарегистрировать их в соответствии с правилами и процедурой, установленной Министерством здравоохранения Российской Федерации до ввоза на территорию Российской Федерации.
4.11. Организации, осуществляющие деятельность в области обращения биологически активных добавок к пище, несут ответственность за обеспечение качества и безопасности БАД. Они обязаны проводить мероприятия, направленные на выполнение требований санитарных правил и гигиенических нормативов, технической документации по обеспечению условий производства, транспортирования, хранения и реализации БАД.
4.12. Расфасовка и упаковка биологически активных добавок к пище должны обеспечивать сохранение их качества и безопасности на всех этапах обращения продукции.
4.13. Производитель биологически активных добавок к пище, предназначенных для реализации на территории Российской Федерации, должен выпускать их маркированными в соответствии с законодательством Российской Федерации и нормативной документацией, регламентирующей вопросы маркировки продукции.
4.13.1. Расфасованные и упакованные биологически активные добавки к пище должны иметь этикетки, на которых на русском языке указывается:
- наименование продукта и его вид;
- номер технических условий (для отечественных БАД);
- область применения;
- название организации-изготовителя и ее юридический адрес (для импортируемых на территорию Российской Федерации продуктов - страна происхождения и наименование фирмы изготовителя);
- вес и объем продукта;
- наименование входящих в состав продуктов ингредиентов, включая пищевые добавки;
- пищевая ценность (калорийность, белки, жиры, углеводы, витамины, микроэлементы);
- условия хранения;
- срок годности и дата изготовления;
- способ применения (в случае, если требуется дополнительная подготовка БАД);
- рекомендации по применению, дозировка;
- противопоказания к использованию и побочные действия (при необходимости);
- особые условия реализации (при необходимости).
4.13.2. Рекомендации по применению биологически активных добавок к пище должны быть составлены на основе экспериментального изучения БАД и клинических испытаний и содержать сведения о дозировке БАД, курсе приема препарата, противопоказаниях и побочных эффектах.
ГАРАНТ:
О противопоказаниях для применения товаров при отдельных видах заболеваний см. постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 27 августа 1997 г. N 19
4.14. Организация, осуществляющая реализацию биологически активных добавок к пище, обязана обеспечить условия реализации в соответствии с согласованными при регистрации регламентами, а также санитарными правилами и нормами в области обеспечения ее безопасности.
4.14.1. Не допускается реализация биологически активных добавок к пище:
- не соответствующих санитарным правилам и нормам в области обеспечения качества и безопасности;
- без удостоверения о качестве;
- с истекшим сроком годности;
- при отсутствии надлежащих условий реализации;
- без информации о проведении обязательной регистрации БАД;
- без этикетки, а также в случае, когда информация на этикетке не соответствует информации, согласованной при регистрации;
- идентифицировать которые не представляется возможным.
4.15. Не допускается использование при производстве БАД к пище растительного сырья и продукции животноводства, полученных с применением генной инженерии (трансгенных продуктов), без разрешения на то Министерства здравоохранения Российской Федерации.
4.16. Фирма-изготовитель должна гарантировать, что животноводческое сырье, использованное для производства биологически активных добавок к пище, получено из хозяйств, не регистрировавших прионовых заболеваний, и свободно от других возбудителей, потенциально опасных для человека. В целях снижения риска передачи агентов прионовых заболеваний (Bovine Spongiform Encephalopathy - BSE) через биологически активные добавки к пище рекомендуется везде, где это возможно, запретить в качестве источника биологического сырья материалы риска. Решением Комиссии ЕС "EU Commission Decision of Juli 30th, 1997 (97/534/EC) 75/320/EEC on prohibition of the use of material presenting risks as regard of transmissible spongioforme encephalopaties" определены материалы риска:
а) череп, включая мозг и глаза, небные миндалины и спинной мозг быков (коров) старше 12 месяцев, коз (козлов), овец (баранов) старше 12 месяцев или имеющих коренные резцы, прорезывающиеся сквозь десны;
б) селезенка овец (баранов) и коз (козлов).
При ввозе биологически активных добавок к пище, изготовленных из сырья животного происхождения, должна приниматься во внимание эпидемиологическая ситуация по BSE в стране фирмы-изготовителя.
4.17. Производство, ввоз в страну, хранение, транспортирование и реализация населению биологически активных добавок к пище, не соответствующих нормативам качества и безопасности, утвержденным в установленном порядке, не допускается.
4.18. Для проведения лабораторных исследований (измерений) качества и безопасности пищевой продукции допускаются метрологически аттестованные методики, соответствующие требованиям ГОСТов 8.010-90 и 8.556-91, установленные значения показателей погрешности которых не превышают норм погрешности по ГОСТу 27384-87, а также методики, утвержденные или допущенные к применению госсанэпидслужбой России.
Для определения эффективности биологически активных добавок к пище используются методы, указанные в данных методических указаниях.
4.19. Качество, безопасность биологически активных добавок к пище и способность их оказывать декларируемый изготовителем эффект определяются соответствием их гигиеническим нормативам, установленным СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" и настоящими методическими указаниями.
4.20. Органолептические свойства биологически активных добавок к пище определяются показателями вкуса, цвета, запаха и консистенции, установленными производителем и характерными для каждого вида продукции.
4.21. Требования, которым должны соответствовать органолептические свойства биологически активных добавок к пище, устанавливаются в нормативной и технической документации на их производство.
4.22. Гигиенические нормативы включают химические соединения и биологические объекты, присутствие которых в пищевой продукции не должно превышать допустимых уровней их содержания в заданной массе (объеме) исследуемой продукции.
4.23. В биологически активных добавках к пище регламентируется содержание основных действующих веществ.
4.24. При получении неудовлетворительных результатов анализа хотя бы по одному из показателей, по нему проводят повторный анализ удвоенного объема выборки, взятого из той же партии.
5. Порядок гигиенической экспертизы, государственной регистрации и перерегистрации биологически активных добавок к пище
5.1. Проведение гигиенической экспертизы и регистрации биологически активных добавок к пище осуществляется в соответствии с порядком, установленным Министерством здравоохранения Российской Федерации.
ГАРАНТ:
См. постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 15 августа 2003 г. N 146 о санитарно-эпидемиологической экспертизе биологически активных добавок
См. Положение о проведении гигиенической экспертизы и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников, утвержденное постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 6 апреля 1999 г. N 7
5.2. Гигиеническая экспертиза и регистрация биологически активных добавок к пище включает следующие процедуры:
- первичную экспертную оценку документов и материалов, характеризующих данную продукцию;
- определение потребности в проведении необходимых исследований;
- проведение комплекса необходимых санитарно-химических, санитарно-микробиологических и других видов исследований;
- экспериментальные исследования токсикологических, физиологических и метаболических эффектов, подтверждающие заявленный профиль БАД;
- клиническую оценку эффективности;
- комплексную экспертную оценку результатов с учетом полученных в ходе исследований данных;
- оформление регистрационного удостоверения на биологически активную добавку к пище, присвоение номера, включение в реестр.
5.3. Для проведения работ по гигиенической экспертизе и регистрации биологически активных добавок к пище ее производитель, поставщик или полномочный представитель представляют следующие документы:
- заявку установленной формы с указанием полных реквизитов производителя и поставщика БАД;
- акт отбора проб установленной формы, в котором указывается дата, место отбора образцов, их количество, наименование продукции, юридический адрес предприятия-изготовителя, дата производства БАД, фамилии, должности и подписи лиц, отбиравших образцы;
- при наличии посредника - доверенность от производителя на проведение работ по регистрации биологически активной добавки к пище с указанием получателя регистрационного удостоверения и его владельца;
- образцы биологически активных добавок к пище в количестве, определенном действующим порядком экспертизы. В случае проведения токсикологических или клинических испытаний количество необходимых образцов определяется дополнительно.
5.3.1. Для биологически активных добавок к пище, производимых в России, представляются:
- нормативная или техническая документация (технические условия, технологическая инструкция, рецептура), оформленная в соответствии с установленной формой;
- пояснительная записка, описывающая биологически активную добавку к пище, область ее применения, рекомендации по применению, противопоказания, ограничения по применению БАД при их наличии;
- потребительская этикетка или ее проект, заверенный производителем;
- инструкция по применению с указанием доз, сроков и способов употребления БАД, заверенную производителем;
- материалы (оригинальные и литературные для аналогов) по токсиколого-гигиенической и биологической оценке БАД и ее клинической оценке;
- санитарно-гигиеническая характеристика производства, выданная центром госсанэпиднадзора по месту производства БАД.
5.3.2. Для импортируемых биологически активных добавок к пище представляются:
- сертификаты качества и безопасности фирмы-изготовителя, содержащие данные о показателях безопасности, ингредиентный состав и его характеристику, сроки годности, условия хранения;
- для БАД, содержащих части растения, указывается их ботаническое название на латинском языке и форма (экстракт, настой и т.п.);
- документы официально уполномоченного органа страны-экспортера, подтверждающие безопасность данной продукции и ее эффективность, документ о регистрации;
- краткие сведения о технологии производства, стандарт предприятия на выпуск БАД;
- пояснительная записка, описывающая биологически активную добавку к пище, область ее применения, рекомендации по применению, противопоказания, ограничения по применению БАД при их наличии;
- потребительская этикетка или ее проект, заверенная производителем;
- инструкция по применению с указанием доз, сроков и способов употребления БАД, заверенная производителем продукции;
- материалы (оригинальные и литературные для аналогов) по токсиколого-гигиенической и биологической оценке БАД и ее клинической эффективности, протоколы или заверенные копии результатов клинических испытаний, в которых указаны учреждения, проводившие эти испытания, схема проведения испытаний и результаты в сравнении с контрольной группой;
- гигиенический сертификат, в котором указывается, что производство данной продукции осуществляется в соответствии с национальными и/или международными требованиями для БАД к пище (требования GMP - Good manifacture practice, стандартам Международной организации стандартизации - ISO 9000, 9001, 9002); или Сертификата национальных и/или международной ("EuroNett") организаций о соответствии производства БАД стандартам ISO 9000 - 9002. Декларация фирмы изготовителя о соответствии производства указанным выше требованиям ISO может быть представлена в виде специальных знаков на бланках фирмы.
Все материалы представляются в оригинале и (или) нотариально заверенные копии, и в переводе на русский язык.
5.4. Проведение исследований осуществляется в учреждениях и лабораториях, аккредитованных в установленном порядке в "Системе аккредитаций лабораторий центров государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации".
5.5. По результатам проведенной работы готовится экспертное заключение.
5.6. В случае отсутствия или непредставления необходимых документов, наличия в составе БАД неразрешенных компонентов или лекарственного сырья, не разрешенного в Российской Федерации, содержания сильнодействующих компонентов, являющихся лекарственными средствами в терапевтических дозах, может быть принято решение об отказе в регистрации.
5.7. При экспертизе биологически активных добавок к пище, предназначенных для детей, необходимо учитывать следующие факторы:
- БАД для детей первых трех лет жизни не должен содержать ароматизаторы, консерванты и стабилизаторы;
- БАД для детей могут включать только биологически активные соединения, которые разрешены для использования детьми соответствующего возраста.
5.8. Перерегистрация биологически активных добавок к пище осуществляется в соответствии с порядком, установленным Министерством здравоохранения Российской Федерации.
5.8.1. Основанием для перерегистрации биологически активных добавок к пище является:
- окончание срока действия ранее выданного регистрационного удостоверения;
- изменение формы выпуска БАД;
- изменение области применения и рекомендаций по использованию БАД;
- изменение наименования, смена торговой марки фирмы-изготовителя;
- изменение гигиенических требований к БАД;
- изменение противопоказаний и ограничений по применению БАД;
- внесение изменений в нормативную и техническую документацию на БАД.
5.8.2. Для перерегистрации БАД ее производитель, поставщик или полномочный представитель представляет:
- заявку на перерегистрацию биологически активной добавки к пище с пояснительной запиской о причинах перерегистрации БАД до окончания срока действия "Регистрационного удостоверения";
- документы в соответствии с перечнем, установленным для регистрации БАД;
- промышленные образцы БАД;
- копию ранее выданного "Регистрационного удостоверения".
5.8.3. Для внесения изменений в область применения и рекомендации по использованию БАД необходимо представление данных клинико-эпидемиологических исследований, выполненных по программам, утвержденным в установленном порядке.
5.9. По итогам экспертизы уполномоченным учреждением госсанэпидслужбы России готовится регистрационное удостоверение или мотивированный отказ в адрес заявителя.
5.10. В случае обращения по поводу перерегистрации БАД, связанного с изменением или увеличением числа фирм-поставщиков, уполномоченным учреждением госсанэпидслужбы России - Федеральным центром ГСЭН МЗ РФ в порядке, установленном Минздравом России, выдается документ, подтверждающий право поставки и реализации данной БАД на территории Российской Федерации. Вышеуказанный документ выдается только при наличии доверенности от фирмы-изготовителя, подтверждающей права фирмы-поставщика на право распространения данной БАД.
5.11. При выдаче "Регистрационного удостоверения" на отечественный БАД, уполномоченное учреждение госсанэпидслужбы России направляет информацию в территориальный центр госсанэпиднадзора по месту его производства (разработки) для осуществления госсанэпиднадзора за соблюдением установленных требований при обращении БАД.
6. Гигиеническая характеристика производства биологически активных добавок к пище
6.1. Гигиеническая оценка производства биологически активных добавок к пище осуществляется с целью проверки соответствия условий производства БАД действующим санитарным правилам и гигиеническим нормативам, организации производственно-технологического контроля за качеством и безопасностью сырья и готовой продукции.
6.2. Гигиеническая оценка производства БАД к пище осуществляется Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России, Федеральным центром ГСЭН МЗ РФ и территориальными центрами ГСЭН по месту производства БАД.
6.3. При проведении гигиенической оценки производств, расположенных на территории Российской Федерации, учитываются:
- наличие на предприятии необходимых условий для производства данного вида и объема БАД;
- возможное неблагоприятное влияние работы предприятия на условия проживания населения или на окружающую среду (рассматриваются: заключение по отводу земельного участка, санитарно-гигиеническое заключение по проекту строительства или реконструкции, вопросы очистки территории);
- состояние условий труда работающих на предприятии, соблюдение правил личной гигиены персоналом, наличие медицинской документации персонала;
- организация производственного контроля на предприятии за качеством исходного сырья, технологией производства и показателями безопасности конечной продукции;
- соответствие набора производственных помещений технологии производства данного вида БАД.
6.4. При проведении гигиенической оценки производств, расположенных за пределами Российской Федерации, учитываются:
- наличие на предприятии необходимых условий для производства данного вида БАД;
- осуществление производственного контроля за качеством исходного сырья, технологией производства и показателями безопасности конечной продукции;
- соответствие выпускаемой продукции требованиям санитарных правил и норм, действующих на территории Российской Федерации.
6.5. По результатам гигиенической оценки производства представляется заключение о соответствии условий производства БАД к пище требованиям санитарного законодательства Российской Федерации.
7. Порядок осуществления контроля за производством и реализацией БАД
7.1. За соответствием качества и безопасности биологически активных добавок к пище гигиеническим нормативам должен осуществляться производственный контроль, государственный и ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор.
7.2. Производственный контроль за соблюдением гигиенических нормативов качества и безопасности биологически активных добавок к пище осуществляют организации, действующие в сфере производства данной продукции. Порядок проведения производственного контроля определяется организацией в соответствии с требованиями нормативной и технической документации по рабочим программам и технической документации, согласованным с организациями госсанэпидслужбы России.
7.3. Государственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством и безопасностью биологически активных добавок к пище осуществляют организации госсанэпидслужбы России, ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор - организации санитарно-эпидемиологических служб федеральных органов исполнительной власти, на которые санитарным законодательством Российской Федерации возложены эти функции.
7.4. Организация производства биологически активных добавок к пище осуществляется при наличии заключения территориального ЦГСЭН о соответствии условий действующим требованиям санитарного законодательства и согласованным при регистрации регламентам, а также утвержденным и согласованным с органами госсанэпидслужбы России рабочим программам производственного контроля.
7.5. Центры госсанэпиднадзора в субъектах Российской Федерации и на транспорте осуществляют контроль за условиями производства и реализации БАД, соответствием этикетки на готовой продукции установленным требованиям и информации, заложенной в регистрационном удостоверении, проводят выборочный отбор проб и лабораторные исследования соответствия БАД установленным требованиям качества и безопасности, осуществляют контроль за условиями производства, поставки, хранения и реализации БАД.
7.5.1. По заявке производителя БАД, а также в соответствии с поручениями Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России и Федерального центра ГСЭН МЗ РФ осуществляют оценку состояния производства и производственно-технологического контроля качества и безопасности сырья и готовой продукции на функционирующих производствах, предполагаемых к открытию, применительно к производству БАД с составлением гигиенического заключения.
7.5.2. Осуществляют госсанэпиднадзор на производстве, при хранении на оптовых и розничных предприятиях, в торговле за соблюдением:
- условий производства, технологического и лабораторного контроля качества и безопасности сырья;
- условий хранения;
- порядка реализации;
- информации, выносимой на этикетку (соответствие ее данным "Регистрационного удостоверения"), соответствия рекламы БАД информации, согласованной при регистрации (по данным "Регистрационного удостоверения").
7.5.3. Проводят выборочный отбор проб и лабораторные исследования соответствия БАД установленным требованиям качества и безопасности.
7.5.4. При выявлении нарушений принимают меры в соответствии с законом Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии".
7.5.5. Направляют информацию в Федеральный центр ГСЭН о выявленных нарушениях, принятых мерах и результатах проведенной работы.
7.6. Биологически активные добавки к пище, качество которых не соответствует гигиеническим нормативам, изымаются из обращения их владельцем, а также по постановлению организаций, осуществляющих госсанэпиднадзор, и не подлежат реализации по целевому назначению. Изъятые БАД могут быть использованы в иных целях, утилизированы или уничтожены в соответствии с "Положением о проведении экспертизы некачественных и опасных продовольственного сырья и пищевых продуктов", утвержденным постановлением Правительства Российской Федерации от 29 сентября 1997 г. N 1263. Удостоверение отзывается в установленном порядке.
7.7. Обоснование возможных способов и условий использования, утилизации или уничтожения биологически активных добавок к пище проводится их владельцем по согласованию с органами, вынесшими постановление об их изъятии.
7.8. Использование, утилизация или уничтожение изъятой продукции осуществляется их владельцем или организацией (физическим лицом), которой владелец передает по договору выполнение этих работ.
7.9. Изъятая продукция до ее использования, утилизации или уничтожения подлежит хранению в отдельном помещении (резервуаре), на особом учете, с точным указанием ее количества, способов и условий использования, утилизации или уничтожения.
Ответственность за сохранность такой продукции несет владелец.
7.10. Биологически активные добавки к пище, подлежащие уничтожению, должны быть подвергнуты денатурации, способы, сроки и условия проведения которой определяются в каждом конкретном случае их владельцем по согласованию с организациями госсанэпиднадзора.
7.11. Владелец БАД представляет в органы, вынесшие постановление об изъятии, акт об ее использовании, утилизации или уничтожении.
7.12. Организации, осуществляющие госсанэпиднадзор, вынесшие постановление об изъятии из обращения биологически активных добавок, осуществляют контроль за ее использованием, утилизацией или уничтожением.
7.13. Реклама БАД в средствах массовой информации не должна противоречить материалам, согласованным при регистрации БАД.
Не допускается реклама БАД, не прошедших Государственную регистрацию в Министерстве здравоохранения Российской Федерации.
Не допускается реклама БАД как уникального, наиболее эффективного и безопасного в плане побочных эффектов средства.
Реклама не должна вводить в заблуждение потребителя относительно состава БАД к пище и ее эффективности.
Недопустимо в рекламе создавать впечатление, что природное происхождение сырья, используемого в составе БАД, является гарантией ее безопасности.
Реклама БАД не должна подрывать веру потребителей в эффективность других средств при профилактике и вспомогательной терапии.
Реклама БАД не должна создавать впечатление о ненужности участия врача при применении БАД, в особенности БАД парафармацевтической группы.
7.14. В случае выявления фактов несоответствия проводимой рекламы информации, содержащейся в "Регистрационном удостоверении", направляют материалы в территориальные органы государственного управления, уполномоченные осуществлять контроль за соблюдением закона "О рекламе".
8. Оценка БАД по санитарно-химическим показателям безопасности
| Показатель | Метод определения | Предел обнаружения |
Литературный источник |
| Цинк, медь, сви- нец, кадмий, олово, железо |
Атомно-абсорбционный | 1 мкг/кг | (1) |
| Ртуть | Колориметрический | 10 мкг/кг | (2) |
| Мышьяк | Колориметрический | 100 мкг/кг | (3) |
| Пестициды | Газо-жидкостная хромато- графия |
1 мкг/кг | (4) |
| Углеводороды | Оптические и хроматографи- ческие методы (ГЖХ, ВЭЖХ, ХМС) |
100 мкг/кг | (5) |
| Патулин | Хроматографический (ТСХ) | 10 мкг/кг | (76) |
| Афлатоксин М1 | Хроматографические ТСХ, ВЭЖХ |
0,3 мкг/кг 0,02 мкг/кг |
(6) |
| Афлатоксин В1 | Хроматографические ТСХ, ВЭЖХ |
1 мкг/кг 0,15 мкг/кг |
(6) |
| Зеараленон | Хроматографические ТСХ, ВЭЖХ |
100 мкг/кг 5 мкг/кг |
(8) |
| Дезоксиниваленол | Хроматографические ТСХ, ВЭЖХ |
200 мкг/кг 50 мкг/кг |
(8) |
| Т-2 токсин | Хроматографический ГЖХ |
50 мкг/кг | (9) |
| Нитриты | Титрометрический | 10 мг/кг | (78) |
| Нитрозамины | Флюориметрический, хемилюминисцентный |
1 мкг/кг 0,1 мкг/кг |
(77) |
| Остаточные коли- чества антибио- тиков |
Микробиологический | 0,01-0,5 ЕД/г |
(10) |
Все санитарно-химические показатели БАД должны соответствовать нормам, указанным в "Гигиенических требованиях к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" СанПиН 2.3.2.560-96(127).
9. Санитарно-микробиологический контроль безопасности и качества биологически активных добавок к пище
9.1. Биологически активные добавки к пище из растительного сырья, из сырья животного происхождения, поликомпонентные добавки с включением витаминов, микроэлементов, минерального сырья и т.д.
| Показатель | Документ |
| Количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов |
(11) |
| Бактерии группы кишечных палочек (колиформы) | (12) |
| Е.coli | (13) |
| S. aureus (коагулазоположительные стафилококки) | (14) |
| B. cereus | (15) |
| Патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы | (16) |
| Дрожжи | (17) |
| Плесневые грибы | (17) |
9.2. Биологически активные добавки к пище с эубиотическим действием на основе чистых культур микроорганизмов
| Показатель | Документ |
| Количество жизнеспособных клеток в культуре микроорганизма эубиотика |
(18) |
| Количество бифидобактерий в 1 г препарата типа бифидобак- терина |
(19) |
| Количество молочнокислых бактерий в 1 г препарата типа лактобактерина |
(20) |
| Бактерии группы кишечных палочек (колиформы) | (21) |
| S. aureus (коагулазоположительные стафилококки) | (22) |
| Патогенные микроорганизмы, в т. ч. сальмонеллы | (16) |
| Дрожжи | (17) |
| Плесневые грибы | (17) |
Название микроорганизма эубиотика в нормативной документации и в этикетной надписи должно быть указано на латинском языке с обозначением рода и вида микроорганизма.
9.3. Биологически активные добавки к пище смешанного состава (культуры эубиотиков, добавки различных нутриентов)
| Показатель | Документ |
| Контроль за количеством жизнеспособных микроорганизмов эубиотиков |
(21) |
| Бактерии группы кишечных палочек (колиформы) | (21) |
| Е.coli | (13) |
| S. aureus (коагулазоположительные стафилококки) | (22) |
| Патогенные микроорганизмы, в т. ч. сальмонеллы | (16) |
| Дрожжи | (17) |
| Плесневые грибы | (17) |
Конкретные микробиологические нормативы для различных групп биологически активных добавок к пище приведены в "Гигиенических требованиях к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" СанПиН 2.3.2.560-96 (127).
10. Радиологические показатели безопасности
Согласно "Гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов" СанПиН 2.3.2.560-96 для биологически активных добавок к пище, в состав которых входит растительное сырье, определяются радиологические показатели безопасности.
| Показатель | Допустимый уровень (не более) | Литературный источник |
| Цезий-137 | 200 Бк/кг | (156) |
| Стронций-90 | 100 Бк/кг | (157) |
Радиационная безопасность БАД к пище, загрязненной другими радионуклидами, определяется соответствием ее нормативам ГН 2.6.1.054-96 "Нормы радиационной безопасности (НРБ-96)".
11. Нутрицевтики
Биологически активные добавки к пище подразделяются на нутрицевтики и парафармацевтики (134). Нутрицевтики - биологически активные добавки к пище, применяемые для коррекции химического состава пищи человека, смысл применения которых заключается в том, чтобы довести содержание естественных эссенциальных макро- и микронутриентов до уровня их содержания в суточном рационе, соответствующем физиологической потребности здорового человека в них. В этой связи нутрицевтики - источники витаминов, полиненасыщенных жирных кислот, макро- и микроэлементов, пищевых волокон, других пищевых веществ в большем числе случаев не нуждаются в оценке их профилактической эффективности в эксперименте или в клинических наблюдениях, поскольку при экспертной оценке рецептур этих продуктов, заключение о возможной их эффективности эксперт может строить на основе общеизвестных литературных данных и учете рекомендованных доз компонентов нутрицевтика в сравнении с физиологической суточной потребностью в них здорового человека. Нутрицевтики подвергаются полной схеме исследований на определение в них декларируемых величин пищевых веществ и показателей безопасности.
Функциональная роль нутрицевтиков направлена на:
- восполнение дефицита эссенциальных пищевых веществ;
- направленные изменения метаболизма веществ;
- повышение неспецифической резистентности организма к действию неблагоприятных факторов окружающей среды;
- иммуномодулирующее действие;
- связывание и выведение ксенобиотиков;
- лечебное питание.
Конечной целью использования нутрицевтиков является улучшение пищевого статуса человека, укрепление здоровья и профилактика ряда заболеваний.
При проведении оценки безопасности и эффективности необходимо определить долю (в процентах) от суточной потребности, которая обеспечивается нутриентами, входящими в состав предлагаемой биологически активной добавки к пище при рекомендуемой дозе приема. Этикетка маркируется лишь теми величинами, значения которых превышают 5% (витамины и макро- и микроэлементы) или 2% (другие пищевые вещества и энергия). Содержание витаминов не должно превышать суточную потребность более чем в три раза для витаминов А, Д, В1, В2, В6, В12, ниацина, фолиевой кислоты, пантотеновой кислоты, биотина и не более чем в 10 раз - для витаминов Е и С*.
Средневзвешенные нормы физиологических потребностей
в пищевых веществах и энергии
| энергия | 2500 ккал |
| белок | 12% по калорийности или 75 г |
| жир | 30% по калорийности или 83 г |
| углеводы | 58% по калорийности или 363 г |
| пищевые волокна | 20,0 г |
| витамины: | |
| С (аскорбиновая кислота) | 60 - 70 мг |
| тиамин (В1) | 1,5 мг |
| рибофлавин (В2) | 2,0 мг |
| пиридоксин (В6) | 2,0 мг |
| цианокобаламин (В12) | 0,003 мг (3 мкг) |
| биотин | 0,15 мг (150 мкг) |
| пантотеновая кислота | 5 - 7 мг |
| фолиевая кислота | 0,2 мг (200 мкг) |
| ниацин РР | 20 мг |
| витамин А | 1 мг (3300 МЕ) |
| витамин Е | 10 мг |
| витамин Д | дети 400 МЕ (10 мкг), взрослые 100 МЕ (2,5 мкг) |
| микро- и макроэлементы: | |
| кальций | 800 мг/сутки |
| магний | 400 мг/сутки |
| фосфор | 1200 мг/сутки |
| железо | мужчины - 10 мг, женщины - 20 мг в сутки |
| медь | 2 мг |
| цинк | 15 мг |
| йод | 0,2 мг |
| эссенциальные жирные кислоты с расшифровкой семейства |
4% по калорийности или 11 г в сутки |
11.1. Типовая схема экспериментальной модели на лабораторных животных оценки эффективности и нутрицевтиков
В случае, если эффективность нутрицевтика не доказана, проводятся экспериментальные исследования на лабораторных животных. Типовая модель таких исследований представлена в таблице.
| Вид животных | Количество групп животных |
Количество животных в группе |
Продолжительность опыта |
Название групп |
| крысы, мыши, морские свинки, кролики и др. |
4 | 8 - 10 | 1 - 2 месяца | контроль опыт-1 опыт-2 опыт-3 |
Описание групп животных:
контроль - животные находятся на полноценном общевиварном или синтетическом рационе;
опыт-1 - модель дефицита изучаемого нутриента;
опыт-2 - модель дефицита изучаемого нутриента на фоне введения в рацион изучаемого нутрицевтика;
опыт-3 - животным вместе с кормом вводится испытываемый нутрицевтик в агравированной дозе.
Забой животных проводится через 1 - 2 месяца от начала введения испытуемого нутрицевтика. Проводится оценка интегральных показателей состояния животных (внешний вид, активность, масса тела, абсолютная и относительная масса внутренних органов). Специальные биохимические, гематологические, иммунологические и морфологические методы исследования в зависимости от состава испытуемого нутрицевтика изложены в приложениях.
12. Парафармацевтики
Парафармацевтики - биологически активные добавки к пище, применяемые для профилактики, вспомогательной терапии и поддержки в физиологических границах функциональной активности органов и систем.
Суточная доза парафармацевтика или, в случае композиции, суточная доза действующего начала парафармацевтика, не должна превышать разовую терапевтическую дозу, определенную при применении этих веществ в качестве лекарственных средств, при условии приема БАД не менее двух раз в сутки.
Все растения, входящие в состав парафармацевтика, должны быть проверены по отечественной и международной нормативной документации в плане разрешения их применения в пищевой промышленности, а также в составе лекарственных чаев и сборов в соответствии с требованиями: Российской Фармакопеи (61 - 62); зарубежных Фармакопей (68); Методических указаний о порядке доклинического и клинического изучения препаратов природного происхождения и гомеопатических лекарственных средств (Минздравмедпром Российской Федерации 08.04.94); Flavouring substance sand natural sources of flavourings, 111 ed, Council of Europe, 1981; Flavors and Fragrance Materials. A Worldwide reference list of materials used in compounding flavors and fragrances with sources of supply, 1993.
12.1. Показатели подлинности некоторых лекарственных растений, входящих в состав парафармацевтиков, и методы их определения
Растения, оказывающие влияние на центральную нервную систему
| Наименование растения | Показатель | Метод | Литературный источник |
| Женьшень (корень) | панаксозиды | ТСХ, КЦР | (62) |
| Аралия маньчжурская (корень) |
аралозиды А, В, С | ТСХ, ПМТ | (62) |
| Лимонник китайский (семена) |
эфирные масла | ГЖХ, ХМС, | (62, 67) |
| Золотой корень (родиола розовая) (корневище, корень) |
салидрозид (антрагликозид) |
ТСХ, СФ | (62) |
| Чай китайский (листья) | алкалоиды (кофе- ин, ксантин) |
ГЖХ | (71) |
| Валериана лекарственная (корневище, корень) |
эфирное масло бо- рниизовалерианат |
ГЖХ, ХМС | (65, 67) |
| Синюха голубая (корневище, корни) |
тритерпеновые сапонины |
КЦР | (62) |
| Душица обыкновенная (трава) |
эфирные масла | В, ГЖХ | (61, 62) |
| Пустырник пятилопастный (трава) |
флавоноиды, алка- лоиды (стахидрин) |
КЦР | (62) |
| Амми зубная (плоды) | флавоноиды (кел- лин) |
ХСФ | (63) |
| Пастернак посевной (плоды) |
фурокумарины | П, ФЛ | (63) |
| Вздутоплодник мохнатый (корневище, корни) |
дигидросамидин (пиранокумарины |
ГЖХ | (63) |
| Мята перечная (листья) | эфирное масло (ментол, ментон, пинен, лимонен) |
В, ГЖХ, ХМС | (61 - 67) |
Растения, применяемые при атеросклерозе
| Наименование растения | Показатель | Метод | Литературный источник |
| Боярышник кровавокрасный (цветки, плоды) |
флавоноиды (гиперозид) |
ХСФ | (62) |
| Роза коричная (шиповник) (плоды) |
витамин С | Т | (62) |
| Ламинария сахаристая (слоевище) |
йод | Т | (62) |
Растения, содержащие вещества, обладающие общеукрепляющим
и противовоспалительным действием
| Наименование растения | Показатель | Метод | Литературный источник |
| Ромашка аптечная (цветки) | эфирное масло | В, ГЖХ | (62) |
| Череда трехраздельная (трава) |
флавоноиды полисахариды |
ТСХ, К | (62) |
| Толокнянка обыкновенная (листья) |
фенольные глико- зиды (арбутин) |
Т | (62) |
| Календула лекарственная (цветки) |
каротин, ликопин | ХСФ | (72) |
| Сосна лесная (почки) | эфирное масло | В, ГЖХ, ХМС | (61, 65-67) |
| Девясил высокий (корневи- ще и корни) |
инулин | КЦР | (62) |
| Алтей лекарственный (корни) |
полисахариды (слизи) |
КЦР | (62) |
| Шалфей лекарственный (листья) |
эфирное масло (цинеол, туйон, сальвен) |
ГЖХ, ХМС | (65 - 67) |
| Зверобой продырявленный (трава) |
флавоноиды (рутин) |
СФ | (62) |
| Сушеница топяная (трава) | флавоноиды (гиафалозид А) |
В | (62) |
| Подорожник большой (листья) |
полисахариды (галактоуроновая кислота) |
В, КЦР | (62) |
Растения, оказывающие влияние на пищеварительную систему
| Наименование растения | Показатель | Метод | Литературный источник |
| Бессмертник песчаный (цветки) |
флавоноиды (изо- салилпурпозид) |
СФ, ХСФ | (69, 63) |
Растения, содержащие горечи
| Наименование растения | Показатель | Метод | Литературный источник |
| Одуванчик лекарственный (корни) |
инулин | КЦР | (62) |
| Золотысячник зонтичный (трава) |
горькие гликозиды (аллизарин) |
ХСФ | (62) |
| Вахта трилистная (листья) | горькие гликозиды флавоноиды (ру- тин) |
КЦР СФ |
(62) |
| Аир (корневище) | эфирное масло (каломен, камфен) |
В, ГЖХ, ХМС |
(61, 65-67) |
| Тмин обыкновенный (плоды) | эфирное масло (карвон, карвак- рон, лимонен) |
В, ГЖХ, ХМС |
(61, 65-67) |
Растения, обладающие слабительными,
закрепляющими и вяжущими свойствами
| Наименование растения | Показатель | Метод | Литературный источник |
| Лист сенны | производные ан- трацена (истизин) |
СФ | (62 - 63) |
| Крушина ольховидная (кора) |
производные ан- трацена |
СФ, ХСФ | (62) |
| Ревень тунгутский (корни) | производные ант- рацена (истизин) |
СФ | (62 - 63) |
| Стальник полевой (корни) | изофлавоноиды (ононин) |
ТСХ, СФ | (62) |
| Ольха серая (соплодия) | дубильные вещес- тва |
КЦР | (62) |
| Черемуха обыкновенная (плоды) |
дубильные вещест- ва амигдаллин |
КЦР | (62) |
| Дуб чешуйчатый (кора) | дубильные вещест- ва |
КЦР | (62) |
| Бадан толстолистый (корневище) |
дубильные вещест- ва |
КЦР | (62) |
Растения, обладающие диуретическими свойствами
| Наименование растения | Показатель | Метод | Литературный источник |
| Брусника (листья) | арбутин, дубиль- ные вещества |
КЦР | (62) |
| Можжевельник (плоды) | эфирное масло | В, ГЖХ | (62 - 63) |
| Марена красильная (корневище, корни) |
производные ан- трацена |
СФ | (62) |
| Василек синий посевной (цветки) |
антоцианы | СФ | (62) |
| Хвощ полевой (трава) | флавоновые глико- зиды |
ТСХ | (62 - 63) |
| Горец птичий спорыш (трава) |
флавоноиды (авикулярин) |
СФ, ТСХ | (62, 63) |
Сокращения: Б - биологический, БХ - бумажная хроматография, В - весовой, ГЖХ - газожидкостная хроматография, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, СФ - спектрофотометрия, ФЛ - флуориметрия, ХСФ - спектрофотометрический анализ с предварительным хроматографическим разделением образца, ТСХ - тонкослойная хроматография, П - полярография, ПТ - потенциометрическое титрование, Т - титрование, ХМС - хромато-масс-спектрометрия, КЦР - качественная цветная реакция.
12.2. Экспериментальное изучение функциональной активности парафармацевтиков
Физиологический уровень содержания действующих начал многих парафармацевтиков в клетках и тканях организма не известен (например, биогенные амины, олигопептиды, гликозиды, органические кислоты, сапонины и др.), равно как и не известна физиологическая потребность в них взрослого здорового человека. Более того, у достаточно большого количества таких БАД вообще не идентифицированы активные компоненты, т.е. действующие начала. Примером таких соединений могут служить экстракты, получаемые из сложных комплексов пищевых и лекарственных растений и других видов природного сырья. Отсутствие нормы количественного содержания в организме действующих веществ парафармацевтиков, а также физиологической потребности в них, в ряде случаев вызывает необходимость оценки их действия на организм в целом или отдельные его системы и органы, т.е. возникает задача исследования функциональной активности парафармацевтиков.
Назначение парафармацевтиков, состоящих из лекарственных растений с высоким уровнем содержания высокоактивных действующих начал без четко установленных доз и четкого знания механизмов действия, в ряде случаев может привести к тому, что реакции компенсаторно-адаптационного характера могут оказаться неадекватными: более сильными, чем нужно, или ослабленными. Это может стать причиной развития последующих патологических изменений в организме. Так, например, если при общем адаптационном синдроме секреция глюкокортикоидов окажется чрезмерной, они будут угнетать развитие иммунологических, неспецифических защитных реакций (воспаление), и тогда резко повышается риск развития огромного числа заболеваний, связанных с недостаточной функциональной активностью иммунной системы (135).
Целью данного раздела методических указаний является выявление влияния БАД-парафармацевтиков на показатели систем, участвующих в механизмах развития компенсаторно-приспособительных реакций, на основании которых можно было бы судить, в конечном счете, об эффективности некоторых видов БАД-парафармацевтиков, которая в большинстве случаев заключается в их профилактическом (в отношении развития патологических процессов) или общеукрепляющем действии.
Основные отличия БАД-парафармацевтиков от лекарств
а. БАД-парафармацевтики в большинстве случаев являются источниками природных компонентов пищи, не обладающих питательной ценностью, однако относящихся к незаменимым факторам питания - органическим компонентам пищевых и лекарственных растений, продуктов моря и компонентов животных тканей. Реже действующие начала БАД-парафармацевтиков могут быть получены биотехнологическими или химическими способами. К БАД-парафармацевтикам относятся и продукты, приготовленные на основе композиций микроорганизмов, предназначенные для нормализации и поддержания микробиоценоза (эубиотики/пробиотики). Действующие начала БАД-парафармацевтиков специфически поддерживают или регулируют в физиологических пределах функции отдельных органов и систем. Применяются исключительно "per os". Реализуются в свободной продаже как через специальные отделы продовольственных магазинов, так и через отделы безрецептурных средств аптек. При использовании БАД-парафармацевтиков в качестве вспомогательных средств при диетотерапии заболеваний человека или в качестве специфических профилактических средств перед их применением необходима консультация врача-специалиста.
б. Эффект БАД-парафармацевтиков реализуется путем инициации универсальных механизмов адаптационно-приспособительных реакций организма на воздействие раздражителей самой различной природы.
в. Количественные изменения параметров функционирования систем и органов организма лежат в пределах их физиологической нормы.
г. Широкий (гораздо более чем у лекарств) диапазон используемых доз, при которых БАД-парафармацевтики оказывают свое нормализующее и корректирующее действие на функции отдельных органов и систем организма человека при отсутствии токсичных и побочных эффектов.
Принципы экспериментального изучения
БАД-парафармацевтиков
а. Учитывая комплексность и плейотропность физиологических эффектов БАД-парафармацевтиков при изучении их эффективности, предпочтение следует отдавать экспериментальным моделям "in vivo".
б. Исходя из абсолютной предопределенности алиментарного пути поступления пищевых веществ, все изучаемые БАД-парафармацевтики должны вводиться при их экспериментальной оценке "per os".
в. Тестированию следует подвергать готовую к применению форму БАД-парафармацевтика, а не отдельные компоненты, входящие в ее состав, на уровне доз, рекомендованных для человека (использую общепринятые для этого в токсикологии и фармакологии методики пересчета, в т. ч. на кг массы тела)
г. При оценке действия БАД-парафармацевтиков необходимо исследовать их влияние на системы, участвующие в формировании реакций острой фазы или общих механизмов реализации адаптационного синдрома.
Основные методические подходы к экспериментальной
оценке эффективности БАД-парафармацевтиков
Большое разнообразие адаптационных неспецифических защитно-приспособительных реакций организма на раздражители различного рода крайне затрудняет оценку функциональной активности БАД-парафармацевтиков на системы сохранения динамического гомеостаза организма. Однако, как известно, все системы, участвующие в реакциях острой фазы, тесно связаны друг с другом посредством различного рода медиаторов, пептидов, гормонов, трофических факторов, лимфокинов через соответствующий рецепторный аппарат (136). Иными словами, любое изменение одной системы обязательно приводит к изменениям в других системах. В этой связи выбор исследуемых систем диктуется набором преимущественных эффектов БАД-парафармацевтика.
Как известно, основным эффектом БАД-парафармацевтиков является повышение резистентности организма к инфекциям, стрессорным, агрессивным воздействиям химической и физической природы. Такие эффекты БАД-парафармацевтиков в большинстве случаев обусловлены положительным влиянием их на различные звенья иммунной и детоксикационной систем организма и другие общие механизмы адаптационно-приспособительных реакций, в т. ч. за счет поддержания функции антиоксидантных систем организма.
Вышеизложенное позволяет констатировать, что оптимальная схема определения функциональной активности БАД-парафармацевтиков должна включать изучение их влияния на систему иммунитета, резистентность к стрессорным воздействиям разнообразной природы (физическая нагрузка, длительный стресс, химические и т.д.) и на окислительно-антиокислительный статус организма. Правильность именно такого подхода к экспериментальной оценке эффективности БАД-парафармацевтиков вытекает из известных и многократно доказанных учеными разных стран фактах о том, что поражение именно этих систем лежит в основе наиболее распространенных заболеваний человека. Взаиморегуляция нервной, иммунной и окислительно-антиокислительной систем определяет надежность их совместной деятельности. Нарушение же функциональной активности одной из этих систем резко повышает риск развития функциональных расстройств общих механизмов защитно-приспособительных реакций на воздействие факторов окружающей и внутренней среды организма человека. Так, например, нарушение нейрорегуляторных механизмов реализации адаптационного синдрома может играть важную роль в патогенезе иммунологических расстройств и дизрегуляции радикальных окислительных процессов, а иммунологические механизмы, в свою очередь, могут участвовать в патогенезе заболеваний центральной нервной системы и формировании окислительного стресса (136).
Учитывая это, для большей информативности и удешевления исследований эффективности БАД-парафармацевтиков следует использовать унифицированные экспериментальные модели. Примером может служить модель истощающей физической нагрузки, которая кроме непосредственного изучения адаптогенного действия БАД-парафармацевтика дает возможность исследования его влияния на показатели иммунной (ФНО, ИЛ-2) и окислительно-антиокислительной (МД, каталаза) систем. Использование данной модели позволяет установить функциональную, энантиостатическую безопасность (Mangum, Towle, 1977) БАД-парафармацевтиков для здоровья человека, тем самым предопределяя обязательность такого рода исследований.
В случае, когда назначение БАД-парафармацевтика предполагает наличие какого-либо преимущественного эффекта или эффектов (радиопротекторного, иммуномодулирующего, антиоксидантного и т. д.) необходимо дополнительное изучение активности таких БАД в экспериментах, моделирующих соответствующие нарушения.
Так, для определения специфических эффектов БАД-парафармацевтиков можно использовать следующие методические подходы:
- радиопротекторного действия БАД-парафармацевтиков - мышей облучают сублетальными дозами рентгеновского излучения (200-300 Рад) и изучают влияние БАД на показатели иммунной системы, с добавлением методов оценки пролиферативной и антителообразующей активности клеток селезенки и ОАО системы;
- иммуномодулирующего действия БАД-парафармацевтиков - мышам вводят циклофосамид или циклоспорин А (применение того или иного иммунодепрессанта определяется преимущественным действием БАД на конкретное звено иммунной реакции) и изучают влияние БАД на показатели иммунной системы с добавлением методов определения пролиферативной и антителообразующей активности клеток селезенки мыши;
- антиоксидантного действия - мышам вводят раствор четыреххлористого углерода и изучают показатели ОАО системы, с добавлением методов определения диеновой коньюгации ПНЖК и гидроперекиси липидов;
- резистентности к инфекциям - мышей заражают штаммом S.typhi и изучают показатели иммунной системы с добавлением метода определения неспецифической резистентности к инфекциям;
- изучение адаптогенного действия парафармацевтиков проводят на стандартных моделях различных экстремальных условий (повышенная физическая нагрузка, гиподинамия), а также исследуют эмоциональные поведенческие реакции животных.
Лабораторные животные
Для изучения функциональной активности БАД-парафармацевтиков различной природы используют мышей-самцов линии CBA/CaLacSto. Количество животных в опытной группе следует определять с учетом используемой модели исследования, кратности обследования животных и подсчета статистически достоверных результатов (137). В качестве контроля используют группу здоровых интактных мышей той же линии.
Модель истощающей физической нагрузки
Влияние на общую физическую выносливость следует определять на мышах с помощью стандартной методики - плавания животных в бассейне с температурой воды (20+-0,5)° С. Для уменьшения вариабельности получаемых результатов к каждой мыши подвешивают груз (5% от массы тела), не затрудняющий движения животного.
Исследуемую добавку вводят животным внутрижелудочно за 40 мин до помещения их в бассейн. Контрольным животным вводят тот же объем дистиллированной воды или физиологического раствора. Продолжительность плавания регистрируют в секундах. Контрольную и опытную группы животных делят на две подгруппы. Первую подгруппу мышей забивают сразу же после проведения опыта, выделяют селезенку (для изучения иммунной системы), печень и эритроциты (для изучения ОАО системы). Вторую подгруппу животных забивают спустя 1 ч после опыта и также выделяют селезенку, печень и эритроциты для изучения темпов восстановления исследуемых показателей (138).
Изучение адаптогенного действия БАД-парафармацевтиков
Общие положения
В развитии адаптационных реакций, которые являются ответом на значительную физическую, стрессорную, гипоксическую или любую другую нагрузку выделяют два этапа: этап срочной, но несовершенной адаптации и последующий этап относительно устойчивой и достаточно совершенной долговременной адаптации (139). Срочный этап адаптационной реакции возникает непосредственно после начала действия раздражителя и, следовательно, может реализоваться лишь на основе готовых, ранее сформировавшихся биологических механизмов. Важнейшая черта этого этапа адаптации состоит в том, что деятельность организма протекает на пределе его физиологических возможностей при полной мобилизации функционального резерва - и далеко не в полной мере обеспечивает необходимый адаптационный эффект. Другим неотъемлемым компонентом срочной адаптации при достаточно интенсивном действии патологических факторов окружающей и внутренней среды организма человека является значительная стресс-реакция со всеми ее проявлениями, т.е. с увеличением концентрации катехоламинов, кортикостероидов, медиаторов, эозинопенией и т.д. Наконец, существенным компонентом срочной адаптации может оказаться более или менее выраженное повреждение организма, проявляющееся отрицательным азотистым балансом, увеличением пероксидации липидов, ферментемией и т.д. (139).
Долговременный этап адаптации возникает постепенно в результате длительного или многократного действия на организм факторов среды. По существу он развивается на основе многократной реализации срочной адаптации и характеризуется тем, что в итоге постепенного количественного накопления каких-то изменений организм приобретает новое качество.
Таким образом, в зависимости от продолжительности действия патологического фактора, адаптация может быть кратковременной или долговременной (140).
Специфичность адаптации проявляется в реакциях доминирующих систем т.е. функциональных систем организма, изменение функции которых обеспечивает гомеостаз под влиянием изменяющихся условий существования (141). Доминирующими системами могут быть системы различных видов нервной деятельности, транспорта жидких тканей, газов и метаболитов, мышечного сокращения, кислотно-щелочного состояния, терморегуляции, гомеостаза, иммунитета и т. д. В функциональной системе, ответственной за адаптацию различают эффекторную и управляющую части (142).
Эффекторная часть представлена выполняющими специализированную функцию элементами (субсистемными, структурно-функциональными единицами органов, тканями, клетками, ультраструктурами, метаболическими путями) Управляющая часть состоит из центрального и периферического звеньев нейрогуморальной регуляции (Данное разграничение довольно условно, так как механизмы, распределяющие каскады метаболических реакций между эффекторной и управляющей частями недостаточно изучены). Эффекторная часть определяет специфическую функцию (например повышение физической выносливости и работоспособности за счет возбуждения соответствующих моторных центров, мобилизации скелетных мышц, а также кровообращения и дыхания). Управляющая часть обеспечивает адаптивное изменение специализированной функции клетки путем ее мобилизации или перевода в неактивное состояние, новообразования или редукции ее структурных или молекулярных компонентов (например изменение эмоциональных поведенческих реакций, а также иммунного и окислительно-антиокислительного статуса) (143).
В связи с этим БАД к пище следует изучать на обе составляющие адаптивной реакции организма к действию различных раздражителей.
Методы оценки адаптогенного действия
БАД-парафармацевтиков
а. Оценка влияния БАД-парафармацевтиков на выносливость мышей к скоростной нагрузке.
Влияние на выносливость к скоростной физической нагрузке следует определять на 10-дорожном третбане при скорости движения полотна 40 м/мин.
Моментом окончания опыта считается пребывание животных на электрической сетке третбана под напряжением 25 В более 10 с. Опыт проводят при двух функциональных состояниях животных: на фоне относительного покоя (свободного содержания животных в клетках) и на фоне предварительной физической нагрузки. Нагрузку осуществляют с помощью принудительного бега животных в третбане при скорости движения ленты 28 м/мин в течение 5 мин. Животные, получившие предварительную физическую нагрузку, разделяются на 2 подгруппы. В первой подгруппе мыши подвергаются однократной физической нагрузке в течение 5 мин. Вслед за этим животным вводят изучаемую БАД и спустя 1 ч исследуют скоростную выносливость. Животные второй группы ежедневно получают дозированную физическую нагрузку в течение 7 дней. В первый день длительность бега составляет 5 мин, в другие дни продолжительность нагрузки последовательно увеличивают на 1 мин. Сразу же за проведением нагрузки мышам вводят изучаемую БАД. На 7-й день через 1 ч после последнего введения добавки у животных изучают скоростную выносливость. Во всех экспериментах БАД-парафармацевтики вводят "per os", а животным контрольных групп - дистиллированную воду в том же объеме (138).
6. Оценка действия БАД-парафармацевтиков на переносимость животными физических нагрузок.
Влияние на переносимость физических нагрузок следует изучать, вызывая у животных состояние стресса в сочетании с гиподинамией, при подвешивании мышей за шейную складку в течение 3-х дней по 18 ч ежедневно. В интервале между экспериментальными "подвешиваниями" животные получают полноценное питание в условиях вивария. Введение БАД-парафармацевтика осуществляется алиментарным путем. Контрольные мыши во время "подвешивания" подопытных животных лишаются воды и пищи. Оценку работоспособности проводят по продолжительности бега животных в третбане при скорости движения полотна 28 м/мин (138).
в. Оценка действия БАД-парафармацевтиков на эмоциональные поведенческие реакции животных.
Используют метод спровоцированных эмоциональных реакций (Гацура, 1974).
Изучение свойств БАД проводят методом электростимуляции попарно сгруппированных животных (Thedeschi et. al. 1959) в модификации Полевого Л.Г. (1967) и Кудрина А.И. (Кудрин, Пономарева, 1967). Сущность методики заключается в возможности дифференцированно оценивать пороги эмоциональных поведенческих реакций страха и ярости (агрессивности) у мышей путем градуального повышения напряжения электрической площадки, на которую помещают 2-х животных. Изучаемую БАД вводят за 40 мин до посадки животных на электрическую площадку (Полевой, 1967, 1970).
Изучение иммуномодулирующего действия
БАД-парафармацевтиков
Общие положения
Во всех случаях развития адаптивных реакций происходит активация иммунной системы как конкретного звена управляющей части функциональной системы, ответственной за адаптацию. В основе иммуноадаптивных процессов лежат межклеточные взаимодействия, опосредованные гуморальными факторами. Полипептидные факторы неиммуноглобулиновой природы, относящиеся к медиаторам неиммунологических реакций, получили название цитокинов. Подобно регуляторным субстанциям другой природы и гормонам цитокины по характеру действия представляют собой факторы роста или дифференцирования клеток и реализуют свое действие через обычные для подобных факторов механизмы. Основными цитокинами, включающими группу приспособительных реакций функциональной системы, являются медиаторы естественного иммунитета, которые, действуя на клетки-мишени разных органов, изменяют их функции. В результате выявляются следующие эффекты:
- в печени происходит усиление синтеза белков острой фазы (С - реактивный белок, гаптоглобин, церулоплазмин и т. д.) и их выделение в кровь;
- в костном мозге стимулируется развитие нейтрофилов, что приводит к нейтрофилии. Усиливается их хемотаксис и активируется образование этими клетками лактоферрина;
- активируются центры терморегуляции в гипоталамусе (действие в качестве эндогенных пирогенов);
- стимулируется катаболизм белков в мышцах. Образующиеся аминокислоты поступают в печень, где они используются для синтеза белков острой фазы и глюконеогенеза (135).
Типичным представителем группы медиаторов естественного иммунитета, которые непосредственно участвуют в развитии иммунной реакции на действие раздражителя является фактор некроза опухоли - ( )(ФНО-).
ФНО- является медиатором широкого спектра действия, посредством которого осуществляется регуляция функциональной активности клеток иммунной и воспалительной системы организма. Биологическое действие ФНО-, подобно влиянию ЛПС, определяется его концентрационной зависимостью. В низкой концентрации порядка 10(-9)М, действует на лейкоциты и клетки эндотелия локально, т. е. по паракринному или аутокринному типу. В результате ФНО- вызывает на клетках эндотелия сосудов появление новых рецепторов адгезии лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, а затем и моноцитов и лимфоцитов. Усиление адгезии клеток на сосудистых стенках вызывает появление очагов локального воспаления. В пределах данных очагов лейкоциты усиливают бактериальный киллинг, а действие ФНО- на мононуклеарные фагоциты и другие типы клеток активирует продукцию цитокинов, включая ИЛ-1, ИЛ-6, хемокинов и самого ФНО-. Таким образом, возникает каскад цитокиновых реакций, регулирующий активность локального иммунного и воспалительного процесса. Кроме того, ФНО- обладает интерфероно-подобным действием, усиливает экспрессию антигенов 1 класса МНС и цитолитическую активность Т-лимфоцитов (CD8+) в отношении вирус-инфицированных клеток (144, 145, 146).
Другая группа медиаторов включает цитокины, регулирующие активацию, рост и дифференцирование лимфоцитов. Среди них наиболее важным и хорошо изученным медиатором является интерлейкин-2 (ИЛ-2).
ИЛ-2 является ключевым цитокином, активирующим митотическую активность и переход клетки из фазы G 1 в фазу S. Основное количество ИЛ-2 продуцируется Т-лимфоцитами CD-4+ и гораздо меньший вклад для образования медиатора имеют Т-лимфоциты CD8+. Основными клетками-мишенями ИЛ-2 являются сами клетки-продуценты, то есть данный медиатор выполняет роль аутокринного фактора активации и созревания Т-лимфоцитов. Регуляция роста и созревания Т-лимфоцитов, прежде всего хелперных CD-4+ лимфоцитов, включает механизм последовательного взаимодействия ИЛ-2 с рецепторами разной аффинности. Созревание покоящихся Т-лимфоцитов ограничено действием высокой концентрации ИЛ-2, а пролиферация активированных лимфоцитов - диапазоном его низких концентраций.
Указанные взаимодействия ИЛ-2 и Т-лимфоцитов осуществляются преимущественно по аутокринному типу. Однако ИЛ-2 может оказывать действие и на клетки ближайшего окружения, выполняя функции паракринного ростового фактора CD-4+ и CD-8+ Т-лимфоцитов. В период развития физиологической иммунной реакции на антиген ИЛ-2 не поступает в кровяное русло. Поэтому при нормальном течении иммунного ответа его действие как эндокринного ростового фактора не проявляется. Локальная продукция ИЛ-2 в зоне созревания CD-4+ и CD-8+ клеток позволяет регулировать количество и соотношение субпопуляций Т-лимфоцитов, определяя тем самым величину иммунного ответа на Т-зависимые антигены. Кроме того, ИЛ-2 стимулирует В-лимфоциты и усиливает продукцию специфических антител (5, 6, 14, 21).
Таким образом, в механизмах адаптационных изменений иммунного статуса организма ведущая роль принадлежит продукции таких медиаторов иммуногенеза, как ФНО- и ИЛ-2. В этой связи влияние БАД к пище на иммунную систему следует оценивать по изменению уровня продукции иммунокомпетентными клетками вышеупомянутых цитокинов.
Методы оценки действия БАД к пище на показатели
иммунной системы
При оценке специфической активности БАД в отношении показателей иммунной системы необходимо исследовать ее действие не только на уровень секретируемых иммунокомпетентными клетками растворимых медиаторов иммуногенеза, но и исследовать следствия изменения продукции цитокинов т.е. изучать клеточный и гуморальный ответ. Комплексное иммунологическое исследование необходимо для решения вопроса о сохранении функциональной полноценности иммунной системы после применения БАД.
Как известно, одним из важнейших условий формирования иммунного ответа является пролиферация антиген-стимулированных иммунокомпетентных клеток под действием медиаторов иммуногенеза, в частности ИЛ-2. Моделью такой пролиферации является реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) под воздействием митогенов. Митогены, конканавалин А (КонА) или фитогемагглютинин ФГА, связываясь с рецептором клеточной поверхности, приводят к продукции ИЛ-1 и ФНО, способствующих усилению экспрессии рецептора для ИЛ-2 - основного фактора пролиферации Т-лимфоцитов. Кроме того, ИЛ-2 стимулирует В-лимфоциты и усиливает продукцию специфических антител. Наиболее распространенный экспериментальный подход изучения гуморального иммунитета заключается в инициации процесса антигензависимой пролиферации и дифференцирования В-лимфоцитов, являющихся предшественниками антителообразующих клеток.
Для статистической обработки данных следует использовать критерий t Стьюдента, представляя среднюю ошибку и ошибку средней (M + m)(147).
1. Оценка влияния БАД на показатели иммунной системы
интактных мышей
а. Определение влияния БАД на неспецифическую резистентность мышей к бактериальной инфекции.
Мышам вводят перорально и внутривенно БАД в трех дозах. Контролем служат мыши, не получавшие БАД. На каждую дозу берут по 10 мышей. Через 24 ч всех мышей внутрибрюшно заражают штаммом S. tiphi 4446, ресуспендированным в 0,5%-ном муцине или используют любую другую инфекционную модель. Заражающая доза равна 100 LD50, оттитрованная на интактных мышах предварительно. Гибель животных учитывается в течение 5 сут. Параллельно ставят контроль вирулентности используемого штамма. Через 5 сут подсчитывают ЕД-50 по формуле Кебера (Ашмарин И.Л., Воробьев А.А., 1962) или любым другим статистическим методом.
Статистическое значимое уменьшение значения ЕД-50 в опытных группах свидетельствует о стимулирующем действии БАД, увеличение - о супрессивном.
б. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к корпускулярному тимусзависимому антигену.
Для определения антител в сыворотке крови мышей используют эритроциты барана. Иммунизируют мышей 2-х линий: С57В1 - низкореагирующие на эритроциты барана и мышей линии СВА - высокореагирующие. Опытную группу мышей (5 мышей) внутрибрюшинно иммунизируют 0,5 мл эритроцитами барана (концентрация 20 млн. кл/мл). Эритроциты барана предварительно 3 раза отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия путем центрифугирования 7 мин при 400 g и доводят до концентрации 50 млн. кл/мл. Одновременно этой же группе животных вводят исследуемую добавку к пище в трех дозах. Контролем служат две группы мышей: одна группа - интактные мыши, другая иммунизирована только эритроцитами барана. Через равные промежутки времени, начиная с 4-го дня после введения препаратов, у каждой мыши берут кровь из ретроорбитального пространства. Срок исследования - не менее 21 дня. Из крови мышей получают сыворотку, которую титруют в реакции прямой гемагглютинации общепринятым методом.
Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в сыворотке крови опытной группы мышей. Увеличение титров гемагглютиногенов в сыворотке крови опытной группы мышей свидетельствует о стимулирующем действии БАД.
в. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к растворимому тимусзависимому антигену.
В качестве растворимого тимусзависимого антигена используют бычий сывороточный альбумин (БСА).
Мышей иммунизируют БСА дозой 50 мкг в 0,5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия внутрибрюшинно. Исследуемые продукты вводят в трех дозах одновременно с БСА или за 30 мин до иммунизации БСА. Контролем служат две группы мышей: одна группа получает только БСА (без БАД), другая интактная.
На 28 день после иммунизации проводится ревакцинация мышей той же дозой БСА и берется кровь у мышей на 7, 14 и 21 дни после ревакцинации. Получают сыворотку крови и исследуют ее в реакции РПГА на наличие гемагглютининов к БСА общепринятым методом.
Для постановки РПГА готовят эритроцитарный диагностикум. Формалинизированные эритроциты в 50%-ной концентрации трехкратно отмывают 0,9%-ным физиологическим раствором центрифугированием при 400 g 10 мин. После чего концентрация эритроцитов доводится до 2,5%.
На 1000 мл диагностикума берется 50 мг танина, 2 л буфера pH 7,2 (фосфатного), все смешивается и энергично встряхивается 10 мин. После чего производится осаждение и двукратное отмывание эритроцитов на центрифуге при том же режиме. Ресуспензируют фосфатным буфером (pH 6,4) до 1 л. Затем на 1000 мл эритроцитов (2,5%) добавляют 250 мг БСА, перемешивают и помещают в термостат на 24 ч при 37 град.С, перемешивают не менее 5 раз. После инкубирования добавляют 10 мл формалина, перемешивают и помещают в термостат на 30 мин. После этой процедуры отмывают физиологическим раствором (pH 7,2) два раза, затем ресуспензируют буфером pH 7,2 с добавлением формалина так, чтобы в конечном продукте содержалось 2,5% эритроцитов и 1% формалина. Для постановки реакции обязательно применяется 0,9%-ный физиологический раствор, содержащий 1% формалина.
Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в группе и определяют их разницу по критерию Стьюдента.
Увеличение тиров антител в опытных группах свидетельствует о стимулирующем действии их проявления вторичного иммунного ответа БАД.
г. Определение поликлональной активности В-лимфоцитов.
Активность В-лимфоцитов определяется на модели подсчета спонтанных "фоновых" клеток селезенки мышей, продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК) методом локального гемолиза эритроцитов в геле. Опытной группе мышей двух линий (по три мыши) вводят БАД. На 5 - 7 день мышей забивают, извлекают селезенки и готовят взвесь спленоцитов (концентрация 100 млн. кл/мл). Эритроциты барана отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия путем центрифугирования 7 мин при 400 g три раза. Приготавливают 0,9%-ный раствор агара "Дифко" с раствором Хенкса, доводят pH раствора до 7,2 1%-ным раствором KH PO или NAOH по цвету индикатора, находящегося в растворе Хенкса. Для приготовления 10 чашек Петри необходимо 225 мг агара, 22,5 мл дистиллированной воды и 2,5 мл раствора Хенкса. К приготовленному раствору агара добавляют отмытые эритроциты барана из расчета получаемой концентрации эритроцитов 20-30 млн. в 1 мл.
Полученную рабочую смесь разливают по 2,5 мл в пробирки, которые помещают в водяную баню при температуре 43-44° С. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток селезенки, перемешивают и выливают на чашку Петри. Через 5 - 7 мин чашки помещают в термостат при температуре (37+-2)° С на 1 ч, затем в каждую чашку выливают по 2,5 мл разведенного в 5 раз средой 199 сухого комплемента морской свинки (при использовании свежезамороженного комплемента его разводят в 10 раз). Чашки Петри оставляют при комнатной температуре на 30 мин и затем подсчитывают макроскопически число зон гемолиза в каждой чашке Петри. Рассчитывают число клеток, образующих антитела на селезенку и на 1 млн. ядросодержащих клеток селезенки.
Полученные результаты в опытных группах сравнивают с контролем (группа мышей, не получавшая БАД). Увеличение количества АОК после введения БАД свидетельствует о поликлональной активности В-лимфоцитов.
д. Определение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана.
Мышей одного веса, одной линии разделяют на 2 группы. Опытной группе мышей вводят подкожно в межлопаточную область эритроциты барана в дозе 10 млн. клеток на одну мышь в объеме 0,1 мл. Одновременно "per os" этим же мышам вводят БАД. Вторая группа мышей - интактная. На 5 день всем мышам обеих групп в подушечку одной задней лапки вводят разрешающую дозу эритроцитов барана в концентрации 1 млрд. кл/мышь в объеме 0,02 мл. В контрлатеральную подушечку лапки в том же объеме - 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20 ч путем определения веса опытной (Р(0)) и контрольной (Р(к)) лапок мышей. Забивают мышей хлороформом. Отделяют лапки по выступу кости ниже сочленения большеберцовой кости и выше пяточного сустава.
Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР), рассчитываемому по формуле:
ИР=(Р(0)-Р(к)):Р(к)*100%
Препарат, влияющий на клеточное звено иммунитета, вызывает изменение индекса реакции.
е. Определение фагоцитарной активности макрофагов под влиянием БАД.
Опытной группе (3 - 5 мышей) вводят БАД в дозе, оптимальной для человека. Контролем служат интактные животные. От забитых животных получают перитонеальный эксудат (ПЭ) путем 2-3-кратного промывания брюшной полости мышей средой 199, содержащей 5 МЕ гепарина в 1 мл. ПЭ собирают в центрифужные пробирки, стоящие на льду. После центрифугирования ПЭ при 150 g в течение 10 мин клетки ресуспендируют в среде 199 с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед. в мл). Концентрацию клеток доводят до 2 млн. кл/мл и разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в термостат с содержанием 5% углекислого газа. Через 1 ч смывают не прилипшие клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл среды 199 и помещают в термостат с углекислым газом на 18-24 ч.
Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, лабораторные штаммы Staphilococcus или любые другие микроорганизмы.
Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре (90+-2)°С микроорганизмов отмывают не менее трех раз 0,9%-ным раствором хлорида натрия. Определяют концентрацию суспензии микробных клеток по стандарту оптической плотности. Суспензию клеток разводят средой 199 до концентрации 10 - 20 млрд. кл/мл
Эритроциты барана отмывают 3-кратно 0,9%-ным раствором хлорида натрия центрифугированием при 800 g 5 мин и готовят 0,5%-ную взвесь эритроцитов в среде 199. Наливают 1 мл среды 199 в чашки Петри с клетками ПЭ, затем вносят 1 мл взвеси эритроцитов барана или микроорганизмов. Через 30-60 мин в чашки Петри наливают холодный раствор Хенкса и тут же выливают, высушивают и фиксируют клетки метанолом. Затем клетки окрашивают азурэозином по Романовскому-Гимзе.
При учете результатов необходимо просмотреть под микроскопом не менее 200 клеток, подсчитывают фагоцитирующие клетки и количество эритроцитов или микробов в одном макрофаге.
Подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное число.
Результаты, полученные в опытной группе, сравнивают с контролем.
ж. Оценка влияния БАД на продукцию растворимых медиаторов иммуногенеза-цитокинов.
Для определения продукции цитокинов клетки селезенки (КС) мыши инкубируют в течение: 12-14 ч в присутствии ЛПС для инициации синтеза ФНО; 24 ч в присутствии конканавалина А (Кон А) или фитогемагглютинина (ФГА) для инициации синтеза ИЛ-2. Количественное содержание цитокинов оценивают в надосадочных жидкостях при помощи цитокин-зависимых или цитокин-чувствительных клеточных линий.
з. Определение ФНО-.
Содержание ФНО- в исследуемых образцах надосадочной жидкости (НЖ) КС мыши определяют по прямому лизису клеток ФНО- зависимой клеточной линии L-929 (фибробласты мыши) в присутствии актиномицина D (148). Клетки пересевают по 2030 тыс./лунка в плоскодонные 96-луночные планшеты в среде 199 с добавлением 5% инактивированной при 56° С сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубируют 24 ч при 37° С. Образцы НЖ вносят в микропласты в разведениях 1:2 - 1:16 и инкубируют при 37° С в течение 16 - 20 ч. Результаты реакции учитывают после окрашивания клеток 0,2%-ным раствором кристалл-виолета в 2%-ном этаноле в течение 12 мин. Оптическую плотность слоя выживших окрашенных клеток измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом (Multiscan, Великобритания). В качестве стандарта в данном тесте используют рекомбинантный ФНО-. Количество ФНО- в НЖ оценивают в пкг/мл, используя калибровочные кривые, полученные при использовании стандарта.
и. Определение ИЛ-2.
При определении ИЛ-2 КС мыши культивируют в концентрации 5х10(6)/мл в присутствии 5 мкг/мл Кон А в среде RPMI-1640, содержащей 2% сыворотки АВ в течение 20 - 24 ч. Содержание ИЛ-2 в НЖ определяют по способности образцов поддерживать пролиферацию ИЛ-зависимой цитотоксической клеточной линии.
CTLL-2 (лимфоциты мыши), оцениваемую по включению Н-тимидина в ДНК клеток. Уровень включения радиоактивной метки определяют с помощью сцинтилляционного бета-спектрометра. В качестве контроля используют раствор рекомбинантного ИЛ-2 с известной активностью. Количество ИЛ-2 в НЖ оценивают в МЕ/мл, используя калибровочные кривые, полученные при использовании стандарта.
к. Оценка влияния БАД на пролиферацию Т-лимфоцитов при циклоспорин-индуцированной иммунодепрессии.
Мышей самцов линии Balb/c иммунизируют внутривенно эритроцитами барана в оптимальной дозе (5х10(8)), с целью индукции иммунодепрессии через 24 ч вводят циклоспорин А внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг. Через 4 ч изучаемую БАД в различных дозах, еще через 4 ч животных забивают, извлекают клетки селезенки, которые культивируют в Кон А (митогеном, реализующим свой эффект преимущественно на Т-клетки) в течение 72 ч. Степень пролиферации клеток селезенки мыши оценивают по включению в ДНК лимфоцитов тимидина, меченного тритием, который вносят в культуру за 4 - 6 ч до окончания инкубации. Количество включенного клетками изотопа после соответствующей обработки измеряют на сцинтилляционном бета-счетчике (149).
л. Оценка влияния БАД на гуморальный иммунный ответ.
Мышей самцов Balb/c иммунизируют внутривенно эритроцитами барана в оптимальной дозе (5х10(8)), через 24 ч вводят циклоспорин А (мощный иммунодепрессант, оказывающий свое действие преимущественно путем ингибиции процессов активации Т-лимфоцитов) внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг, еще через 4 ч - изучаемую БАД в различных дозах (рекомендуемая доза обязательна). На 4 сутки после иммунизации определяют число антителообразующих клеток в селезенке мыши методом локального гемолиза в агарозном геле по Jerneи Nordin (150).
Методы исследования аллергических свойств
биологически активных добавок к пище
1. Оценка влияния БАД на общую анафилактическую реакцию.
Морских свинок 200 - 250 г сенсибилизируют подкожно каким-либо чужеродным белком. Наиболее удобно использовать нормальную лошадиную сыворотку или бычий сывороточный альбумин в дозе 0,1 мл и 10 мг соответственно. Одновременно свинкам вводят "per os" или внутримышечно исследуемую субстанцию - это опытная группа животных. Контролем служит группа свинок, не получавшая БАД. На 14 - 21 день после иммунизации свинкам двух групп внутрисердечно или внутривенно вводят ту же или удвоенную дозу антигена, использованного для сенсибилизации. Реакция у животных наступает через 1 - 2 мин. Наблюдают за животными в течение 30 мин.
Оценка реакции производится по четырехплюсовой системе:
А (+) - кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти, падение температуры (не менее чем на 1 °);
Б (++) - четко выраженные частые почесывания, единичные чихания, падение температуры;
В (+++) - спастический кашель, боковое положение животного, отделение кала и мочи;
Г (++++) - спазм дыхательных путей, конвульсивные движения, судороги. Животные погибают;
Д - реакция отсутствует.
Полученные результаты в контрольной группе сравнивают с результатами в опытной группе.
В качестве положительного контроля используют животных, сенсибилизированных нормальной гетерологической сывороткой и получивших разрешающую дозу в те же сроки. Одновременно разрешающую дозу испытуемой БАД "per os" вводят животным, которые предварительно получили соответствующий объем 0,9%-ного хлорида натрия - отрицательный контроль.
Индекс синдрома в группе вычисляют по формуле Вейгла (И):
(Ах1) + (Бх2) + (Вх3) + (Гх4)
И = -------------------------------, где
А + Б + В + Г + Д
А, Б, В, Г, Д - число животных с данной выраженностью синдрома.
Изучаемые БАД не должны вызывать развития смертельного шока.
Изучение действия БАД на показатели
окислительно-антиокислительной системы
Общие положения
К основным внутриклеточным химическим повреждающим агентам следует, в первую очередь, отнести свободные радикалы, образование которых приводит к нарушению функционирования клеточных структур, включая биологические мембраны. Наибольшее значение для патологии имеют свободные радикалы кислорода, а также пероксид водорода. Все эти так называемые активные формы кислорода образуются в большом количестве клетками-фагоцитами, а также могут образовываться в митохондриях и эндоплазматической сети других клеток в условиях патологии. Реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов, радикалы инициируют цепную реакцию их перекисного окисления. Реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) тормозятся антиоксидантными системами клетки, благодаря наличию которых скорость реакции образования гидроксильных радикалов и разветвления цепи окисления липидов находится в пределах физиологической нормы. Постоянное образование прооксидантов уравновешено той же скоростью их дезактивации антиоксидантами. Резкое усилие окислительных процессов при недостаточности системы антиоксидантной защиты приводит к развитию "оксидантного стресса", который рассматривается как один из общих механизмов повреждения тканей организма. Реакции окислительного стресса являются результатом нарушения взаимоотношений между оксидантной и антиоксидантной составляющими свободнорадикальных процессов за счет гиперактивности или недостаточности одного из указанных компонентов. В ходе реализации окислительного стресса, являющегося реакцией организменного уровня, создаются условия для развития специфических для нервной системы патологических процессов, что в свою очередь усугубляет окислительный стресс в центральной нервной системе (151).
В связи с вышеизложенным, БАД к пище следует изучать как по изменению активности ферментных систем генерирования свободных радикалов кислорода и гидроперекисей, так и по изменению содержания антиоксидантных белков и ферментов, обеспечивающих утилизацию активных форм кислорода, Н2О2 и липопероксидов.
Методы оценки действия БАД к пище на показатели
перекисного окисления липидов
Мышам-самцам линии линии Balb/c вводят 0,25 мл 7%-ного масляного раствора СС14 - одного из сильнейших стимуляторов ПОЛ, внутримышечно или алиментарно, через 15 - 20 мин животным "per os" вводят исследуемую БАД к пище (5 животных в группе), 5-ти мышам контрольной группы вводят аналогичный объем физиологического раствора. Через 2 сут животных забивают, выделяют печень и определяют продукты перекисного окисления липидов, такие как диеновые коньюгаты (появляются на начальных этапах перекисного окисления), гидроперекиси липидов (обнаруживаются на более поздних этапах перекисного окисления) и малоновый диальдегид (один из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов).
а. Определение малонового диальдегида в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенезаторе Поттера в 3 мл 0,025 М трис-HCl (рН 7,4), содержащей 0,175 ММ хлорида калия. Гомогенат по 2,5 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 1 мл 17%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 4000 g. Надосадочную жидкость переносят в пробирки, добавляют по 1 мл 0,8%-ного водного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы на 10 мин в кипящую водяную баню. В качестве контроля используют пробы, содержащие вместо надосадочной жидкости буфер (рН 7,4). После развития розовой окраски пробы охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность при 532 нм. Количество малонового диальдегида рассчитывают, используя молярный коэффициент экстикции 1,56*10(5) см(-1)*М(-1), а полученный результат выражают в нмолях на пробу (152).
б. Определение диеновой конъюгации полиненасыщенных высших жирных кислот в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера с 9 мл экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в объемном отношении 1:1. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин при 4000 g. Надосадочную фракцию переносят в пробирки и добавляют одну десятую часть объема дистиллированной воды. После 2-кратного встряхивания и расслаивания фаз отсасывают гитпановую фазу. К равным объемам по 0,5 мл добавляют этиловый спирт в отношении 1:5 - 1:10. Оптическую плотность проб измеряют при 233 нм. В качестве контроля используют только экстрагирующую смесь.
Содержание диеновых конъюгатов рассчитывают, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции при 233 нм для сопряженных диенов ПНЖК, равного 2,2*10(5) см(-1)*М(-1) (152).
в. Определение гидроперекиси липидов в гомогенате печени мыши.
Печень мыши растирают в гомогенизаторе Поттера в 3 мл 0,025 М трис HCL буфера (рН 7,4), содержащей 0,175 М хлорида калия. Гомогенат по 2,0 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 0,2 мл 50%-ного раствора ТХУ (конечная концентрация 5%). Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 4000 g. 2 мл надосадочной жидкости доводят 96%-ным этанолом до 27 мл. К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора соли Мора в 3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно встряхивают. Точно через 30 с приливают 1 мл 20%-ного раствора тиоцианата аммония, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля используют пробы, содержащие 96%-ный этанол
Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Методические указания МУК 2.3.2.721-98 "2.3.2. Пищевые продукты и пищевые добавки. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище" (утв. Главным Государственным санитарным врачом РФ 15 октября 1998 г.)
Текст методических указаний официально опубликован не был
Дата введения: 1 января 1999 г.
Система ГАРАНТ
Информационно-правовое обеспечение ГАРАНТ включает широкий круг инструментов и полезных сервисов для специалистов различных областей.
Узнайте подробнее о наполнении профессиональных комплектов и стоимости информационного обеспечения.
Новости
Все новости16 июля 2025 18:27
Общество
В таком случае возможность восстановить российский паспорт появится у иностранца только через три года после аннулирования.
16 июля 2025 18:10
IT
Также планируется наказывать тех, кто рекламирует программы для доступа к ограниченным в России информресурсам.
16 июля 2025 17:54
Бизнес
Разъяснения финансового ведомства касаются требований к НМЦК.
16 июля 2025 17:25
Социальная сфера
Минздрав России неоднократно продлевал срок, допускающий выдачу и ведение документов по старой форме.
16 июля 2025 16:59
Образование
Сейчас стоимость определяют учредители, что приводит к дисбалансу размера платы за обучение.
16 июля 2025 16:15
Бизнес
Банк России разработал кодекс ответственного инвестирования для крупных участников финансового рынка.