Методические указания МУ 4.2.698-98 "Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 9 января 1998 г.) (утратили силу)

4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы.

Методические указания МУ 4.2.698-98
"Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 9 января 1998 г.)

Дата введения: с 08 июня 1998 г.

ГАРАНТ:

Настоящие Методические указания признаны утратившими силу в связи с введением МУК 4.2.3065-13 "Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции", утвержденных Роспотребнадзором, Главным государственным санитарным врачом РФ 14 июля 2013 г.

1. Область применения

Методические указания составлены в помощь специалистам бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических учреждений и научно-исследовательских институтов для совершенствования лабораторной диагностики дифтерийной инфекции.

2. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции

Возбудителем дифтерийной инфекции являются токсигенные Corynebacterium diphtheriae. Нетоксигенные коринебактерии дифтерии не вызывают дифтерийную инфекцию. "Этиологическая" значимость этих микроорганизмов при неинфекционной патологии (фарингит, артрит, эндокардит и др.) требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов C.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.

В основе способности С.diphtheriae вырабатывать экзотоксин лежит феномен фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсия нетоксигенных штаммов С.diphtheriae в токсигенные и наоборот воспроизводится только в особых, экспериментальных условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками - нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что при использовании антибиотиков в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Такое же положение может создаваться и при санации антибиотиками бактерионосителей, одновременно выделяющих токсигенные и нетоксигенные коринебактерии дифтерии. Обнаружение у таких носителей при повторных обследованиях только нетоксигенных штаммов нельзя трактовать как утрату способности штаммов продуцировать экзотоксин.

Таксономически близкими виду C.diphtheriae являются C.ulcerans и C.pseudotuberculosis (C.ovis). Данные микроорганизмы - природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей. Отмечена способность этих видов бактерий вырабатывать токсин, подобный дифтерийному. Встречаются и "нетоксигенные" штаммы. Известны случаи выделения "токсигенных" C.ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией.

На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается ложнодифтерийная палочка Гофмана (C.pseudodiphtheriticum). Умение выделять и идентифицировать данные бактерии служит критерием оценки качества работы бактериологов в межэпидемический период.

Все микроорганизмы рода Corynebacterium являются грамположительными палочками, не образующими спор, обладающими различной степенью полиморфизма. Большинство видов лучше растет в аэробных условиях.

Обычно колонии микроорганизмов из рода коринебактерий на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато-белую или желтоватую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, округлой формы, диаметром 1-3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода коринебактерий могут образовывать шероховатые R-колонии. Представители этого рода не отличаются высокой ферментативной активностью. C.diphtheriae растут при 37°С, устойчивы к низкой температуре, чувствительны к высокой. Все дезинфицирующие вещества в обычных концентрациях (3-5%) уничтожают коринебактерии дифтерии в течение 20-30 минут. Токсигенные C.diphtheriae более чувствительны к антибиотикам, чем нетоксигенные. Возможно появление устойчивых к антибиотикам штаммов. Широко определять чувствительность к антибиотикам штаммов, выделенных от бактерионосителей, не следует из-за несоответствия результатов лабораторной пробы с действием антибиотиков на возбудителя дифтерии в организме человека.

Для C.diphtheriae характерен значительный полиморфизм - разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, овоида и т.д. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V. При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина. Описано сродство волютина к метиленовому синему и, при обработке этим красителем, гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. Использование в бактериологической практике окраски по Граму является нецелесообразным, поскольку клетки C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазке грамвариабельными или даже грамотрицательными.

Для C.ulcerans и C.pseudodiphtheriticum характерна склонность к параллельному расположению клеток. 24-48 часовые культуры этих видов имеют чаще всего овоидную форму клеток.

По форме колоний и некоторым биохимическим свойствам C.diphtheriae подразделяют на культурально-биохимические варианты - gravis, mitis, intermedius.

Через 48-72 часа роста вариант mitis образует колонии S-типа - гладкие, диаметром 1-2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2-3 мм; колонии варианта intermedius - S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1 мм. Далее описываются только два культурально-биохимических варианта - gravis и mitis, так как биовар intermedius встречается редко и по биохимическим свойствам не отличается от биовара mitis.

На кровяных теллуритовых средах через 48 часов роста колонии C.diphtheriae варианта gravis, как и колонии C.ulcerans, черные, матовые имеют радиальную исчерченность. Колонии C.pseudodiphtheriticum имеют характерный светлый ободок.

В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства колоний или микробной клетки, при идентификации C.diphtheriae, не представляется возможным. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55% и 14,5% случаев соответственно), когда используется учет только морфологических признаков. При идентификации C.diphtheriae необходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь, определение патогенности (токсигенности), основного признака возбудителя дифтерии.

Определение токсигенных свойств проводится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала. Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий, необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний с чашек первичного посева. При соблюдении описанных ниже методик, можно изучить токсигенность более чем у 20 подозрительных колоний из одного анализа. Нельзя изучать материал при множественном росте подозрительных колоний только в одной-двух бляшках.

Ферментативная активность микроорганизмов изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу, крахмал. В редких случаях, когда необходимо идентифицировать C.ulcerans, добавляется тест на восстановление нитратов в нитриты.

Учитывая, что при идентификации возбудителя дифтерийной инфекции ведущим элементом является определение наличия токсина, оценки других свойств имеет вспомогательное значение. Использование "длинного" углеводного ряда является излишним при идентификация C.diphtheriae. Практическим бактериологам, занимающимся лабораторной диагностикой дифтерии, не требуется проводить идентификацию до вида других микроорганизмов рода Corynebacterium. В то же время, в лабораториях, где проводится диагностика заболеваний, вызываемых "недифтерийными" коринебактериями, недостаточно использования даже "длинного" углеводного ряда. Для точной идентификации данных микроорганизмов необходимо использовать хемотаксономические методы исследования, например, такие, как определение наличия миколовых кислот в составе клеточной стенки бактерий и некоторые другие.

Таким образом, выделенный микроорганизм является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами, определенным спектром ферментативной активности (расщепление глюкозы, крахмала, отсутствие разложения сахарозы, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) и характерными морфолого-культуральными признаками (образование колоний черного или серого цвета на кровяно-теллуритовых средах, с учетом, при необходимости, морфологии клеток - полиморфные, не образующие спор палочки).

3. Бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции и наблюдения за распространенностью токсигенных коринебактерии дифтерии.

Взятие и доставка материала

1. Успех бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного и правильного взятия материала.

2. Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники лечебно-профилактических учреждений.

3. При исследовании на дифтерию обследуют ротоглотку и нос. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище) помимо пораженных участков, следует брать материал также с миндалин и из носа.

4. Взятие материала осуществляют с помощью стерильных ватных сухих тампонов. Для их приготовления используют деревянные или металлические (из нержавеющего металла) палочки, на один из концов которых плотно накручивается слой гигроскопической ваты (примерно 120 мг ваты на тампон). Тампоны должны иметь форму "капли", а не "веретена". Тампоны монтируют в пробирки с корковыми или ватными пробками так, чтобы конец тампона не касался дна и стенок пробирки. Стерилизуют тампоны в сухожаровом шкафу при температуре 140°С в течение часа или в автоклаве при 0,5 атм 30 мин.

5. Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через два часа после еды, при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с пораженных участков ротоглотки - миндалин, а при необходимости - с дужек мягкого неба, небного язычка или задней стенки глотки. При наличии налетов, материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи.

6. При ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. Материал с пораженных участков кожи следует собирать сухим тампоном после удаления корочек или струпа.

7. Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов с момента взятия материала. При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, рекомендуется засевать материал на чашки с питательной средой или использовать транспортную среду,

8. В случае использования транспортной среды материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки.

9. Чашки (или пробирки с транспортной средой) с посевом исследуемого материала можно поместить для подращивания в термостат при 37°С на 15-18 часов, после чего доставить в лабораторию.

10. При транспортировке на дальние расстояния также можно использовать тампоны, предварительно пропитанные раствором глицерина. Тампон пропитывают 5%-ным раствором глицерина в дистиллированной воде, отжимают о стенки сосуда с раствором, укрепляют в пробирке так же, как сухой тампон и автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин.

11. В холодное время года исследуемый материал доставляют в баклабораторию в сумках-термосах, во избежание его замерзания.

12. В случае необходимости проведения постмортальных исследований на коринебактерии дифтерии, материал целесообразно брать с миндалин, гортани и полости носа, поскольку во внутренних органах возбудитель обнаруживается редко.

13. Каждой пробирке с исследуемым материалом (зев, нос, или другая локализация) придается номер. В прилагаемом списке указывается номер пробирки, фамилия, имя (или инициалы), возраст, название учреждения, направляющего материал, или домашний адрес обследуемого, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование), дата и время взятия материала.

Ход исследования.

Первый день
Посев материала.

Материал для исследования из ротоглотки, носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри.

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности среды для посева материала из ротоглотки, а вторую - для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других мест добавляют еще одну чашку. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2х1 см2 - формирование такой "площадки" является обязательным. Затем, этим же тампоном засевают оставшуюся поверхность 1/2 чашки. Посев производят частыми неперекрывающимися штрихами, не отрывая тампон от поверхности питательной среды и не изменяя положения тампона. Такой метод посева позволяет засеять весь материал с тампона, получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно на чашке первичного посева, что сокращает длительность анализа на одни сутки. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещают в термостат при 37°С. Высев из транспортной среды производят на следующие сутки на плотную питательную среду тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.

Посев следует производить на чашки со средой, согретые при комнатной температуре или в термостате (15-20 минут).

Второй день

1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляется ровно через 24 часа, т.е. тоже во второй половине дня) визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).

2. Чашки с колониями, похожими на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопии препаратов-мазков из "подозрительных" колоний можно не проводить. "Подозрительные" колонии на кровяно-теллуритовых средах через 24 часа роста светло-серого цвета, выпуклые, с ровными краями, через 48 часов - серые с металлическим оттенком, с ровными или слегка изрезанными краями, крошащиеся при прикосновении петлей или мягкой консистенции. Из "сомнительных" колоний готовят препараты-мазки.

Клетки коринебактерий дифтерии из культуры, выросшей на средах с ингибиторами роста (теллурит калия, хинозол) могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Оценка морфологических признаков не позволяет установить видовую принадлежность микроорганизма, но дает возможность предположительно отнести его к роду коринебактерий. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то эти колонии отбирают для дальнейшей идентификации по всем тестам. В случае обнаружения других форм микроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек), дальнейшее изучение этих колоний прекращается.

3. В случае роста "подозрительных" однотипных колоний, необходимо сразу же приступить к изучению их токсигенных свойств. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и, необожженой петлей, - на среду Пизу, а другой половины колонии - в пробирку со скошенным сывороточным агаром для сохранения и накопления культуры. При невозможности снять 1/2 колонии для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии; посев на скошенный агар исключается и, в дальнейшем, используется культура из пробирки с пробой Пизу. Учитывая, что через 24 часа роста колонии имеют небольшие размеры и материала 1/2 или 1 колонии может быть недостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе на токсигенность, а также то, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности коринебактерий дифтерии, крайне важно изучить токсигенные свойства, по возможности, у максимального числа выросших колоний (20 и более), смешивая по 5-7 однотипных колоний в одну бляшку.

4. При невозможности постановки пробы на токсигенность классическим способом (см. п.3) из-за недостаточной величины колоний, их изучают, смешивая однотипные колонии в нескольких бляшках. Не прожигая петли, производят посев в среду Пизу. Чашки с первичным посевом исследуемого материала вновь помещают в термостат на 24 часа и просматривают их повторно (на третьи сутки).

5. Если вырастает только одна колония, ее можно засеять на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли,- в столбик среды Пизу для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру из пробирки с пробой Пизу или с бляшки через 48 часов роста, или через 24 часа роста при выявленных токсигенных свойствах культуры.

6. С целью выдачи предварительного ответа, в случае множественного роста подозрительных колоний, можно произвести посев нескольких колоний на жидкую питательную среду для постановки РНГА, выполнить дополнительную пробу Заксе (3-5 однотипных колоний, учет через 30 мин инкубации) и пробу Пизу (5-6 однотипных колоний, учет через 3 часа инкубации). При характерной для коринебактерий дифтерии морфологии колоний в МБС, морфологии клеток при микроскопии, отрицательной пробе Заксе, положительных результатах пробы Пизу, РНГА, можно выдать предварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии через 48 часов (на третьи сутки) с момента первичного посева исследуемого материала.

Третий день

1. Через 24 часа, при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ.

При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, чашки инкубируют еще 24 часа.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после оценки ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (сахароза, глюкоза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).

3. Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают визуально или с помощью МБС повторно через 36-48 часов инкубации в термостате. При наличии "подозрительных" колоний изучают их токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенный сывороточный агар (см. второй день исследования, п.3).

При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

При отсутствии роста на чашках первичного посева через 48 часов инкубации, в ряде случаев требуется повторное взятие и исследование материала. Полное отсутствие роста чаще всего свидетельствует о нарушении правил бактериологического обследования (взятия, доставки, посева и культивирования исследуемого материала).

Четвертый день (или пятый)

1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 часа инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева), положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, после определения ее чистоты, засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной).

3. Повторно (через 48 часов) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2-ой день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в пробах, поставленных в 3-й день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные, с указанием биохимического варианта,

При выделении токсигенных коринебактерий дифтерии, дополнительно выдают ответ о биохимических свойствах (через 72 или 96 часов с момента первичного посева исследуемого материала).

Бактериологическое заключение

1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культуральные и биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал) позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культуральные и биохимические свойства позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

3. При наличии линий преципитации, идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов в нитриты, культуру относят к виду коринебактерий ульцеранс, токсигенный вариант.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для коринебактерий ульцеранс, нетоксигенный вариант, и бактериологический ответ считают отрицательным.

4. При выделении коринебактерий Гофмана или других дифтероидов, бактериологический ответ считают отрицательным.

5. В некоторых случаях, при диагностическом обследовании и по эпидпоказаниям, может быть выдан предварительный ответ. Это требует постановки дополнительных проб, наличия качественных питательных сред, тест-системы для постановки РНГА и специально обученного персонала. Предварительный ответ может быть выдан при наличии множественного роста однотипных "подозрительных" колоний на чашках первичного посева после 24 часов инкубации (см. второй день исследования, п.6).

Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.

6. Штаммы коринебактерий дифтерии с атипичными морфологическими, биохимическими, токсигенными свойствами и штаммы коринебактерий ульцеранс следует направлять в Федеральную референс-лабораторию по диагностике дифтерийной инфекции при Московском НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского для дальнейшего изучения, (125212 Москва, ул. адмирала Макарова, 10).

Схема бактериологического исследования.

1 день.

Посев исследуемого материала на селективную дифференциально-диагностическую или, при необходимости, в транспортную среду. Инкубирование в термостате при 37°С.

2 день (24 часа).

1. Изучение выросших колоний, при возможности - постановка пробы на токсигенность, цистиназу и посев культуры на скошенный сывороточный агар.

2. При использовании транспортной среды необходимо произвести пересев на селективную дифференциально-диагностическую среду.

3. При множественном росте, в случае необходимости, можно провести исследования для выдачи предварительного ответа - дополнительные пробы Пизу, Заксе и посев "подозрительных" колоний в жидкую питательную среду для выявления дифтерийного токсина в РНГА.

3 день (48 часов).

1. Учет результатов проб на токсигенность и на цистиназу, поставленных во второй день исследования. В случае наличия специфических линий преципитации и при положительной пробе Пизу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования, на среды Гисса для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

3. Повторный просмотр (через 48 часов) чашек первичного посева визуально или с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу и отсев колоний на скошенный сывороточный агар.

4. В случае использования транспортной среды, ход исследования см. начиная с п.1 второго дня и далее по схеме.

5. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии.

6. При постановке РНГА для выявления дифтерийного токсина, при наличии положительного результата в этой реакции и обнаружении у исследуемой культуры фермента цистиназы, отсутствии фермента уреазы, можно выдать предварительный ответ о выделении возбудителя дифтерии.

4 день (72 часа).

1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3-й день исследования (через 48 часов роста первичного посева), и выдача документированного ответа о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Посев выделенной культуры для определения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной или нетоксигенной), выделенной во второй день исследования (через 24 часа инкубации первичного посева).

Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

5 день (96 часов).

Выдача бактериологического ответа о выделении (через 48 часов инкубации первичного посева) токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта.

4. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции

Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с помощью
реакции преципитации в геле.

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или "усов".

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном, питательную среду - агар Мартена или сухую коммерческую питательную среду, нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота, стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 1,5 см х 8 см, очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (в дальнейшем именуется "антитоксин"), противодифтерийную антитоксическую сыворотку лошадиную, лечебную (в дальнейшем именуется "антитоксическая сыворотка"), или готовые бумажные диски с нанесенным на них антитоксином, а также - контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии 24-48- часового роста.

Приготовление чашек для постановки пробы
на токсигенность

Питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). При большом объеме работы питательный агар разливают во флаконы по 70-80 мл (на 7-8 чашек пробы на токсигенность). Питательный агар следует расплавливать только 1 раз, многократное плавление ухудшает свойства среды. Питательный агар расплавливают в водяной бане при 90°С, тотчас же вынимают из бани, охлаждают до 50°С и добавляют 20% сыворотки крупного рогатого скота. Так, к 10 мл питательного агара добавляют 2 мл сыворотки крупного рогатого скота, перемешивают и выливают, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяют среду по дну осторожным вращением чашки.

В центр чашки на поверхность застывающего агара обожженным пинцетом помещают полоску из фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксином (или антитоксической сывороткой).

Чашку подсушивают в термостате при 37°С в течение 15-20 мин., повернув ее вверх дном. При использовании бумажных индикаторных дисков, чашку с питательным агаром подсушивают до нанесения дисков на поверхность среды.

Чашки со средой для определения токсигенности хранить не рекомендуется.

Приготовление бумажных полосок

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером 1,5 см х 8 см, заворачивают по 2-4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 30 мин. Пакетики с бумажными полосками хранят в стерильной чашке Петри до 3-х недель.

Перед постановкой пробы на токсигенность содержимое ампулы с антитоксином растворяют в 1 мл стерильного физиологического раствора, переносят в стерильную пробирку и указывают на ней данные этикетки (растворенный антитоксин хранят при температуре 4-6°С не более 10 дней), фильтровальные бумажки обожженным пинцетом помещают в стерильную чашку Петри. На каждую полоску наносят 0,25 мл антитоксина, содержащего 500 ME в 1 мл. Для удаления избытка сыворотки смоченную полоску прикладывают к стерильной крышке чашки Петри.

При использовании антитоксической сыворотки (вместо антитоксина), требуется ее разведение до 500 ME в 1 мл.

Разведение антитоксической сыворотки

Соблюдая правила асептики, антитоксическую сыворотку переносят из ампулы в стерильную пробирку. На пробирке указывают данные этикетки и срок хранения. Хранят сыворотку при температуре 4-6°С.

Сыворотка должна быть разведена стерильным физиологическим раствором до содержания 500 ME в 1 мл. Коммерческий препарат может иметь разную активность (5000 ME, 10000 ME, 20000 ME) и различный объем.

Например, в ампуле содержится 10000 ME (в объеме 4,8 мл, как указано на этикетке коробки с ампулами) антитоксической сыворотки. Для упрощения расчетов общий объем сыворотки можно принять за 5 мл. Следовательно, в 1 мл сыворотки содержится 2000 ME (10000 ME:5 = 2000 ME). Чтобы получить 500 ME в 1 мл, следует 1 мл сыворотки развести в 4 раза, т.е. к 1 мл сыворотки добавить 3 мл стерильного физиологического раствора. При необходимости, можно развести сыворотку в меньших объемах: к 0,1 мл сыворотки добавить 0,3 мл физиологического раствора или к 0,2 мл сыворотки добавить 0,6 мл физиологического раствора, или к 0,3 мл сыворотки добавить 0,9 мл физиологического раствора и т.д.

Разведение сыворотки можно выполнить другим способом. Если, например, в ампуле содержится 5000 ME сыворотки в объеме 2,5 мл, то 500 ME содержится в 0,25 мл сыворотки, К этому объему добавляют 0,75 мл стерильного физиологического раствора и получают разведение сыворотки 500 ME в 1 мл.

Разведенную сыворотку можно хранить до 7 дней при температуре 4-6°С.

Постановка пробы

Культуру засевают в виде "бляшек" диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 "бляшек". Из них 6 "бляшек" испытуемой культуры, 4 - контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных "бляшек" и 4 - испытуемых (рис.1). Чашки с посевом помещают в термостат при 37°С.

Учет результатов

Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому, при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата, преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях, могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.

Варианты оценки результатов реакции:

1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.

2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если:

а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;

б) линии преципитации не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);

в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;

г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.

Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.

Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии
с использованием индикаторных бумажных дисков с антитоксином.

На поверхность чашки Петри со средой для определения токсигенности дифтерийных микробов помещают индикаторные диски с дифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 "бляшек": две "бляшки" - контрольного штамма и три - испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониями формируют минимум две "бляшки" из изолированных колоний и одну - из смеси 3-6 однотипных колоний; материалом из этого же анализа можно занять места вокруг другого диска с антитоксином). Все пять "бляшек" располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,8 см от его края. Диаметр каждой "бляшки" 0,8 см. На одной чашке Петри можно разместить до четырех дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 "бляшек" с культурами. Чашки с посевами помещают в термостат при 37°С.

Результат реакции учитывают через 18-24 часа, а также - через 48 часов. Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсигенной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 часов, при наличии их у контрольных штаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольных штаммов должны появляться через 18-24 часа. Более позднее появление линий преципитации требует проверки качества питательной среды или замены контрольного штамма.

Хранение контрольного штамма в лаборатории

Для хранения контрольного штамма в лаборатории можно использовать полужидкий сывороточный агар, приготовленный на бульоне Мартена или другом питательном бульоне (рН 7,6). Хранить в холодильнике, пересев один раз в 2-3 месяца. Полужидкий агар разливают по 8 мл в пробирки и добавляют по 1 мл сыворотки крупного рогатого скота.

Контрольный токсигенный штамм коринебактерий дифтерии, варианта гравис получают в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им.Л.А.Тарасевича. В пробе на токсигенность нельзя использовать, в качестве контрольного, производственный штамм PW-8 и его варианты. Контрольный штамм необходимо периодически пассировать на кровяном агаре. Для успешной идентификации коринебактерий дифтерии контрольный токсигенный штамм пересевается каждые 1-2 суток.

Методики определения биохимических признаков

Определение цистиназной активности (проба Пизу)

Коринебактерии дифтерии и коринебактерий ульцеранс, в отличие от ложнодифтерийной палочки Гофмана и других коринеформных бактерий, обладают ферментом цистиназой.

Испытуемую культуру засевают петлей "уколом" в питательную среду для определения цистиназы, разлитую в узкие пробирки столбиком высотой 3 см. В составе питательной среды имеется цистин и уксуснокислый свинец. В процессе роста культура продуцирует цистиназу, расщепляющую цистин; а образующийся при этом сероводород вступает в реакцию с уксусно-кислым свинцом, который превращается в сернокислый свинец - соединение темно-коричневого цвета. Коринебактерии дифтерии и коринебактерии ульцеранс вызывают не только почернение среды по ходу укола, но и образуют вокруг него облачко темнокоричневого цвета на расстоянии примерно 1 см от поверхности среды. Результат реакции учитывают через 24 часа. При наличии множественного роста, для получения ускоренного ответа (через 3 часа), среду инокулируют большим количеством культуры. Одновременно с испытуемыми культурами, производится посев контрольного штамма в отдельную пробирку.

Определение уреазной активности

Ложнодифтерийные палочки Гофмана, коринебактерий ульцеранс и некоторые другие микроорганизмы рода Corynebacterium обладают способностью продуцировать в процессе роста фермент уреазу и расщеплять мочевину. Коринебактерий дифтерии такой способностью не обладают.

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах - по методу Заксе (а) и путем посева на бульон с мочевиной (б).

а) Для определения уреазы по методу Заксе ex tempore смешивают 1 часть реактива А и 19 частей реактива В. Смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл и вносят одну петлю испытуемой чистой культуры со скошенного агара или из пробирки со средой Пизу. Для выдачи ускоренного ответа, при наличии множественного роста однотипных колоний на чашке первичного посева, допускается внесение нескольких колоний в одну пробирку с пробой на уреазу. Результат учитывают после инкубации в термостате при 37°С в течение 30 мин.

б) Чистую культуру коринебактерий дифтерии засевают в бульон с мочевиной, разлитый в пробирки по 2-3 мл и помещают в термостат, результат учитывают через 24 часа инкубации при 37°С.

Фермент уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и углекислоты. При этом повышается рН среды и происходит изменение цвета индикатора (покраснение). При отсутствии у исследуемой культуры этого фермента, окрашивания среды не происходит. Рекомендуется одновременно, в отдельную пробирку, засевать контрольный штамм.

Определение сахаролитической активности

Для идентификации коринебактерий дифтерии используют также оценку сахаролитической активности выделенных культур на средах Гисса с углеводами - сахарозой, глюкозой, растворимым крахмалом. Каждую пробирку со средой Гисса инокулируют 1 петлей чистой культуры. Результат учитывают через 24 часа, а при отрицательном крахмальном признаке - через 48 часов культивирования посевов в термостате при 37°С.

При сбраживании того или иного углевода образуется кислота, происходит восстановление обесцвеченного фуксина и среда приобретает малиновую окраску. Рекомендуется одновременно ставить пробу с контрольным штаммом коринебактерий дифтерии варианта гравис.

Определение нитратредуктазной активности

Способность коринебактерий дифтерии восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является дополнительным признаком, позволяющим дифференцировать коринебактерии ульцеранс.

Производят посев исследуемой культуры в пробирку с нитратным бульоном, инкубируют в течение 24 часов при температуре 37°С. Затем добавляют 2-3 капли реактива на нитриты (Грисса или Касаткина). В случае, если произошло образование нитритов, среда окрашивается в красный цвет. Если микроорганизм не обладает нитратредуктазой, изменения окраски среды не происходит. Одновременно с опытными пробирками, инкубируют контрольную пробирку со стерильной средой.

5. Питательные среды

Качество питательных сред имеет важнейшее значение при любом бактериологическом исследовании. Чтобы добиться максимальной высеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого материала, необходимо создать оптимальные условия для роста, размножения этих бактерий, сохранения их биологических свойств, а также для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры. Это достигается путем использования универсальных питательных основ с добавлением крови и теллурита калия. Теллурит калия, в определенной концентрации, не препятствует росту представителей рода коринебактерий и практически полностью ингибирует рост посторонней микрофлоры. Кровяные теллуритовые среды являются также дифференциально-диагностическими, поскольку колонии коринебактерий на этих средах имеют серую или черную окраску (данные микроорганизмы способны восстанавливать теллурит калия до металлического теллура, вещества черного цвета, и накапливать его внутри клеток).

НПО "Питательные среды", г.Махачкала выпускает сухую хинозольную дифференциально-диагностическую среду Бучина для выделения коринебактерий дифтерии, которая готовится по прописи на этикетке с добавлением 5% крови (не допускается добавление сыворотки вместо крови). Среда Бучина уступает кровяным теллуритовым средам по ингибирующей активности, а колонии возбудителя дифтерии могут появляться на сутки позднее, чем на кровяных теллуритовых средах. В последние годы ГосНИИ прикладной микробиологии (п.Оболенск Московской обл.) выпускает питательную среду для выделения коринебактерий дифтерии - коринебакагар. Однако, по сравнению с кровяными теллуритовыми средами, на данной среде вырастает в 2-3 раза меньше колоний коринебактерий дифтерии.

Учитывая вышеизложенное, по-прежнему, лучшими питательными средами для первичного посева материала являются кровяные теллуритовые среды. В качестве основы для этих сред можно использовать сухой питательный агар (СПА) производства НПО "Питательные среды" (г.Махачкала), питательный агар на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ГРМ) производства ГНИИПМ (п.Оболенск). Питательные агары готовят по прописи на этикетке и ex tempore добавляют кровь и теллурит калия.

Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии выпускается коммерческая сухая среда ОТДМ (НПО "Питательные среды", г.Махачкала) и ГНИИПМ (п.Оболенск Московской обл.). Данные среды готовятся по прописи на этикетке.

Лучшей основой при приготовлении среды для определения токсигенности и пробы Пизу остается Мартеновский пептон, который готовится в условиях лаборатории или в отделах питательных сред некоторых научно-исследовательских институтов для приготовления Мартеновского агара.

Для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии в лабораторных условиях готовят сывороточную агаровую среду. Применение свернутой сыворотки является нецелесообразным.

Каждая новая серия питательной среды (как коммерческой, так и приготовленной в лабораторных условиях) подлежит бактериологическому контролю. В тех случаях, когда ростовые свойства питательной среды не удовлетворяют предъявляемым требованиям, питательные агаровые основы готовят на бульонах - сухой питательный бульон (СПБ) производства НПО "Питательные среды" (г.Махачкала), ГРМ-бульон производства ГНИИПМ (п.Оболенск); бульон на аминопептиде для микробиологических целей производства мясокомбинатов (г.г.С.-Петербург, Армавир, Ставрополь) и бульонах, приготовленных в лабораторных условиях (перевар Хоттингера, 1% пептонная вода, с содержанием аминного азота 150-180 мг/%).

Питательные среды для первичного посева разливают по чашкам Петри слоем 3-4 мм. Они могут быть использованы в течение 3 суток, при условии хранения при температуре 4°С.

Методы приготовления питательных сред и реактивов

Транспортная среда (среда накопления)

В качестве основы для приготовления транспортной среды используют 0,1% питательный агар на переваре Хоттингера или 0,1% агар на коммерческом питательном бульоне, рН 7,6.

0,1% агаровую основу разливают в пробирки по 4 мл, стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 20 мин. Срок хранения - до 1 месяца при 4°С. Перед употреблением в каждую пробирку, с соблюдением правил асептики, добавляют 0,5-1,0 мл сыворотки крупного рогатого скота и по 0,05 мл (1 капля) 2% раствора теллурита калия. Среду выборочно контролируют на стерильность, выдерживая при 37°С в течение 48 часов. Срок хранения готовой среды - 10 дней при 4°С.

Жидкая питательная среда для постановки РНГА

С целью индикации дифтерийного токсина в РНГА материал с чашки первичного посева засевают в пробирку с жидкой сывороточной питательной средой, приготовленной на основе бульона Мартена, с содержанием аминного азота 150-180 мг/%, рН 7,6. Питательный бульон разливают в пробирки по 3,5 мл, стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 20 мин. Срок хранения - до 1 мес. при температуре 4°С.

Перед употреблением в каждую пробирку с соблюдением правил асептики добавляют 0,5 мл сыворотки крупного рогатого скота и 0,05 мл (1 капля) 2% раствора теллурита калия. Среду контролируют на стерильность и хранят так же, как и полужидкую транспортную среду.

Среды для первичного посева исследуемого материала

Среда Клауберга II

К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (рН 7,6), расплавленной и охлажденной до 50°С, добавляют 10 мл глицериновой смеси, 50 мл "лаковой" крови и 3 мл 2% раствора теллурита калия. Принимая во внимание, что питательная среда разводится глицериновой смесью и "лаковой" кровью в 1,6 раза, при приготовлении данной среды следует увеличить навеску сухого питательного агара, в 1,6 раза.

Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческим питательным агаром указана навеска, необходимая для приготовления одного литра среды, например 30 г. Для приготовления 1 литра питательной основы для среды Клауберга II следует взять навеску 48 г (т.е. 30 г х 1,6 = 48 г).

Для приготовления глицериновой смеси к 40 мл дефибринированной крови или кровяной смеси добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуют при температуре 110°С в течение 30 мин.).

Для приготовления "лаковой" крови к 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови.

Кровяной теллуритовый агар (КТА)

К 100 мл стерильной питательной агаровой основы (рН 7,6), расплавленной и охлажденной до 50°С, добавляют 7 мл дефибринированной или 10 мл гемолизированной крови и 2 мл 2% раствора теллурита калия. Вместо крови можно использовать сухую теллуритовую смесь (11 мл на 100 мл среды), при этом, на 100 мл КТА добавляют extempore 1 мл 2% раствора теллурита калия, т.к. 1 мл 2% раствора уже содержится в 11 мл кровяной теллуритовой смеси. Принимая во внимание, что питательная среда разводится кровью примерно в 1,1 раза, при приготовлении данной среды следует увеличить навеску сухого питательного агара в 1,1 раза.

Пример расчета. На этикетке флакона с сухим коммерческим питательным агаром указана навеска, необходимая для приготовления одного литра среды, например, 30 г. Для приготовления 1 литра питательной основы для КТА следует взять навеску 33 г (т.е. 30 г х 1,1 = 33 г).

Методика приготовления кровяных и кровяно-теллуритовых смесей

Для приготовления питательных сред лучше всего использовать дефибринированную кровь животных - крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец, кроликов. Кровь собирают в стерильные сосуды с бусами с помощью специально смонтированной системы, соблюдая правила асептики. В отдельных случаях кровь собирают, не монтируя специальных систем, сливая первые порции крови вне бутыли.

Можно использовать кровь человека с истекшим сроком годности (цитратную и с консервантами), приготовив из нее специальные кровяные смеси. Для этого необходимо удалить жидкую часть отстоявшейся крови, содержащую цитрат натрия и консерванты. К оставшейся в сосуде эритроцитарной массе добавить стерильный физиологический раствор, который также можно удалить после оседания эритроцитов, и добавить дистиллированной воды до первоначального объема.

Хорошим сырьем для получения кровяной смеси служит эритроцитарная масса, которая может оставаться при производстве гаммаглобулина и других препаратов крови. К эритроцитарной массе добавляют стерильную дистиллированную воду из расчета 1/3 объема эритроцитарной массы.

Можно также использовать кровяные сгустки, остающиеся после серологических реакций (при отрицательном результате реакции), сгустки плацентарной или абортной крови. Сгустки собирают в стерильные бутыли со стеклянными бусами или битым стеклом, затем их замораживают и оттаивают, после чего сгустки легко разбиваются бусами. Эту процедуру можно повторить 2-3 раза. Затем добавляют стерильную дистиллированную воду из расчета 1/4 объема сгустков.

В кровяные смеси, приготовленные вышеуказанным способом, добавляют теллурит калия в качестве консерванта. К каждым 10 мл кровяной смеси добавляют 1 мл 2% раствора теллурита калия. Такую кровяно-теллуритовую смесь можно сохранять при 4°С до 2-х месяцев.

Пример расчета. Если из отстоявшейся цитратной крови объемом 250 мл было удалено 50-60 мл жидкой части, то необходимо добавить такое же количество - 50-60 мл стерильного физиологического раствора, перемешать, вновь дать отстояться, после чего удалить 50-60 мл жидкой части и внести 50-60 мл стерильной дистиллированной воды. Таким образом, будет получено 250 мл кровяной смеси. Для ее консервирования необходимо добавить 25 мл 2% теллурита калия (на каждые 10 мл кровяной смеси прибавляют 1 мл 2% теллурита калия).

В дальнейшем, при приготовлении кровяной теллуритовой среды, на каждые 100 мл питательного агара добавляют 11 мл кровяной теллуритовой смеси (10 мл кровяной смеси и 1 мл 2% раствора теллурита калия). Ex tempore в такую среду добавляют еще 1 мл 2% раствора теллурита калия.

Приготовление раствора теллурита калия

Для теллуритовых сред используют готовый коммерческий 2% раствор теллурита калия.

При отсутствии коммерческого препарата раствор теллурита калия готовят следующим образом: в 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г кристаллического теллурита калия. Для стерилизации раствор прогревают в кипящей водяной бане 30 мин. и сохраняют при температуре 4°С. Кристаллический теллурит калия хранят герметически закрытым в банке из темного стекла.

Сывороточный агар

Сывороточный агар, используемый для отсева колоний и культивирования коринебактерий дифтерии, может быть приготовлен на любой из перечисленных выше питательных основ.

К 100 мл расплавленного и охлажденного до температуры 50°С питательного агара (рН 7,6) стерильно добавляют 10 мл сыворотки крупного рогатого скота. Среду перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 4-5 мл и устанавливают их в наклонном положении для получения скошенного агара, каждая партия которого проверяется на стерильность. Несколько пробирок помещают на сутки в термостат. В случае прорастания среды бракуется вся партия. Пробирки со скошенным сывороточным агаром хранят при 4°С до 2 недель.

Мартеновский агар с мясной водой двойной концентрации

Мартеновский пептон - 0,5 л, мясная вода - 0,5 л, агар-агар - 15 г, уксусно-кислый натрий - 5 г, мальтоза - 3 г.

15 г агара промывают в течение рабочего дня в проточной водопроводной воде, тщательно отжимают и переносят в 1 л мартеновского бульона (0,5 л мартеновского пептона и 0,5 л мясной воды). Устанавливают рН 7,8-8,0 путем подщелачивания бульона 20% раствором NaOH по бумажке с индикатором крезоловый красный, которая при этой реакции изменяет желтый цвет на розово-малиновый. Бульон кипятят в течение 10 мин, затем добавляют 0,5% (5 г на 1 л) уксусно-кислого натрия, 0,3% мальтозы (3 г на 1 л), проверяют рН и, если нужно, снова доводят до 7,8-8,0, кипятят в течение 15 мин., дают отстояться в теплом месте (в аппарате Коха или термостате) 2-3 часа и фильтруют через тканевый или ватно-марлевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70-80 мл) при большом объеме работы или пробирки (10 мл) и стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 мин.

Мартеновский пептон

Свиные желудки, желательно парные, с упругими стенками, большим количеством слизи и без катаральных явлений очищают от жира (желудки, пропитанные желчью отбрасывают), разрезают и измельчают в мясорубке. Полученный фарш из желудков помещают в бутыли емкостью 3-5 литров и заливают подогретой до 50°С водой из расчета на 1 литр воды 300-500 г измельченной массы. Туда же добавляют 1% химически чистой соляной кислоты (уд.вес 1,19). Массу хорошо перемешивают и ставят в термостат: либо на 15-18 часов (или более) при 37°С; либо, при наличии отдельного термостата при 42°С, на 18 часов (или более). В течение процесса переваривания бутыль встряхивают, вначале чаще (через 1-1,5 часа), затем реже. В хорошо переваренном пептоне на дне бутыли лежит небольшой слой мелкого темного осадка.

Полноту осаждения балластных белков можно проверить путем добавления к 5 мл профильтрованного пептона 1-2 капли 10% NaOH, муть не должна появляться.

Действие фермента останавливают нагреванием в водяной бане, постепенно доводя температуру до 80°С, устанавливаемую по показанию термометра, погруженного в бутыль с переваром. Нагревание продолжается в течение 10 мин. Для этой цели можно использовать аппарат Коха или автоклав. Бутыли тщательно взбалтывают, закрывают ватно-марлевой пробкой с бумажным колпачком и ставят в прохладное сухое помещение для отстаивания при температуре не выше 12°С. Пептон годен к употреблению не ранее, чем через 7 дней, когда плотно осядут взвешенные частицы.

Необходимо добавить 20 мл хлороформа на 1 л пептона для консервирования и закрыть бутыль резиновой пробкой. В таком виде пептон может храниться без стерилизации при комнатной температуре.

Мясная вода

Для приготовления мясной воды двойной концентрации желательно использовать свежее мясо молодого животного, средней упитанности. Обезжиренное, освобожденное от сухожилий мясо пропускают через мясорубку, заливают водой в пропорции 1 л воды на 1 кг фарша и оставляют на ночь при 4°С, утром смесь кипятят на асбестовой сетке в течение 15-20 мин. с момента закипания. Готовый отвар фильтруют, фарш отжимают, полученную мясную воду разливают в стерильные бутыли по 250-500 мл и стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Хранят при 4°С.

Бумажки с индикатором крезоловый красный

0,1 г крезолового красного растворяют в 100 мл 95% спирта и оставляют при температуре 37°С на 24 часа, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

Среды для определения цистиназной активности

Среда Пизу на Мартеновском агаре

К 90 мл расплавленного 1,5% Мартеновского агара (не допускается использование агара Хоттингера), рН 7,6, добавляют 2 мл 1% раствора L-цистина в 0,1N растворе соляной кислоты (НСl), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1N раствора NaOH для нейтрализации кислоты. Растворы кислот и щелочей должны быть взаимно оттитрованы, можно использовать фиксаналы, выпускаемые предприятиями химической промышленности.

Среду стерилизуют при температуре 112°С в течение 30 мин., сохраняют в течение 1 месяца при 4°С.

Агар с цистином расплавляют при 90°С (среду не кипятят - для сохранения цистина). К охлажденной до 45°С среде добавляют 1 мл 10% раствора уксуснокислого свинца и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота, с соблюдением правил асептики, и разливают по пробиркам.

Необходимо учитывать, что при температуре среды 50°С и выше, в присутствии уксуснокислого свинца, сыворотка мутнеет и среда приобретает молочный цвет. Это затрудняет учет результатов реакции.

Среда Пизу на основе коммерческой среды АГВ

Для приготовления среды Пизу можно использовать доступную и сбалансированную по составу коммерческую среду АГВ, применяемую в бактериологической практике для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Навеску сухой среды АГВ в количестве 2,7 г вносят в 90 мл дистилированной воды и кипятят до ее полного растворения. Готовят 5% раствор гидрокарбоната натрия. Для этого растворяют 0,5 г NаНСО3 в 10 мл дистиллированной воды. Затем в раствор вносят 0,1 г L-цистина и кипятят до полного растворения цистина Затем 2 мл кипящего щелочного раствора цистина вносят в 90 мл расплавленной среды АГВ, доводят рН до 7,6 и стерилизуют при 112°С в течение 10 мин. К расплавленной и охлажденной до 45°С основе последовательно добавляют: 10 мл сыворотки крупного рогатого скота, 1 мл 10% раствора уксуснокислого свинца, 1,5 мл стерильного свежеприготовленного 10% раствора тиосульфата натрия и разливают по пробиркам.

Растворы уксуснокислого свинца и тиосульфата натрия готовят ех tempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане в течение 30 мин.

Данный вариант среды Пизу используют при отсутствии Мартеновского агара. Однако необходимо учитывать, что дифференциально-диагностические свойства этой среды по сравнению со средой, приготовленной на Мартеновском агаре, менее выражены.

Среды для определения уреазной активности

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах: по методу Заксе и путем посева на бульон с мочевиной.

Приготовление реактивов для определения
уреазной активности по методу Заксе

Готовят 2 реактива - А и В.

Реактив А:

Мочевина 2 г.

96% этиловый спирт 2 мл.

Дистиллированная вода 4 мл.

Реактив В:

     0,2% раствор фенолрот                     1 мл.

     Однозамещенный фосфат калия (KH2PO4)      0,1 г.

     Двузамещенный фосфат калия (К2НРО4)       0,1 г.

     Хлорид натрия (NaCl)                      0,5 г.

     Дистиллированная вода                     100 мл.

Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре 4°С. Реактив В стерилизуют в автоклаве текучим паром.

Бульон с мочевиной.

К 100 мл стерильного мясо-пептонного или бульона Хоттингера (рН 7.0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора индикатора крезолрот. Разливают по 2-3 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 10 мин.

Среда для определения сахаролитической активности

Для определения сахаролитической активности рекомендуется использовать питательную среду на 1% пептонной воде.

К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г химически чистого NaCl и 1 мл индикатора Андреде. Устанавливают рН 7,4, кипятят 5 мин, фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой. К полученной основе добавляют один из углеводов: сахарозу, глюкозу (в количестве 1 г), крахмал (0.5 г).

Среды разливают в пробирки по 2-3 мл и стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 мин или при 0,5 атм 30 мин. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветные или имеют слегка розоватый оттенок.

Индикатор Андреде

Посуда для приготовления индикатора должна быть сухой, химически чистой, с притертой пробкой.

К 100 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г кислого фуксина и 16,4 мл 4%-го раствора NаОН. Раствор на сутки оставляют при 37°С, периодически встряхивая, двое суток выдерживают на свету и затем убирают в темное место. Свежеприготовленный раствор имеет соломенно-желтый цвет или слегка розовый оттенок, который исчезает в процессе хранения. При интенсивно-розовой окраске раствора в процессе приготовления индикатора, необходимо добавить еще 1,6 мл 4%-го раствора NaOH.

Среда для определения нитратредуктазной активности

К 100 мл питательного бульона (МПБ или бульона Хоттингера) рН 7,37,5, свободному от нитритов (проверить реактивом Грисса или Касаткина), прибавляют 0,1 г свободного от нитритов нитрата калия (КNО3). Проверяют еще раз на содержание нитритов и разливают по 2 мл в химически чистые, сухие пробирки. Среды стерилизуют 15 мин при 120°С.

Реактив Грисса

Раствор 1: 0,8% сульфаниловая кислота в 5N уксусной кислоте.

Раствор 2: 0,6% диметил-альфа-нафталамин в 5N уксусной кислоте. Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин., бесцветен, при появлении розового окрашивания - непригоден. Растворы 1 и 2 хранят при 4°С в течение 2 мес.

Реактив Касаткина.

Раствор 1: 0,1% раствор риванола в дистиллированной воде.

Раствор 2: 12% раствор соляной кислоты (НСl).

Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин. Растворы 1 и 2 хранят при 4°С в течение 2 мес.

Рецепты красок.

1. Щелочной метиленовый синий Леффлера.

     Дистиллированная вода                       99 мл.

     1% раствор гидроксида калия (КОН)           1 мл.

     10% спиртовой раствор метиленового синего   30 мл.

     Смешать. Окрашивать в течение 1-2 мин.

2. Уксуснокислый толуидиновый синий.

     Толуидиновый синий                          0,5 г.

     Ледяная уксусная кислота                    2 мл.

     96% этиловый спирт                          5 мл.

     дистиллированная вода                       100 мл.

     Смешать. Окрашивать в течение 3-5 мин.

3. Кристаллический фиолетовый.

     Кристаллический фиолетовый                  0,25 г.

     5% раствор уксусной кислоты                 100 мл.

     Смешать. Профильтровать. Окрашивать в течение 5-7 мин.

Методы контроля питательных сред

Бактериологическому контролю подлежат среды для первичного посева материала и среды для определения токсигенных, биохимических и сахаролитических свойств. При изготовлении сред важным моментом является предварительный контроль основы среды на содержание аминного азота.

Метод количественного определения аминного азота.

Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при рН 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Реактивы:

1. Гидроксид натрия (NaOH) 0,1N раствор.

2. Соляная кислота (НСl) 0,1N раствор

4. формалин (40% раствор формальдегида). Перед каждым определением необходимо довести рН формалина до 7,0.

Ход определения

Для анализа используют определенный объем жидкого образца. Для жидких гидролизатов с низкой степенью расщепления (0,1-0,2% аминного азота) - 3 мл; со средней степенью расщепления (0,3-0,6% аминного азота) - 1 мл; с высокой степенью расщепления (0,7-1,3% аминного азота) - 0,5 мл; для жидких питательных сред (0,08-0,04% аминного азота) - 3 мл; для жидких экстрактов (0,02-0,04% аминного азота) - 10 мл.

В стакан емкостью 50 мл вносят исследуемый образец и доводят общий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электроды потенциометра погружают в исследуемый раствор и доводят рН раствора до 7,0 с помощью 0,1N раствора NaOH или 0,1N раствора НСl. Затем добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и, не вынимая электродов, титруют содержимое пробы с помощью 0,1N раствора NaOH до рН 9,1. При титровании следует использовать микробюретку на 5 мл.

Содержание аминного азота в исследуемом образце в % (X) вычисляют по формуле;

          АхКх1,4х100

     Х = -------------, где

             Вх1000

А - количество 0,1N раствора NaOH в мл, пошедшее на титрование исследуемой пробы;

К - поправка к титру 0,1N раствора NaOH;

1,4 - количество аминного азота в мг, эквивалентное 1 мл 0,1N раствора NaOH;

100 - коэффициент пересчета в проценты;

В - количество жидкого образца в мл, взятое на анализ;

1000 - коэффициент пересчета мг в г.

Метод бактериологического контроля питательных сред.

В практических лабораториях каждая партия питательных сред, особенно при использовании новых основ (промышленного или лабораторного изготовления) и новых ингредиентов, подлежит бактериологическому контролю ввиду возможной их нестандартности.

1. Контроль качества сред для первичного посева исследуемого материала устанавливают путем определения:

а) всхожести клеток коринебактерий дифтерии;

б) времени формирования колоний;

в) ингибирующей активности в отношении сопутствующей микрофлоры.

С этой целью используют контрольный токсигенный штамм или свежевыделенные токсигенные культуры коринебактерий дифтерии с типичными культурально-морфологическими свойствами, штамм золотистого стафилококка (музейный или свежевыделенный).

Суточные культуры коринебактерий дифтерии и стафилококка, выращенные на сывороточном агаре, смывают физиологическим раствором. Мутность полученной суспензии должна соответствовать 10 ед. оптического стандарта мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича (условно 1 млрд. бактериальных клеток в 1 мл взвеси). Из исходных взвесей культур коринебактерий дифтерии и стафилококка готовят последовательные разведения в физиологическом растворе (см.схему).

Схема приготовления разведений культуры
коринебактерий дифтерии и стафилококка

N про бирки	Кол-во физиол. р-ра, мл	Объем вносимой суспензии, мл	Условное кол-во микр.клеток в 1 мл взвеси
1	1,0	1,0 из исходной взвеси	5х10(8)
2	4,5	0,5 из 1-й пробирки	5х10(7)
3	4,5	0,5 из 2-й пробирки	5х10(6)
4	4,5	0,5 из 3-й пробирки	5х10(5)
5	4,5	0,5 из 4-й пробирки	5х10(4)
6	4,5	0,5 из 5-й пробирки	5х10(3)
7	2,0	0,5 из 6-й пробирки	10(3)

Из двух последних разведений (6-го и 7-го) по 0,1 мл суспензии культуры коринебактерий дифтерии вносят в две чашки с испытуемой средой, досуха втирают стеклянным шпателем. На две другие чашки с испытуемой средой таким же образом, из 6-го и 7-го разведений, производят посев стафилококковой взвеси.

Учет результатов производят через 24 и 48 часов. Колонии коринебактерий дифтерии должны формироваться на испытуемой среде через 24 часа инкубации. При высеве из 7-го разведения должна вырастать хотя бы одна колония коринебактерий дифтерии. При высеве из 7-го разведения взвеси стафилококка чаще всего роста не наблюдается.

При отсутствии формирования колоний коринебактерий дифтерии через 24 часа инкубации в посевах из 6-го и 7-го разведений или через 48 часов инкубации в посеве из 7-го разведения, необходимо обратить внимание на качество питательной основы, из которой приготовлена среда для первичного посева материала. В этом случае ростовые свойства среды улучшают путем приготовления агаровой основы на питательных бульонах.

Если наблюдается рост единичных колоний стафилококка в посеве из 7-го разведения, то такая среда может использоваться для посева, но в журнале контроля питательных сред отмечают сниженные ингибирующие свойства данной серии среды. Повышение концентрации теллурита калия в среде не допускается.

2. Контроль среды для определения токсигенности коринебактерий дифтерии осуществляют путем испытания ее контрольным токсигенным штаммом, соблюдая все этапы методики определения токсигенных свойств на плотных питательных средах. Критерием оценки качества среды является наличие специфических линий преципитации и время их образования. Пригодными для работы считаются такие серии среды, при использовании которых у контрольного токсигенного штамма интенсивные линии преципитации образуются не позднее 24 часов после посева "бляшками". Среды (или новые ингредиенты) не могут быть использованы и подлежат замене в случае отсутствия линий преципитации или появления их в более поздние сроки.

3. Бактериологический контроль сред для определения биохимических свойств проводят путем определения степени выраженности и времени формирования признака. В среду Пизу, бульон с мочевиной (или субстрат по методу Заксе), среды Гисса, бульон с KNO3 засевают петлей контрольный дифтерийный штамм. При проверке сред Гисса используется контрольный штамм биоварианта "гравис", а для контроля сред с мочевиной используется также штамм ложнодифтерийной палочки Гофмана.

6. Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации для
выявления дифтерийного токсина (РНГА)

РНГА не является методом, обязательным к постановке в практических бактериологических лабораториях. Вместе с тем, использование его позволяет выявлять слаботоксигенные штаммы C.diphtheriae, определять уровень токсинообразования циркулирующих штаммов и, в некоторых случаях, сокращать сроки индикации дифтерийного токсина.

В настоящее время данный метод может использоваться для выдачи предварительного ответа в ходе бактериологического исследования при наличии в лаборатории тест-системы и специально обученного персонала. В дальнейшем, при накоплении опыта работы с РНГА, усовершенствовании тест-системы возможно включение этой реакции в схему бактериологической диагностики дифтерийной инфекции для ускоренного выявления дифтерийного токсина.

РНГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела (антитоксин), вступающие во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином (анатоксином). При наличии в исследуемой пробе токсина образуется специфический комплекс: дифтерийный токсин + сенсибилизированные антитоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

Оснащение для проведения РНГА

Для проведения РНГА необходимы:

- коммерческий набор "Диагностикум эритроцитарный дифтерийный антительный жидкий для определения токсина в РНГА" (изготовитель НИИЭМ им.Л.Пастера, С.Петербург);

- капельницы, петли из набора Такачи объемом 0,025 мл (возможна постановка реакции петлями объемом 0,05 мл, что предполагает увеличение расхода диагностикума и других компонентов реакции в 2 раза), или автоматические пипетки, установленные на объем 25 мкл (или 50 мкл);

- мерная посуда;

- дистиллированная вода;

- 0,85%-ный раствор хлорида натрия с 0.5%-ным содержанием нейтрального формалина, рН 7,2 (раствор 1);

- полистироловые планшеты "U" образные (со сферическим дном) из набора Такачи или отечественного производства для иммунологических реакций (многократного использования).

Набор диагностикума содержит:

1. Диагностикум эритроцитарный жидкий 3%-ный;

2. Положительный контроль-дифтерийный анатоксин, жидкий, Lf/мл;

3. Нормальная кроличья сыворотка (НКС), сухая, 10%-ная.

Подготовительные работы при исследовании материала в РНГА

Накануне тестирования исследуемого материала.

1. Приготовление раствора 1.

К 79 мл 0,85%-ного раствора, хлорида натрия с рН 7,2 добавляют 1 мл нейтрального 40%-ного раствора формалина, размешивают. Хранят при температуре 4°С без ограничения срока.

1.1. Приготовление 0,85%-ного раствора хлорида натрия, рН 7,2.

Навеску хлорида натрия 8,5 г растворяют в 1000 мл свежеперегнанной дистиллированной воды, тщательно перемешивают. Доводят рН до 7,2 с помощью гидроксида натрия 4%-ной концентрации.

1.2. Приготовление 4%-ного раствора гидроксида натрия (NaOH).

4 г гидроксида натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Хранят в плотно закрытой склянке или полиэтиленовом флаконе при температуре 4°С в течение 1 месяца.

1.3. Приготовление нейтрального формалина.

Коммерческий 40%-ный раствор формалина нейтрализуют добавлением углекислого кальция (СаСО3) или углекислого магния (МgСО3) в соотношении 3:1. Оставляют в темном месте при комнатной температуре на 2-3 дня, периодически взбалтывая. Затем дают раствору отстояться. Перед употреблением, с помощью индикатора бромтимоловый синий, проводят контроль рН, значение которого должно быть 7,0. По мере надобности, надосадочную жидкость используют для приготовления раствора 1.

2. Подготовка исследуемого материала, положительного и отрицательного контролей.

Накануне постановки РНГА исследуемый материал с чашки первичного посева, контрольные токсигенный и нетоксигенный штаммы коринебактерий дифтерии засевают в жидкую питательную среду (см. раздел "Питательные среды") и инкубируют при 37°С в течение 18 часов. Параллельно инкубируют пробирку с жидкой питательной средой (без материала).

В день постановки реакции готовят рабочие разведения всех компонентов реакции.

1. Приготовление рабочего разведения дифтерийного анатоксина 1:100.

Раствор готовят методом последовательных разведений. Разведение анатоксина 1:10: из флакона, содержащего 10 Lt/мл, переносят 0,2 мл в пробирку, содержащую 1,8 мл раствора 1, тщательно перемешивают. Разведение анатоксина 1:100: 0,1 мл анатоксина в разведении 1:10 вносят в 0,9 мл раствора 1, тщательно перемешивают (содержит 0,1 Lf/мл).

Раствор хранению не подлежит!

2. Приготовление 1%-ного раствора нормальной кроличьей сыворотки.

Во флакон "Нормальная кроличья сыворотка, 10%-ная, сухая" вносят 2 мл раствора 1, тщательно перемешивают (раствор сыворотки 10%-ной концентрации можно хранить при температуре 4°С до 1 месяца), затем переносят в мерную емкость и доводят объем до 20 мл раствором 1. Раствор НКС 1%-ной концентрации имеет вид слегка опалесцирующей жидкости, который можно хранить при комнатной температуре не более 10 часов,

3. Приготовление раствора диагностикума в рабочем разведении (0,5%-ной концентрации).

Диагностикум эритроцитарный 3%-ной концентрации при хранении образует два слоя: прозрачная бесцветная надосадочная жидкость и осадок коричневого цвета, разбивающийся при встряхивании. Разгерметизированный 3%-ный раствор диагностикума можно хранить при 4°С в течение месяца. Для приготовления 0,5%-ного раствора диагностикума к содержимому флакона (после встряхивания) добавляют 4 мл раствора 2, тщательно перемешивают, переносят в мерную емкость, добавляют еще 8 мл раствора 2, получая, таким образом, рабочее разведение диагностикума. Раствор 0,5%-ной концентрации может храниться при комнатной температуре не более 10 часов.

4. Подготовка планшетов и петель.

Лунки планшетов протирают тампоном, смоченным раствором 1; петли прожигают, В дальнейшем обработку петель проводят в соответствии с "Наставлением" к аппарату Такачи. Старые петли, имеющие дефекты от постоянного прокаливания, не пригодны к употреблению, так как они не могут удерживать нужный объем жидкости.

Постановка РНГА

1. Внесение раствора 1.

Во все лунки планшетов вносят по 0,025 мл раствора 1.

2. Внесение раствора дифтерийного анатоксина в рабочем разведении (1-ый положительный контроль - для оценки чувствительности диагностикума).

В первую лунку 1-го вертикального ряда планшета (А1) вносят 0,025 мл дифтерийного анатоксина (в разведении 1:100 или 0,1 Lf/мл) и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки (H1) включительно. Разведения анатоксина в лунках: 1-ой - 1:200 или 0,05 Lf/мл, 2-ой - 1:400 или 0,025 Lf/мл, 3-ей - 1:800 или 0,012 Lf/мл, 4-ой - 1:1600 или 0,006 Lf/мл, 5-ой - 1:3200 или 0,003 Lf/мл, 6-ой - 1:6400 или 0,0015 Lf/мл, 7-ой - 1:12800 или 0,0007 Lf/мл, 8-ой -1:25600 или 0,0003 Lf/мл.

3. Внесение надосадочной жидкости среды культивирования контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии (2-й положительный контроль - для оценки качества питательной среды и условий культивирования штаммов).

В 1-ую лунку 2-го вертикального ряда (А2) вносят 0,025 мл этой пробы и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки (Н2) включительно (от 1:2 до 1:256).

4. Внесение надосадочной жидкости среды культивирования контрольного нетоксигенного штамма коринебактерий дифтерии (1-й отрицательный контроль - для оценки специфичности диагностикума).

В 1-ую лунку 3-го вертикального ряда (A3) вносят 0,025 мл этой пробы и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки (НЗ) включительно (от 1:2до 1:256).

5. Внесение пробы жидкой питательной среды, без материала (2-й отрицательный контроль - на отсутствие способности среды культивирования вызывать агглютинацию диагностикума).

В 1-ую лунку 4-го вертикального ряда (А4) вносят 0,025 мл среды культивирования и титруют с двукратным шагом до 5-ой лунки (Е4) включительно (от 1:2 до 1:32).

6. Внесение исследуемых проб.

В первые лунки оставшихся рядов (с 5 по 12) вносят по 0,025 мл надосадка среды культивирования исследуемого материала и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки включительно (от 1:2 до 1:256).

Пробирки с исследуемыми и контрольными пробами перед взятием материала не встряхивать!

7. Внесение рабочего разведения диагностикума (0,5%-ной концентрации).

а) В 2-3 лунки, содержащие только раствор 1, вносят по 0,025 мл диагностикума (3-й отрицательный контроль - на отсутствие неспецифической агглютинации диагностикума. Контроль ставят на каждом планшете!/

б) Во все лунки с исследуемым материалом (см. пункт 6), положительными (см. пункты 2, 3) и отрицательными (см. пункты 4, 5) контролями вносят по 0,025 мл диагностикума.

Содержимое лунок перемешивают легким постукиванием пальца по краю планшета. Планшеты закрывают крышками и оставляют на ровной поверхности при температуре 20°С (перемещение пластин до учета результатов реакции исключается). Через 2,5-3,5 часа производят учет результатов реакции. Допускается учет результатов реакции через 18-24 часа.

Учет и интерпретация результатов

Учет результатов осуществляется визуально - по степени агглютинации эритроцитов:

++++ гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки;

+++ агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;

++ части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;

+ на дне лунки образуется широкое, плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;

- осадок в центральной части лунки в виде дискет или кольца с ровным краем.

Чувствительность диагностикума определяется тем максимальным разведением дифтерийного анатоксина, которое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов не менее, чем на три плюса (+++). Диагностикум должен быть по чувствительности не ниже 0,003 Lf/мл (титр анатоксина не ниже 1:3200 - 5-я лунка). При более низкой чувствительности (4-я лунка и менее) диагностикум бракуется.

Диагностикум не должен давать реакции агглютинации с раствором 1, надосадочной жидкостью среды культивирования контрольного нетоксигенного штамма, средой культивирования без материала.

Качество жидкой питательной среды, используемой для культивирования исследуемого материала и контрольных штаммов, считается удовлетворительным, если положительная реакция (на ++) в ряду разведений контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии наблюдается в лунке с разведением не менее 1:32 (5-я лунка, Е2).

Положительными считаются пробы, давшие реакцию агглютинации с сенсибилизированными эритроцитами не менее, чем на два плюса (++). Содержание токсина в исследуемой пробе выражается величиной титра (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 и т.д.).

Данный метод позволяет определить относительное (условное) количественное содержание токсина в исследуемых пробах. Для этого необходимо умножить выраженное в Lf/мл значение чувствительности тест-системы на обратную величину титра исследуемой пробы. Например, чувствительность тест-системы 0,0015 Lf/мл (реакция агглютинации на +++ в 6-ой лунке ряда разведений дифтерийного анатоксина, или F1). Титр исследуемой пробы 1:4 (реакция агглютинации на ++).

Относительное количество токсина в этой пробе равно 0,006 f/мл (0,0015 Lf/мл х 4=0,006 Lf/мл).

Неспецифическая гемагглютинация в отрицательных контролях

1. В случае появления агглютинации в лунках контроля диагностикума (диагностикум + раствор 1) следует обратить внимание на правильность приготовления и хранения этого раствора.

2. В случае регистрации положительной реакции в разведениях жидкой питательной среды без материала (в лунках А4-Е4) следует проверить среду культивирования (рецептура, рН, сроки хранения), качество сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) и изучить их в РНГА для исключения неспецифической реакции диагностикума с компонентами среды культивирования. Для этого готовят ряд серийных разведений питательного бульона от 1:2 до 1:32. Затем в лунки вносят по 0,025 мл диагностикума в рабочем разведении. При регистрации положительной реакции (гемагглютинации) в лунках питательная основа бракуется. Также готовят ряд серийных разведений от 1:2 до 1:32 раствора 1, содержащего 15% СКРС, используемой в опыте. В лунки вносят по 0,025 мл диагностикума в рабочем разведении. При регистрации положительной реакции данная серия СКРС бракуется.

3. В случае регистрации положительной реакции в разведениях среды культивирования контрольного нетоксигенного штамма коринебактерий дифтерии (лунки АЗ-НЗ), но при отрицательной реакции диагностикума с раствором 1 и жидкой питательной средой данная серия диагностикума бракуется из-за его неспецифичности.

Если происходит агглютинация диагностикума во всех отрицательных контролях, то диагностикум бракуется из-за спонтанной агглютинации сенсибилизированных эритроцитов.

Меры безопасности при постановке РНГА

1. Все ингредиенты тест-системы для РНГА не инфекционны.

2. Работа с исследуемым патогенным материалом, контрольными токсигенным и нетоксигенным штаммами проводится согласно требованиям эпидрежима бактериологических лабораторий при работе с микроорганизмами III группы.

3. При работе с автоматическими пипетками, использованные наконечники помещают в дезраствор на ночь, затем выдерживают в течение суток в мыльном растворе или "Моющем средстве" (жидком), промывают проточной водой в течение 8-10 часов. После этого промывают в дистиллированной воде в течение 1 часа и высушивают.

4. Использованные петли аппарата Такачи помещают в дезраствор на 15-20 минут, затем промывают в смеси Никифорова. Перед употреблением - прожигают.

5. Обработка планшетов. Планшеты после работы помещают в 3%-ный раствор перекиси водорода на 2-3 часа, затем промывают водопроводной водой. Ватно-марлевым тампоном, смоченным мыльной пеной вращательными движениями промывают каждую лунку планшета. Ополаскивают планшеты теплой водой, затем погружают на 24 часа в дистиллированную воду. Планшеты вынимают и высушивают. Планшеты пригодны для повторных исследований.

7. Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для
выявления дифтерийных антитоксических антител (РПГА)

Для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета проводят определение уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека в РПГА.

РПГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

РПГА рекомендуется ставить одновременно с двумя диагностикумами - дифтерийным и столбнячным. Данную реакцию ставят микрометодом, при котором используются малые количества сыворотки крови, растворов и реактивов. Также, по сравнению с макрометодом, микрометод более чувствителен и специфичен. Описанная в данном разделе методика постановки РПГА содержит основные требования, предъявляемые к этой реакции.

Взятие крови для постановки РПГА осуществляют обученные медицинские работники ЛПУ. Кровь берут из пальца в объеме 0,7-1,0 мл. Не допускается взятие крови из вены специально для постановки РПГА. Вместе с тем, возможно использование крови, взятой из вены для проведения комплексных исследований.

Постановку РПГА должен осуществлять специально обученный персонал.

Правила сбора и обработки проб крови для определения антитоксических
противодифтерийных и противостолбнячных антител.

Обследуемый тщательно моет руки с мылом в теплой воде. Подушечку концевой фаланги безымянного пальца левой руки обрабатывают 70% спиртом, место сгиба у концевой фаланги прижимают для лучшего кровенаполнения и наносят два укола стерильным одноразовым скарификатором на расстоянии 2 мм один от другого или один укол двумя скарификаторами взятыми вместе. Массируя опущенный палец, капли крови собирают в стерильную центрифужную пробирку, направляя их "одной дорожкой". Собирают не менее 0,7-1,0 мл крови. Ранку обрабатывают настойкой йода.

Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой и оставляют в наклонном положении для образования "скошенного" сгустка. На пробирке должен быть указан номер, соответствующий записи в журнале регистрации. Через час пробирку переводят в вертикальное положение. При этом, сгусток остается на стенке пробирки, а свободная от эритроцитов сыворотка собирается на дне. Сыворотку переносят в другую пробирку.

В лабораторию для постановки РПГА доставляют либо пробирку со сгустком либо пробирку с сывороткой. Сыворотка может быть заморожена и храниться при температуре -20°С. Замораживать и оттаивать сыворотку крови рекомендуется не более одного раза.

Оснащение для проведения РПГА
(на примере коммерческой тест-системы производства АО "Биомед"
им.Мечникова, п.Петрово-Дальнее, Московской обл.)

Для проведения реакции микрометодом необходимы:

- коммерческий набор для определения противодифтерийных антитоксических антител "Диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий для РПГА";

- мерная посуда;

- капельницы, петли из набора Такачи объемом 0,025 мл (возможна постановка реакции петлями объемом 0,05 мл, что предполагает увеличение расхода диагностикума и других компонентов реакции в два раза), или автоматические пипетки, установленные на объем 25 мкл (или 50 мкл);

- полистироловые планшеты "U" - образные (со сферическим дном) из набора Такачи или отечественного производства для иммунологических реакций (многократного использования);

- дистиллированная вода;

- 0,85%-ный свежеприготовленный раствор хлорида натрия - для разведения испытуемых сывороток.

Коммерческая тест-система содержит:

1. Фосфатно-солевой буферный раствор концентрированный, без твина (ФБР без твина) - для разведения диагностикума и контрольных эритроцитов;

2. Фосфатно-солевой буферный раствор концентрированный с твином (ФБР с твином) - для разведения сыворотки противодифтерийной контрольной и проведения РПГА;

3. Диагностикум эритроцитарный дифтерийный 3%-ный;

4. Эритроциты барана формалинизированные 50%-ные - для адсорбции гетерогемагглютининов в испытуемых сыворотках;

5. Эритроциты барана контрольные 3%-ные;

6. Сыворотка противодифтерийная контрольная, содержащая 10 ME/мл,

Подготовительные работы при исследовании материала в РПГА

1. Подготовка планшетов и др. (см. "Меры безопасности при постановке РНГА", раздел 6).

Перед проведением реакции протирают каждую лунку тампоном, смоченным разведенным ФБР с твином.

2. Приготовление раствора ФБР без твина.

Содержимое флакона "ФБР без твина" разводят до объема 62,5 мл дистиллированной водой (рН готового раствора 7,2). Приготовленный раствор используют в день проведения реакции.

3. Приготовление раствора ФБР с твином.

Содержимое флакона "ФБР с твином" разводят до объема 125 мл дистиллированной водой (рН готового раствора 7,2). Разведенный раствор можно разлить по флаконам, герметически укупорить и хранить при температуре 4°С в течение 72 часов.

4. Приготовление раствора противодифтерийной контрольной сыворотки (СДК).

Сыворотку противодифтерийную контрольную (10 МЕ/мл) разводят в 100 раз до содержания 0,1 МЕ/мл с помощью ФБР с твином. СДК должна быть использована в течение суток.

5. Приготовление рабочего разведения диагностикума эритроцитарного дифтерийного (ДЭД).

Диагностикум эритроцитарный дифтерийный 3%-ный разводят ФБР без твина до 0,3%-ной концентрации.

6. Приготовление рабочего разведения эритроцитов барана контрольных (КЭ).

Контрольные эритроциты 3%-ные разводят до 0,3%-ной концентрации с помощью ФБР без твина.

7. Подготовка исследуемых сывороток.

Исследуемую сыворотку человека перед определением уровня дифтерийного антитоксина разводят 1:5 или 1:10 0,85%-ным свежеприготовленным раствором хлорида натрия. Разведенную сыворотку прогревают в течение 30 мин в водяной бане или инактиваторе при температуре 56°С. Разведенную и прогретую сыворотку адсорбируют эритроцитами барана, формалинизированными 50%-ными, которые перед использованием встряхивают до получения гомогенной взвеси. Эритроциты добавляют из расчета 0,05 мл на 0,5 мл разведенной сыворотки, выдерживают 15-20 часов при температуре 4°С. После сорбции прозрачная надосадочная жидкость готова к исследованию (без предварительного центрифугирования). При срочном исследовании адсорбцию проводят в течение 30 мин в термостате при 37°С, центрифугируют и работают с надосадочной жидкостью.

Постановка РПГА.

1. Внесение ФБР с твином.

Во все лунки планшета вносят по 0,025 мл разведенного ФБР с твином.

2. Внесение испытуемых сывороток.

Петлей вместимостью 0,025 мл в 1-ю лунку ряда вносят 0,025 мл разведенной 1:5 прогретой, адсорбированной испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1:10 и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10-й лунки включительно. Из 10-й лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл. Для экономии всех ингредиентов титрование сывороток можно проводить в 8 лунках по короткому ряду планшета.

Если испытуемые сыворотки разведены 1:10, то в 1-ю лунку планшета вносят по 0,025 мл разведенной 1:10 испытуемой сыворотки. Внесение сыворотки, в этом случае, осуществляют мерной пипеткой (с наконечником). Титрование сыворотки начинают со 2-й лунки.

Для контроля на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана, при постановке РПГА "по длинному ряду", в 11-ю лунку петлей вносят 0,025 мл испытуемой сыворотки, прогретой, адсорбированной, разведенной 1:10 (или 1:5), перемешивают и переносят 0,025 мл в 12-ю лунку. Из 12-ой лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл. При титровании "по короткому ряду" этот контроль для испытуемых сывороток ставят на специально выделенных рядах этого же планшета (в редких случаях - в отдельном планшете).

3. Внесение сыворотки противодифтерийной контрольной (для оценки чувствительности эритроцитарного диагностикума).

В 1-ю лунку ряда вносят 0,025 мл разведенной СДК, получают разведение 1:200, содержимое лунки тщательно перемешивают петлей и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10-ой лунки включительно. Из десятой лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл, 11-я и 12-я лунки, содержащие по 0,025 мл разведенного ФБР с твином, являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации.

В 1-ю лунку ряда, так же как и при титрировании испытуемых сывороток, лучше не вносить 0,025 мл разведенного ФБР с твином. При этом, в 1-ю и 2-ю лунки мерной пипеткой с наконечником вносят по 0,025 мл СДК, разведенной 1:100. Титрование СДК начинают со 2-й лунки.

Контроль на чувствительность диагностикума следует ставить при каждом опыте!

4. Внесение контрольных эритроцитов барана.

При постановке РПГА "по длинному ряду", в 11-ю и 12-ю лунки с испытуемой сывороткой вносят по 0,025 мл рабочего разведения контрольных эритроцитов барана. При постановке РПГА "по короткому ряду", контрольные эритроциты барана вносят в две специально выделенные лунки для каждой испытуемой сыворотки (см. п. 2).

5. Внесение эритроцитарного диагностикума.

Флакон с разведенным диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов и капельницей вносят по 0,025 мл (одна капля) диагностикума в каждую лунку до конца ряда с разведениями контрольной сыворотки и с 1-й до 10-й лунки включительно с разведениями испытуемых сывороток (или с 1-й до 8-й лунки с разведениями испытуемых сывороток при постановке реакции "по короткому ряду".

Разведенный диагностикум может быть использован в течение недели, если его активность соответствует требуемой.

Равномерное распределение эритроцитов в лунках пластин достигается путем постукивания по углам пластины. Пластины остаются на ровной поверхности в течение 2,5-3,5 часов при температуре 20°С (перемещение пластин до учета результатов реакции исключается). Допускается учет результатов реакции через 18-24 часа.

Примечание. Титрование сывороток можно проводить в объеме 0,05 мл, диагностикум при этом добавляют по 0,025 мл в каждую лунку.

Учет и интерпретация результатов.

Результаты РПГА оценивают визуально - по степени агглютинации эритроцитов:

++++ гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки;

+++ агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;

++ агглютинировавшие эритроциты располагаются в центральной части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;

+ на дне лунки образуется широкое, плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;

- осадок в центральной части лунки в виде диска или кольца с ровным краем.

Реакция в контролях на отсутствие в испытуемой сыворотке агглютининов к эритроцитам барана и на отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума должна быть отрицательной. Если испытуемая сыворотка в лунках с контрольными эритроцитами дает гемагглютинацию, нужно повторно адсорбировать из нее гетерогемагглютинины: (то есть повторно провести обработку сыворотки 50%-ными формалинизированными эритроцитами).

За титр испытуемой и контрольной сывороток принимают последнее разведение, дающее агглютинацию эритроцитов на два плюса (++).

При определении специфической активности (чувствительности) диагностикума, агглютинация на два плюса с сывороткой противодифтерийной контрольной должна быть не ниже 1:3200 и не выше 1:12800, что соответствует 5-7 лункам. В противном случае диагностикум бракуется и реакция не учитывается. (Активность столбнячного диагностикума с противостолбнячной контрольной сывороткой должна быть не ниже, чем 1:1280).

Условно-защитным титром как противодифтерийных, так и противостолбнячных антител принимается титр 1:20.

Испытуемые сыворотки с титром противодифтерийных антитоксических антител 1:20 и менее подлежат повторному исследованию в РПГА с использованием уже разведенной 1:5 или 1:10, прогретой, адсорбированной эритроцитами барана сыворотки. При наличии достаточного количества нативной сыворотки, ее вновь разводят 1:5 или 1:10, прогревают, сорбируют эритроцитами барана и исследуют в РПГА. За окончательный результат исследования принимают более высокий титр.

Сравнение количественных показателей содержания антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови, полученных с помощью титрования в РПГА и в коже кролика, не представляется возможным.

Не рекомендуется использовать РПГА для дифференциальной диагностики дифтерийной инфекции и носительства токсигенных коринебактерий дифтерии, поскольку нарастание титра антитоксических антител может иметь место как в том, так и в другом случае. Кроме того, 4-х кратного нарастания титра реакции, которое некоторыми исследователями трактуется как критерий наличия дифтерийной инфекции, может не наблюдаться, поскольку РПГА является полуколичественным методом, с допустимой ошибкой метода +/- одно разведение. Однако РПГА позволяет оценить состояние антитоксического противодифтерийного иммунитета у больного и, в некоторой степени, прогнозировать течение и исход заболевания.