Приложение 2. Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования

Приложение N 2

к приказу Минздрава СССР

от 21 ноября 1979 г. N 1175

Методические указания
по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования

Введение

Настоящим приказом вводятся в действие Методические указания по применению унифицированных методов клинических лабораторных исследований по следующим разделам: общеклинический, гематологический, биохимический, иммунологический.

Методические указания, утвержденные приказами МЗ СССР N 290 от 11 апреля 1972 г., N 960 от 15 октября 1974 г., N 250 от 13 марта 1975 г. и N 558 от 8 июня 1978 г., настоящим приказом не отменяются.

Методические указания составлены с учетом разработанных требований к унифицированным методам.

Работу по унификации клинических лабораторных методов исследования и по составлению настоящих методических указаний выполнили сотрудники

I ММИ им. И.М.Сеченова, Всесоюзного научно-методического и контрольного центра по лабораторному делу МЗ СССР:

     профессор           В.В.Меньшиков - научный руководитель,

     канд. биол. наук    Л.Н.Делекторская,

     канд. мед. наук     Л.М.Пименова,

                         Н.А.Сентебова,

                         С.П.Михайлова,

                         М.Г.Москвитина,

     канд. биол. наук    Н.Б.Самецкая,

                         Л.Д.Добрянская,

     канд. мед. наук     И.Д.Ертанов,

                         Л.М.Борисенко,

                         Т.Н.Александровская,

                         Л.А.Медведева,

                         Н.Н.Турковская,

     канд. мед. наук     Н.М.Плотникова

     при техническом содействии Т.С.Уткиной.

Материалы по скрининг-тестам для выявления наследственных или приобретенных дефектов обмена веществ у детей подготовили сотрудники Научно-исследовательского института педиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР:

     профессор           Ю.Е.Вельтищев,

     профессор           А.А.Ананенко,

     док. мед. наук      Э.А.Юрьева.

Методы по определению поверхностного антигена вирусного гепатита В подготовлены на основе:

материалов, разработанных Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР (канд. биол. наук П.З.Будницкая) и методических рекомендаций, составленных Центральным научно-исследовательским институтом гематологии и переливания крови МЗ СССР (профессор Т.В.Голосова) и утвержденных МЗ СССР.

Работа проводилась под руководством Комиссии по унификации и контролю качества клинических лабораторных методов исследования:

     председатель              - профессор В.В.Меньшиков,

     зам. председателя         - профессор И.С.Балаховский,

     зам. председателя         - канд. биол. наук Л.Н.Делекторская

при содействии Консультативного совета по лабораторному делу МЗ СССР:

     председатель              - профессор В.Т.Морозова

и Всесоюзного научного общества врачей-лаборантов:

     председатель              - профессор А.С.Петрова.

В рецензировании методических указаний приняли участие сотрудники:

клинических кафедр I ММИ им. И.М.Сеченова,

кафедры биохимии I ММИ им. И.М.Сеченова,

Института биологической и медицинской химии АМН СССР,

Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР,

Института ревматизма АМН СССР,

Института питания АМН СССР,

Института сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева АМН СССР,

Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР,

Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР,

кафедры клинической лабораторной диагностики ЦОЛИУ врачей,

III кафедры терапии ЦОЛИУ врачей,

кафедры госпитальной хирургии и анестезиологии II ММИ им. Н.И.Пирогова,

ЦНИЛа II МНИ им. Н.И.Пирогова,

кафедры энзимологии химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова,

Центрального научно-исследовательского института гематологии и переливания крови МЗ СССР,

Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии МЗ СССР,

Всесоюзного научно-исследовательского и испытательного института медицинской техники МЗ СССР,

Московского научно-исследовательского института педиатрии и детской хирургии МЗ РСФСР,

Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР,

Института кардиологии им. Л.А.Оганесяна Армянской ССР,

Куйбышевского медицинского института им. Д.И.Ульянова МЗ РСФСР,

городской клинической больницы N 31 г.Москвы,

городской больницы N 1 г.Москвы.

Общие указания к унифицированным методам

За период, прошедший со времени утверждения последнего приказа Министерства здравоохранения СССР "Об унификации клинических лабораторных методов исследований", проводилась работа в рамках Комплексной программы стандартизации и управления качеством клинических лабораторных исследований, предусматривающая стандартизацию важнейших сторон деятельности клинико-диагностических лабораторий.

В целях подготовки условий для перехода от унификации к стандартизации методов в настоящих указаниях приводится краткая характеристика требований к системе стандартных методов.

В соответствии с требованиями Международной системы единиц (СИ) и Стандарта СЭВ "Метрология. Единицы физических величин (СТ СЭВ 1052-78), который вводится в качестве государственного стандарта СССР с 1 января 1980 г., а также в соответствии с рекомендациями по применению единиц СИ в медицине (1, 2, 3), в "Методических указаниях по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования" результаты и нормальные величины выражены в единицах СИ и дан пересчет ранее применявшихся единиц в рекомендуемые.

Для методов клинической биохимии представлены результаты оценки аналитической надежности методов - воспроизводимость и правильность.

Воспроизводимость оценивалась в серии и изо дня в день на контрольных сыворотках с расчетом коэффициента вариации.

Правильность оценивалась путем сравнения с выбранными наиболее точными методами с определением достоверности различий по тесту Стьюдента (t-тест) при n>20 или по тесту Вилкоксона (непараметрический критерий - Т-тест) при n<20, а также оценкой статистической связи с расчетом коэффициента корреляции и уравнения регрессии (4, 5, 6).

Приведенные данные свидетельствуют о хорошей воспроизводимости представленных методов клинической биохимии и об отсутствии существенных систематических погрешностей по отношению к сравниваемым методам.

Оценка аналитической надежности методов проводилась на приборах:

1) Фотоэлектроколориметр типа ФЭК-М. Пределы измерений светопропускания от 100% до 1%; допустимая абсолютная погрешность показаний прибора +-1%, вариации показаний прибора (воспроизводимость) +-0,3% (7, 8).

2) Спектрофотометр типа СФ-4А. Рабочий диапазон 220 нм - 1100 нм. Пределы измерения: оптической плотности 0-2, пропускания 100%-0%; абсолютная погрешность показаний прибора +-1%; точность длины волны +-1 нм (9, 10).

При проведении исследований по унифицированным методам рекомендуется руководствоваться следующими указаниями:

- взвешивание на аналитических весах производят с точностью до 0,0002 г, на технических весах - с точностью до 0,01 г;

- для измерения объемов жидкости и приготовления растворов используют мерную посуду, соответствующую ГОСТам: ГОСТ 1770-74 - "Цилиндры, мензурки, колбы мерные" и ГОСТ 20292-74 - "Бюретки, пипетки";

- под "холодной", "прохладной" температурой подразумевают температуру 12°С - 15°С; под "теплой" - 40°С - 50°С; под "горячей" - 80°С - 90°С. Под "комнатной" - подразумевают температуру 18°С - 20°С. Под температурой "кипящей водяной бани" подразумевают температуру 98°С - 100°С (11);

- если для растворов не указан растворитель, то подразумевают водные растворы;

- под названием "вода", если нет особых указаний, следует понимать дистиллированную воду (11);

- для приготовления растворов реактивов используют дистиллированную воду, соответствующую ГОСТу 6709-72;

- используют химические реактивы, срок хранения которых не истек, а условия хранения и упаковки соответствуют ГОСТу на данный реактив, или указаны на этикетке.

Растворы реактивов для унифицированных методов готовятся в объеме, приемлемом для данной лаборатории, в зависимости от стабильности растворов реактивов и числа проводимых исследований; для большинства реактивов указаны допустимые квалификации. В тех случаях, когда квалификация реактивов не указана, можно пользоваться реактивами квалификации ч, чда или хч.

Для реактивов, которые не производятся отечественной промышленностью, квалификация не указана.

Правила приготовления растворов кислот и щелочей приведены в руководствах по технике лабораторных работ (12, 13).

Описание предварительных операций - очистка, мытье и сушка лабораторной посуды приведены в соответствующих руководствах (12, 14).

В связи с переходом на Международную систему единиц, концентрация растворов реактивов в унифицированных методах выражена в молярной (моль/л) или в массовой (г/л раствора) концентрации.

Литература

1. Методические указания. Внедрение и применение СТ СЭВ 1052-78 "Метрология. Единицы физических величин". РД 50-160-79. М., Изд-во Стандартов, 1979.

2. Методические рекомендации по применению в клинической лабораторной диагностике наименований и обозначений единиц физических величин. М., 1977.

3. Единицы СИ в медицине. Подготовлено по предложению Тридцатой Всемирной ассамблеи здравоохранения. Женева, ВОЗ, 1979.

4. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск, "Вышэйшая школа", 1973.

5. Гублер Е. В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. Л., "Медицина", 1973.

6. Делекторская Л.Н., Меньшиков В.В. Оценка надежности клинических лабораторных методов исследования. Лабор. дело, 1976, 9, 556-562.

7. Фотоэлектрический колориметр. Модель ФЭК-М. Руководство по пользованию, Загорск, 1969.

8. Крейцер А.Г. Справочник по медицинским приборам. Под ред. Е.М.Крепса. Л., "Медицина", 1962.

9. Спектрофотометр СФ-4 А. Инструкция к пользованию. Л., 1970.

10. Кац А.М., Канторович А.С. Руководство по приборам и оборудованию для медико-биологических исследований. Л., "Медицина", 1976.

11. Государственная Фармакопея Союза Советских Социалистических Республик. Десятое издание М., "Медицина", 1968.

12. Воскресенский П.И. Техника лабораторных работ. М., "Химия", 1966.

13. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические реактивы. М., Госхимиздат, 1955.

14. Кац А.М., Канторович А.С. Мерные и дозирующие устройства для клинико-диагностических лабораторий. Л., "Медицина", 1970.

1. Общеклинические исследования

1.1. Определение рН мочи

1.1.1. Определение реакции мочи с помощью индикатора бромтимолового синего

Принцип. Реакцию мочи определяют, используя раствор индикатора бромтимолового синего, имеющего зону перехода окраски от желтой через зеленую к синей в диапазоне рН 6,0 - 7,6.

Реактивы.

1. Бромтимоловый синий (3', 3''-дибромтимолсульфофталеин): 0,1 г тонко растертого в фарфоровой ступке индикатора растворяют в 20 мл теплого этилового спирта и после охлаждения до комнатной температуры доводят водой до 100 мл.

Специальное оборудование. Не требуется.

Ход определения и оценка результатов. Исследуют мочу в первые 2 - 3 часа после мочеиспускания. К 2 - 3 мл мочи добавляют 1 - 2 капли раствора индикатора. Желтый цвет соответствует кислой реакции, бурый - слабокислой, травянистый - нейтральной, буровато-зеленый - слабощелочной, зеленый и синий - щелочной.

Примечание. В Государственной Фармакопее СССР (М., 1968) приведены 2 способа приготовления раствора индикатора бромтимолового синего; способ приготовления не влияет на результаты.

1.1.2. Определение рН мочи с помощью индикаторной бумаги

Можно использовать любую индикаторную бумагу, пригодную для измерения значения рН в интервале 5,0 - 8,0. В таблице представлены пригодные для определения рН мочи индикаторные бумаги и дана их характеристика.

Таблица

Индикаторные бумаги, пригодные для определения рН мочи

N п/п	Наименование	Произ- вод- ство	Интервал значений рН	Другие показатели, определяемые реактивной бумагой
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.	Бумага лакмусовая синяя Бумага лакмусовая красная Бумага индикаторная уни- версальная Бумага "Рифан" I II III Бумага нитразиновая желтая Биофан-3 Альбуфан АГ-фан Тетрафан Пентафан	СССР СССР СССР CCCР ГДР ГДР ЧССР ЧССР ЧССР ЧССР	Не меняет цвета в щелочной среде, краснеет в кислой среде Не меняет цвета в кислой среде, синеет в щелочной среде 1,0-10,0 4,0-5,4 5,8-7,4 7,4-8,8 5,4-7,4 5,0-9,0 5,0-9,0 5,0-9,0 5,0-9,0 5,0-9,0	Белок, глюкоза Белок Белок, восстанавливающие вещества, глюкоза Белок, восстанавливающие вещества, глюкоза Белок, восстанавливающие вещества, глюкоза, кето- новые тела

Нормальные значения рН мочи: 5,0 - 7,0.

Литература

Тодоров Й. - Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София, 1968.

Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. проф. Е.А.Кост. М., 1975, 233-235.

1.2. Определение количества форменных элементов в моче

1.2.1. Определение количества форменных элементов в суточном объеме мочи по методу Каковского-Аддиса

Принцип. Определение количества форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров) в суточном объеме мочи с помощью счетной камеры.

Специальное оборудование.

1. Микроскоп.

2. Счетная камера.

Сбор мочи. Мочу собирают за 10 - 12 часов. В день сбора мочи необходимо ограничение приема жидкости для поддержания постоянных величин плотности мочи и рН, что важно для подсчета гиалиновых цилиндров, которые легко разрушаются в щелочной и малоконцентрированной моче низкой плотности.

Наиболее рационально собирать ночную порцию мочи: обследуемый мочится перед сном, отмечая время, и затем собирает мочу в течение 10 - 12 часов в один сосуд. Для предотвращения разрушения форменных элементов в сосуд добавляют 4 - 5 капель формалина или кристаллик тимола.

Ход определения. Собранную мочу тщательно размешивают и измеряют ее объем. Для исследования осадок получают из количества мочи, выделенного за 12 мин. (1/5 часа), которое рассчитывают по формуле:

                             Q = -----,                              (1),

                                 t x 5

     где: Q - объем мочи, выделенный за 12 мин. (мл),

          V - объем мочи, собранный за 10 - 12 час. (мл),

          t - время сбора мочи (час.),

          5 - коэффициент пересчета на 1/5 часа.

Рассчитанное количество мочи центрифугируют в мерной центрифужной пробирке при 3500 об/мин. в течение 3 мин. или при 2000 об/мин. в течение 5 мин. Отделяют верхний слой, оставляя 0,5 мл мочи вместе с осадком. Если осадок превышает 0,5 мл, то оставляют 1 мл мочи. Осадок с надосадочной жидкостью тщательно перемешивают и заполняют счетную камеру. Подсчитывают раздельно количество лейкоцитов, эритроцитов, цилиндров (эпителиальные клетки мочевыводящих путей не считают) и рассчитывают содержание форменных элементов в 1 мкл осадка мочи.

Расчет. Если подсчет проводят в камере Горяева, объем которой равен 0,9 мкл, то количество форменных элементов в 1 мкл определяют по формуле:

А

                            х =  ---,                                (2),

0,9

     где: х - число форменных элементов в 1 мкл,

          А - число  форменных  элементов,  подсчитанных  во  всей камере

              Горяева,

        0,9 - объем камеры Горяева в мкл.

Для камеры Фукса-Розенталя, объем которой - 3,2 мкл:

А

                            х = ---                                  (3).

3,2

Количество форменных элементов, выделенных с мочой за сутки, рассчитывают по формуле:

                  В = х x 500 x 5 x 24 = х x 60 000,                 (4),

если для исследования взято 0,5 мл (500 мкл) из 12 минутной порции мочи или:

                  В = х x 1 000 x 5 x 24 = х x 120 000,              (5),

если осадок был обильным, и был оставлен 1 мл (1 000 мкл),

где: В - число форменных элементов, выделенных за сутки,

х - число форменных элементов в 1 мкл мочи, оставленной для исследования с осадком,

500 или 1 000 - количество мочи (мкл), оставленное вместе с осадком для исследования из 12-минутной порции мочи.

Умножение на 5 и 24 дает расчет выделенного количества клеток за 24 часа.

Нормальные величины суточной экскреции форменных элементов с мочой: до 2000000 лейкоцитов, до 1000000 эритроцитов, до 20000 цилиндров.

Примечание. Для подсчета цилиндров необходимо просматривать не менее четырех камер Горяева или одну камеру Фукса-Розенталя.

1.2.2. Определение количества форменных элементов в 1 мл мочи по методу Нечипоренко

Принцип. Определение количества форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров) в 1 мл мочи с помощью счетной камеры.

Специальное оборудование. То же.

Ход определения. Берут одноразовую порцию мочи (желательно утреннюю) в середине мочеиспускания, определяют рН (в моче щелочной реакции может быть частичный распад клеточных элементов). 5 - 10 мл мочи центрифугируют при 3 500 об/мин. в течение 3 мин., отделяют верхний слой, оставляя вместе с осадком 0,5 мл (500 мкл) мочи при небольшом осадке или 1 мл (1 000 мкл) - при большом. Хорошо перемешивают осадок и заполняют счетную камеру. Подсчитывают отдельно лейкоциты, эритроциты и цилиндры во всей сетке камеры.

Расчет. Рассчитывают количество клеток в 1 мкл осадка мочи по формуле (2) или (3). Установив эту величину, рассчитывают число форменных элементов в 1 мл мочи по формуле:

                               х x 500

                           N = -------,                               (6)

если оставлено 0,5 мл (500 мкл) мочи с осадком,

                              x x 1 000

                      или N = ---------,                              (7)

если оставлен 1 мл (1 000 мкл) мочи с осадком,

     где:     N - число форменных элементов в 1 мл мочи,

              х - число  форменных  элементов  в  1 мкл мочи, оставленной

                  вместе с осадком,

500 (или 1 000) - объем мочи (мкл), оставленной вместе с осадком,

              V - количество мочи, взятое для центрифугирования.

Нормальные величины: в 1 мл мочи выделяется до 2 000 лейкоцитов и до 1 000 эритроцитов; цилиндры отсутствуют или обнаруживаются в количестве не более одного на камеру Фукса-Розенталя или на 4 камеры Горяева (до 20 в 1 мл).

Литература

Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. проф. Е.А.Кост. М., 1975, 233-235.

Нечипоренко А.З. - Определение количества лейкоцитов и эритроцитов в 1 мл мочи. Лабор. дело, 1969, 2, 121.

Каковский А.О. - К методике счисления организованных элементов мочи. Русский врач, 1910, 9, 41, 1444.

Addis T.J. - J. clin. Invest. 1925, 2, 409.

1.3. Обнаружение кетоновых тел в моче

1.3.1. Обнаружение кетоновых тел в моче с помощью реакции с нитропруссидом натрия

Метод 1 (проба Ланге)

Принцип. Нитропруссид натрия в щелочной среде реагирует с кетоновыми телами (ацетоуксусной кислотой и ацетоном) с образованием комплекса, окрашенного в красный цвет.

Реактивы.

1. Натрий нитропруссидный, 50 г/л раствора. Готовят перед употреблением.

2. Уксусная кислота, концентрированная.

3. Аммиак водный (NH4OH) (примерно 25%).

Специальное оборудование. Не требуется.

Ход обнаружения. Исследуют мочу в первые 2 - 3 часа после мочеиспускания. В пробирку к 3 - 5 мл мочи приливают 5 - 10 капель раствора нитропруссида натрия и 0,5 - 1,0 мл уксусной кислоты, смешивают, после чего осторожно наслаивают пипеткой 2 - 3 мл водного аммиака.

Оценка результатов. Проба положительна, если в течение 3 мин. на границе с аммиаком обнаруживается красно-фиолетовое кольцо.

Схема обнаружения

Компоненты	Количество	Оценка результатов
Моча 50 г/л раствор нитропруссида натрия Уксусная кислота Водный аммиак	3-5 мл 5-10 капель 0,5-1,0 мл Смешать 2-3 мл наслаивать	При положительной реакции - по- явление на границе с аммиаком красно-фиолетового кольца.

Метод II (модифицированная проба Ротеры)

Принцип. Тот же.

Реактивы.

1. Натрий нитропруссидный, 50 г/л раствора. Готовят перед употреблением.

2. Аммоний сернокислый.

3. Аммиак водный (NH4OH) (примерно 25%).

Специальное оборудование. Не требуется.

Ход обнаружения. Приблизительно 200 мг сухого сернокислого аммония, 5 капель мочи и 2 капли раствора нитропруссида натрия тщательно смешивают в пробирке, после чего осторожно наслаивают на поверхность 10 - 15 капель водного аммиака.

Оценка результатов. При наличии кетоновых тел на границе раздела в течение 3 - 5 мин. появляется красно-фиолетовое окрашивание. При слабоположительной реакции кольцо может появиться в течение 10 мин. Реакция позволяет дать ориентировочную количественную оценку.

Схема обнаружения

Компоненты	Количество	Оценка результатов
Моча Аммоний сернокислый 50 г/л раствор нитропруссидного натрия Водный аммиак	5 капель 200 мг 2 капли Смешать 10-15 капель наслаивать	При положительной реакции - по- явление красного кольца на гра- нице раздела

Ориентировочная количественная оценка

Интенсивность окраски	Обнаруживаемые вещества
	Ацетоуксусная кислота		Ацетон
	мг/100 мл	мг/л	мг/100 мл	мг/л
Следы Умеренная Интенсивная	5 30 80	50 300 800	20 250 800	200 2500 8000

1.3.2. Обнаружение кетоновых тел в моче с помощью экспресс-тестов

Принцип обнаружения кетоновых тел с помощью экспресс-тестов основан на реакции с нитропруссидом натрия.

Перечень экспресс-тестов представлен в таблице:

N п/п	Наименование	Произ- водство	Форма выпуска	Другие показатели, определяемые с помощью теста	Оценка результатов
1 2 3 4	Набор для эксп- ресс-анализа ацетона в моче Реагност-Ацетон Кетофан Пентафан	СССР ГДР ЧССР ЧССР	Таблетки Таблетки Пластиковые полоски Пластиковые полоски	рН, глюкоза, восстанавли- вающие веще- ства, белок	Без количествен- ной оценки Без количествен- ной оценки Ориентировочная количественная оценка Ориентировочная количественная оценка

Анализ проводится строго по инструкции.

Нормальные величины. В норме с мочой выделяется 20 - 50 мг кетоновых тел за 24 часа. Эти количества не обнаруживаются качественными пробами, поэтому в норме качественные пробы - отрицательны.

Примечание. Ацетоуксусная кислота в стерильной моче стабильна в течение 8 - 10 дней; в присутствии микробов или дрожжей - может полностью исчезнуть за сутки. Около 20% ацетона испаряется за сутки при комнатной температуре. Кетоновые тела могут исчезнуть при наличии инфекции мочевого тракта.

Литература

Тодоров Й. - Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София, 1968.

Henry R.J. - Clinical chemistry. Principles and technics. New York, 1964, 689-698.

Методические рекомендации по применению экспресс-тестов (сухих диагностических проб) в медицинской практике. М., 1977.

1.4. Определение уробилиноидов в моче и кале

1.4.1. Определение уробилиногена в моче и кале реакцией с пара-диметиламинобензальдегидом

Принцип. Уробилиноген с пара-диметиламинобензальдегидом образует окрашенный в красный цвет комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию уробилиногена. Для восстановления уробилина в уробилиноген используют аскорбиновую кислоту и гидрат окиси железа. Для увеличения специфичности реакции добавляют уксуснокислый натрий.

Реактивы.

1. 4-(диметиламино)-бензальдегид (пара-диметиламинобензальдегид).

2. Соляная кислота концентрированная, хч.

3. Реактив Эрлиха. 0,7 г пара-диметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной соляной кислоты, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

4. Натрий уксуснокислый, чда, хч, насыщенный раствор. 375 г СН3СOONa x 3H2O (или 226 г СН3СООNа) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при комнатной температуре. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

5. Железо сернокислое (FeSO4 x 7 H2O), чда, 200 г/л раствора. Стабилен при хранении в холодильнике в течение суток.

6. Аскорбиновая кислота.

7. Натр едкий: а) 100 г/л раствора; б) 0,5 г/л раствора.

8. Барий хлористый, 100 г/л раствора.

9. Фенолсульфофталеин (феноловый красный). Используют для приготовления калибровочного раствора.

10. Основной калибровочный раствор. 20,0 мг фенолсульфофталеина растворяют в 100 мл 0,5 г/л раствора едкого натра. Стабилен при хранении.

Рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного раствора 0,5 г/л раствором едкого натра в 100 раз. Стабилен при хранении при комнатной температуре в течение недели. Рабочий раствор содержит 0,2 мг фенолсульфофталеина в 100 мл и эквивалентен по окраске 0,346 мг/100 мл раствору уробилиногена. Точность приготовления можно проверить измерением оптической плотности раствора на спектрофотометре: при длине волны 562 нм оптическая плотность должна быть 0,38 - 0,39.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.

Ход определения уробилиногена в моче.

Подготовка образца. Исследуют мочу в первые 2 - 3 часа после мочеиспускания. При наличии мутности мочу центрифугируют. Затем проводят обнаружение билирубина одной из качественных проб. При наличии билирубина смешивают 8 мл мочи с 2 мл 100 г/л раствора хлористого бария и фильтруют через бумажный фильтр. Конечный результат умножают на 1,25, чтобы внести поправку на это разведение.

Ход определения. 100 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 10 мл исследуемой мочи и помещают по 1,5 мл в две пробирки (опытная и холостая пробы).

В пробирку с холостой пробой прибавляют 4,5 мл свежеприготовленной смеси одного объема реактива Эрлиха и двух объемов насыщенного раствора уксуснокислого натрия.

В пробирку с опытной пробой прибавляют 1,5 мл реактива Эрлиха и немедленно приливают 3,0 мл насыщенного раствора уксусно-кислого натрия.

Через 5 мин. измеряют экстинкцию обеих проб против воды на ФЭКе при длине волны 500 - 590 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см или на спектрофотометре при длине волны 562 нм. Рабочий калибровочный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Результаты выражают в единицах Эрлиха (1 ед. соответствует 1 мг уробилиногена). Концентрацию уробилиногена выражают количеством единиц Эрлиха в 100 мл мочи.

Расчет проводят по формуле:

     Ед. Эрлиха         Ео - Ех            6,0     Ео - Ех

     на 100 мл мочи  =  -------  x 0,346 x ---   = -------  x 1,38,

                          Ек               1,5        Ек

     где: Ео - экстинкция опытной пробы,

          Ех - экстинкция холостой пробы,

          Ек - экстинкция калибровочной пробы,

       0,346 - концентрация уробилиногена в  растворе (0,346 мг/100  мл),

               окраска  которого   эквивалентна  окраске   калибровочного

               раствора фенолсульфофталеина,

         6,0 - объем пробы (мл),

         1,5 - количество мочи в пробе (мл).

Схема определения уробилиногена в моче

NN п/п	Компоненты	Количество (мл)
NN п/п	Компоненты	Опытная проба	Холос- тая проба	Калибро- ровочная проба
1. 2. 3. 4. 5.	10 мл мочи + 100 мг аскорбиновой кис- лоты Реактив Эрлиха Насыщенный раствор уксуснокислого нат- рия Смесь реактивов 2 и 3 (1:2) Рабочий калибровочный раствор	1,5 1,5 3,0 - -	1,5 - - 4,5 -	- - - - 6,0

Измерение экстинкции на ФЭКе (длина волны - 500 - 590 нм, кювета - 1 см).

Нормальные величины. В моче здорового человека содержатся следы уробилиногена - за сутки у взрослых выделяется с мочой 0 - 6 мг уробилиногена, у детей - 0 - 2 мг.

Примечания:

1. Моча не должна стоять при дневном свете, так как это ускоряет окисление уробилиногена в уробилин. Рекомендуется собирать мочу в посуду из темного стекла.

2. Чтобы получить величину выделения уробилиногена за определенный промежуток времени (например, за 2 часа), анализ проводят в образце мочи, собранной точно за это время, и рассчитывают выделенное количество уробилиногена, учитывая объем мочи, по формуле:

                  Ео - Ех             V

                  -------  x 1,38 x  ---, где:

                    Ек               100

     V   - объем мочи (мл), выделенной за определенный промежуток  времени;

    ---  - коэффициент для расчета количества уробилиногена в 1 мл.

Ход определения уробилиногена в кале.

Подготовка образца. Исследуют кал в первые 2 часа после дефекации. Переносят 10 г кала в ступку. Отмеривают в цилиндре 190 мл воды. Из отмеренного количества воды наливают около 20 мл в ступку, растирают кал с водой, добавляют еще 80 - 90 мл воды и растирают снова, оставляют стоять до оседания. В коническую колбу, объемом 500 мл, наливают 100 мл 200 г/л раствора сернокислого железа и надосадочную жидкость из ступки. К оставшемуся в ступке калу добавляют еще воды из цилиндра, растирают, оставляют стоять, переносят надосадочную жидкость в колбу. Повторяют процедуру, используя оставшееся от 190 мл количество воды. В колбу добавляют 100 мл 100 г/л раствора едкого натра, встряхивают и ставят колбу в темное место при комнатной температуре на 1 - 3 часа.

Хорошо смешивают содержимое колбы и фильтруют. Разводят 5 мл фильтрата водой до 50 мл. В 10 мл разведенного фильтрата растворяют 100 мг аскорбиновой кислоты и помещают по 1,5 мл в 2 пробирки (опытная и холостая пробы). Дальнейший ход определения и схему определения см. "ход определения уробилиногена в моче".

Расчет проводят по той же формуле, что и при определении в моче, и полученный результат (концентрация уробилиногена в 100 мл) умножают на 400 для пересчета на 100 г кала (для экстракции уробилиногена из 10 г кала используют объем жидкости - 390 мл и затем разводят фильтрат еще в 10 раз; таким образом, в 100 мл фильтрата, используемого для анализа, содержится уробилиноген из 0,25 г кала).

     Ед. Эрлиха         Ео - Ех                Ео - Ех

     на 100 г  кала  =  ------- x 1,38 x 400 = ------- x 552, где:

                          Ек                     Ек

400 - коэффициент пересчета количества уробилиногена на 100 г кала. Остальные обозначения - см. определение уробилиногена в моче.

Нормальные величины. В норме с калом выделяется 75 - 350 мг уробилиногена на 100 г кала.

1.4.2. Обнаружение уробилина в моче реакцией с соляной кислотой
(проба Флоранса)

Принцип. Уробилин с соляной кислотой образует соединения красного цвета.

Реактивы.

1. Кислота серная, концентрированная.

2. Диэтиловый эфир.

3. Кислота соляная, концентрированная.

Специальное оборудование.

Не требуется.

Ход обнаружения. 8 - 10 мл мочи в пробирке подкисляют 8 - 10 каплями концентрированной серной кислоты, перемешивают, приливают 2 - 3 мл эфира и осторожно перемешивают. В другую пробирку наливают 2 - 3 мл концентрированной соляной кислоты. Эфирный слой отбирают и осторожно наслаивают на соляную кислоту.

Оценка результатов. При наличии уробилина на границе жидкостей образуется кольцо красного цвета.

1.4.3. Обнаружение уробилина в моче реакцией с сернокислой медью
(проба Богомолова)

Принцип. Уробилин с сернокислой медью образует соединение розово-красного цвета.

Реактивы.

1. Медь сернокислая, чда, насыщенный раствор. 23 г CuSO4 x 5H2O растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

2. Хлороформ.

Специальное оборудование.

Не требуется.

Ход обнаружения. К 10 - 15 мл мочи приливают 2 - 3 мл насыщенного раствора сернокислой меди. Если образуется помутнение, то прибавляют несколько капель концентрированной соляной кислоты до прояснения раствора. Через 5 мин. приливают 2 - 3 мл хлороформа и перемешивают.

Оценка результатов. При наличии уробилина слой хлороформа окрашивается в розово-красный цвет.

1.4.4. Обнаружение уробилина (стеркобилина) в кале реакцией с двухлористой ртутью

Принцип. Стеркобилин с двухлористой ртутью образует розово-красное окрашивание.

Реактивы.

1. Ртуть двухлористая (НgCl2), (ртуть хлорная, сулема), 70 г/л раствора. Растворяют при кипячении, после охлаждения фильтруют.

Специальное оборудование.

Не требуется.

Ход обнаружения. Комочек кала, размером с горошину, растирают в фарфоровой чашечке или в пробирке с 2 - 3 мл 70 г/л раствора двухлористой ртути, закрывают крышкой или пробкой и оставляют при комнатной температуре в вытяжном шкафу на сутки. Холостую пробу ставят как опытную, но вместо двухлористой ртути берут воду.

Оценка результатов. В присутствии стеркобилина в опытной пробе появляется розовое окрашивание.

Оценку результатов можно провести немедленно, если подогреть пробирки с опытной и холостой пробкой на пламени горелки.

При наличии билирубина образуется зеленое окрашивание.

В норме - реакция положительна.

Литература

Й. Тодоров - Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София, 1968.

Henry R.J., Сannon D.C., Winkelman J.W. Clinical chemistry. Principles and technics. New York, 1974, 1354-1369.

1.5. Обнаружение порфобилиногена в моче реакцией с пара-диметиламинобензальдегидом

Принцип. Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с пара-диметиламино бензальдегидом с образованием окрашенного в красный цвет соединения. Для повышения специфичности реакции добавляют ацетат натрия. Соединения, дающие аналогичную реакцию с пара-диметиламинобензальдегидом (уробилиноген, производные индола, скатола и др.), удаляют путем экстракции хлороформом и бутанолом. ПБГ не растворяется ни в хлороформе, ни в бутаноле.

Реактивы.

1. 4-(диметиламино)-бензальдегид (пара-диметиламинобензальдегид).

2. Соляная кислота концентрированная, хч.

4. Натрий уксуснокислый, хч или чда - насыщенный раствор. 375 г СН3СООNa x 3H2O (или 226 г CH3COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при комнатной температуре. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

5. Хлороформ.

6. Бутиловый спирт.

7. Бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0 - 5,0).

Специальное оборудование - не требуется.

Ход обнаружения и оценка результатов. Исследуют мочу в первые 2 - 3 часа после мочеиспускания. Смешивают в пробирке 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора уксусно-кислого натрия и перемешивают. Измеряют рН индикаторной бумагой; рН должно быть в интервале 4,0 - 5,0; если рН меньше 4,0, добавляют раствор ацетата натрия для установления нужного рН.

Если окраски не образуется - результат отрицательный.

При образовании розовой или красной окраски добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний водный слой становится бесцветным или желтым, результат - отрицательный.

При сохранении окрашивания водной фазы переносят 6 - 8 мл водного слоя в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 2:1 и встряхивают. Обычно фазы разделяются быстро; в противном случае смесь центрифугируют. При переходе окраски в бутиловый слой - результат отрицательный. Если водная часть остается окрашенной, результат - положительный для ПБГ.

Схема обнаружения ПБГ и оценки результатов

Компоненты	Количество (мл)	Оценка результатов
		Наличие розовой или красной окраски	Обнаруживаемые соединения
Моча Реактив Эрлиха Насыщенный раствор уксуснокислого натрия	2,5 2,5 5,0	- +	ПБГ не обнаруживается ПБГ, уробилиноген, индол, индол-3-уксусная кислота, скатол, меланоген, опсо- пирролдикарбоксильная кис- лота (ОПДК) и др.
Хлороформ	5,0	Водный слой - +	ПБГ не обнаруживается ПБГ, меланоген, ОПДК и др.
		Слой хлоро- + форма	Уробилиноген, индол, ин- дол-3-уксусная кислота, скатол и др.
Бутиловый спирт	3,0 - 4,0	Водный слой - +	ПБГ не обнаруживается ПБГ
		Слой бутило- + вого спирта	Меланоген, ОПДК и др.

В норме (0 - 2 мг/л) ПБГ в моче не обнаруживается. Данным методом ПБГ обнаруживается при концентрации, превышающей 6 мг/л.

Примечание. При хранении мочи свыше 3-х часов при комнатной температуре положительная реакция может стать отрицательной, что, по-видимому, связано с превращением ПБГ в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2 - 3 часа, ее хранят в холодильнике при 4°С или в замороженном состоянии. При хранении в холодильнике и доведении рН мочи до 6,0 - 7,0 ПБГ стабилен длительное время.

Литература

Henry R., Сannon D.C., Winkelman J. Clinical chemistry. Principles and technics. New York, 1974, 1251-1263.

2. Гематологические исследования

2.1. Морфологическое исследование форменных элементов крови с дифференциальным подсчетом лейкоцитарной формулы

Принцип. Микроскопическое исследование сухих фиксированных и окрашенных мазков крови с описанием морфологии эритроцитов и дифференциальным подсчетом лейкоцитов с расчетом их процентного соотношения.

Этапы метода.

I. Подготовка стекол. Предметные стекла должны быть чистыми и обезжиренными. Для этого стекла (бывшие в употреблении и новые) замачивают в 2% растворе хозяйственного мыла или стирального порошка ("Новость", "Триас-а", "Прогресс", "Астра" - 20,0 г порошка растворяют в 975 мл воды и добавляют 20 мл пергидроля) в эмалированной посуде на 8 - 10 часов, старый мазок удаляют ватным тампоном и кипятят стекла в этом же растворе 5 - 10 минут. Кипячение более 10 мин. и кипячение в алюминиевой посуде приводит к помутнению стекол. Затем стекла промывают в проточной воде, насухо вытирают и выборочно проверяют полноту отмывки от щелочных добавок моющих средств с помощью 1 г/л спиртового раствора фенолфталеина путем нанесения 2 - 3 капель на стекло (розовое окрашивание не должно появляться). Отмытые стекла помещают на 30 - 60 мин. в смесь Никифорова (этиловый спирт 96° и диэтиловый эфир в соотношении 1:1), после чего их хранят в чистой посуде с крышкой.

II. Фиксация мазков.

Реактивы: метиловый спирт, хч, или эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду (раствор). При отсутствии вышеуказанных фиксаторов используют этиловый спирт 96°, выдерживая в нем мазки не менее 35 мин.

Оборудование: пинцет, штатив для сушки мазков, широкогорлая банка с притертой пробкой.

Фиксация. Высохшие на воздухе мазки опускают в широкогорлую банку с фиксатором на 5 - 10 мин., затем извлекают их пинцетом и высушивают на воздухе. Для фиксации отбирают правильно приготовленные тонкие мазки крови: мазок должен иметь желтоватый цвет, располагаться на расстоянии 1 - 3 мм от края широких сторон стекла и заканчиваться "метелочкой", не доходя 1,5 - 2 см до края.

III. Окраска мазков. Для окраски используется смесь двух красителей - кислого (эозин калия) и основного (метиленовый синий и его производные - азур I и азур II).

Азур-эозиновые смеси обладают высокой чувствительностью к рН воды. Вода для приготовления красителей и смывания краски должна иметь нейтральную реакцию. При кислой реакции клетки долго не прокрашиваются и имеют красный оттенок, при щелочной - эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра и цитоплазма - в очень темные цвета.

а) Окраска по Нохту.

Реактивы: 1. Основные растворы красителей - азур II, 1 г/л водного раствора; 1,0 г растворяют в 1.000 мл дистиллированной воды; эозин К, 1 г/л водного раствора: 1,0 г растворяют в 1.000 мл дистиллированной воды. Растворы готовы к употреблению через 14 дней при хранении в посуде темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре.

2. Фосфатный буфер (смесь Вейзе), рН 7,4 - 7,5.

Калий фосфорнокислый однозамещенный безводный (КН2РО4) - 0,49 г.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4 x 2H2O) - 1,14 г или безводный - 0,909 г.

Дистиллированная вода - 1 000 мл.

3. Рабочий раствор: готовят перед употреблением путем смешивания 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина К и 55 мл буферного раствора. Пропорции красителей могут несколько варьировать и должны быть установлены опытным путем при приготовлении свежей партии основных растворов красителей.

Окраска. Фиксированные сухие мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с рабочим раствором красителя и выдерживают в нем строго определенное время, подобранное для каждой партии краски - от 20 до 45 мин. Затем контейнер переносят в кювету с водопроводной водой, после чего мазки ставят вертикально в штатив для сушки. При отсутствии штатива-контейнера высушенные мазки красят на "рельсах", заливая мазок рабочим раствором красителя возможно более высоким слоем (3 - 4 мл на мазок).

б) Окраска по Паппенгейму.

Реактивы: 1. Эозин метиленовый синий по Май-Грюнвальду (раствор). При отсутствии готового раствора готовят 5 г/л раствора сухого красителя в метиловом спирте (хч). Раствор готов к употреблению через 4 дня.

2. Рабочий раствор азур-эозина по Нохту.

Окраска. Сухие нефиксированные мазки помещают в контейнер и опускают в кювету с раствором красителя-фиксатора Май-Грюнвальда на 5 мин., после чего контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой и помещают в кювету с рабочим раствором азур-эозина (по Нохту) на 8 - 15 мин. Затем смывают краску, перенося контейнер в кювету с водопроводной водой. Мазки высушивают на воздухе.

IV. Микроскопическое исследование.

Реактивы. Иммерсионное масло.

Диэтиловый эфир или этиловый спирт.

Оборудование. Микроскоп.

11-клавишный счетчик для подсчета лейкоцитарной формулы.

Просматривают мазок крови под малым увеличением (объектив - 10х, окуляр - 7х). Подсчет лейкоцитов и оценка морфологии эритроцитов допустимы только в тонкой части мазка, где эритроциты лежат одиночно, а не сложены в "монетные столбики".

На край мазка помещают каплю иммерсионного масла, переводят на иммерсионный объектив (удобнее пользоваться при монокулярной насадке окуляром 7х, при бинокулярной насадке - окуляром 5х). Подсчет лейкоцитов ведут, отступя 2 - 3 поля зрения от края мазка, по зигзагу (по линии "Меандра"); 3 - 5 полей зрения вдоль края мазка, затем 3 - 5 полей зрения под прямым углом к середине мазка, потом 3 - 5 полей зрения параллельно краю мазка и вновь под углом 90° возвратиться к краю мазка. Такое движение продолжают до тех пор, пока не будет сосчитана половина клеток. Затем переходят на противоположную сторону мазка и считают вторую половину клеток.

Оценка результатов. Подсчитывают только целые, неразрушенные клетки. В нормальной крови выявляются следующие формы лейкоцитов: базофилы, эозинофилы, палочкоядерные нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы, моноциты, лимфоциты. При наличии в мазке крови плазматических клеток, незрелых, бластных и трудно дифференцируемых форм лейкоцитов они должны быть введены в лейкоцитарную формулу, а для последних дано описание их морфологии.

Одновременно с подсчетом лейкоцитарной формулы проводят оценку морфологии эритроцитов, обращая внимание на размер эритроцитов (нормоциты, микроциты, макроциты, мегалоциты), на наличие и степень выраженности анизоцитоза и пойкилоцитоза, на особенности формы эритроцитов (овалоцитоз, микросфероцитоз, серповидность), на интенсивность окраски (нормохромные, гипохромные, гиперхромные, полихроматофильные), мишеневидные эритроциты и на наличие включений в эритроцитах (тельца Жолли, кольца Кэбота, базофильная пунктация, ядерные формы).

Если в анализе крови не было выявлено отклонений от нормы в количественном составе форменных элементов крови, а при подсчете первых 100 лейкоцитов не обнаружено никаких отклонений от нормы ни в составе лейкоцитарной формулы, ни в морфологии эритроцитов, то ограничиваются подсчетом этого количества клеток. Если при этом были выявлены какие-либо отклонения от нормы, необходим подсчет не менее 200 лейкоцитов.

Лейкоцитарная формула дает представление только об относительных величинах. Более точное представление о составе лейкоцитов крови дает вычисление их абсолютных количеств, то есть содержания каждого вида лейкоцитов в объеме крови.

Нормальные величины.

Содержание различных видов лейкоцитов крови у здоровых взрослых людей
(х +- 1,5S)
(утв. МЗ СССР для бланка анализа крови)

Формы лейкоцитов	%%	Количество клеток в 1 л
Базофилы Эозинофилы Палочкоядерные нейтрофилы Сегментоядерные нейтрофилы Моноциты Лимфоциты	0-1 0,5-5 1-6 47-72 3-11 19-37	0-0,065 x 10(в степени 9) 0,020 x 10(в степени 9) - 0,300 x 10(в степени 9) 0,040 x 10(в степени 9) - 0,300 x 10(в степени 9) 2,000 x 10(в степени 9) - 5,500 x 10(в степени 9) 0,090 x 10(в степени 9) - 0,600 x 10(в степени 9) 1,200 x 10(в степени 9) - 3,000 x 10(в степени 9)

Литература

Кассирский И.А., Алексеев Г.А. Клиническая гематология. М., 1970.

Предтеченский В.Е. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям. М., 1960.

Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е.А.Кост. М., 1975.

2.2. Определение гематокрита

2.2.1. Определение гематокрита с помощью микроцентрифуги МЦГ-8

Принцип. Центрифужный метод.

Реактивы.

Антикоагулянты: гепарин - 5000 mE/мл разводят дистиллированной водой в соотношении 1:5 или

этилендиамин-тетрауксусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА Na2, трилон Б), 40 г/л.

Оборудование.

Микроцентрифуга МЦГ-8.

Капиллярные трубки даются в комплекте с центрифугой. Могут быть использованы капилляры для определения С-реактивного белка.

Ход определения. Для предотвращения свертывания крови капилляры обрабатывают антикоагулянтом и высушивают. Заполняют капилляры на 7/8 длины кровью из пальца или венозной. Закупоривают капилляры с одного конца специальной пастой (можно использовать пластилин) и помещают в ротор центрифуги так, чтобы закупоренные концы упирались в резиновую прокладку; центрифугируют 5 мин. при 8000 об/мин. Определяют гематокритную величину по отсчетной шкале, прилагаемой к центрифуге.

2.2.2. Определение гематокрита микрометодом в модификации Й.Тодорова

Принцип. Центрифужный метод.

Реактивы. Те же.

Оборудование. Центрифуга, пипетки Панченкова.

Ход определения. В обработанную антикоагулянтом пипетку Панченкова с отрезанным верхним концом набирают кровь точно до верхней метки, закупоривают пипетку, обтягивая ее резиновым кольцом, центрифугируют 30 - 45 мин. при 3 000 об/мин. Для каждой центрифуги устанавливают оптимальное время центрифугирования. Вычитают из 100 высоту столбика эритроцитов и получают гематокритную величину в процентах.

Нормальные величины для венозной и капиллярной крови:

     у женщин    - 36-42%                (0,36-0,42)

     у мужчин    - 40-48%                (0,40-0,48).

3. Биохимические исследования

3.1. Определение альбумина в сыворотке крови по реакции с бромкрезоловым зеленым (БКЗ)

Принцип. При взаимодействии альбумина с БКЗ в слабокислой среде в присутствии детергента образуется окрашенный комплекс синего цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию альбумина.

Реактивы.

1. Уксусная кислота, 1 моль/л. В мерную колбу, емкостью 1 л, помещают 60 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем дистиллированной водой до метки.

2. Едкий натр, чда, хч, 1 моль/л.

3. Ацетатный буфер, 0,05 моль/л, рН 4,2, с добавлением детергента. 0,85 г полигидроксиэтиленлаурилового эфира (Brij-35) растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл 1 моль/л раствора уксусной кислоты, 13,2 мл 1 моль/л раствора едкого натра и доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Перемешивают, проверяют рН. Реактив стабилен при хранении в холодильнике.

4. Бромкрезоловый зеленый (БКЗ) водорастворимый, индикатор, чда, 1,2 ммоль/л. 0,4292 г БКЗ растворяют в 200 - 300 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 500 мл и доводят объем до метки. Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

5. Рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере. В мерную колбу емкостью 1 л помещают 85 мл 1,2 ммоль/л раствора БКЗ, доводят объем до метки ацетатным буфером с детергентом. Стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла.

6. Основной калибровочный раствор альбумина, 10 г/100 мл. Может быть использован ампулированный 10% раствор альбумина плацентарного.

Специальное оборудование.

Фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.

Ход определения. Опытная проба. 10 мкл сыворотки крови (или 0,1 мл сыворотки, разведенной в 10 раз 9 г/л раствором NaCl) тщательно перемешивают, избегая образования пены, с 4 мл рабочего раствора БКЗ в ацетатном буфере. Через 5 - 10 мин. измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 590 - 700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы на реактивы или на спектрофотометре при длине волны 625 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течение 8 часов. Холостую пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,1 мл дистиллированной воды.

Расчет ведут по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой. Готовят ряд разведений основного калибровочного раствора, как указано в таблице:

NN п/п	Основной калибровочный раствор альбумина (мл)	Дистиллированная вода (мл)	Содержание альбумина
			г/100 мл	единицы СИ г/л*
1. 2. 3. 4. 5. 6.	1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5	4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5	2 3 4 5 6 7	20 30 40 50 60 70

------------------------------

* Коэффициент пересчета г/100 мл в г/л = 10.

Калибровочные растворы обрабатывают как опытные, но вместо сыворотки добавляют 10 мкл (или 0,1 мл разведенного в 10 раз) калибровочного раствора.

Схема определения

Компоненты	Пробы (мл)
Компоненты	опытная	холостая
Сыворотка, разведенная 9 г/л раст- вором NaCl в 10 раз Дистиллированная вода Рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере	0,1 - 4,0	- 0,1 4,0

Перемешивают.

Через 5 - 10 минут измеряют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 590 - 700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы.

Нормальные величины: 35 - 50 г/л (3,5 - 5,0 г/100 мл).

Оценка аналитической надежности метода (г/л).

Воспроизводимость

     в серии:            y = 22,0                V = 3,5%

     n = 20              y1 = 40,0               V = 2,1%

     изо дня в день:     y = 24,0                V = 5,0%

     n = 20              y1 = 42,0               V = 4,3%

Правильность:*

1. Сравнение с методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы (окраска Ponceau S):

     n = 28            1) x = 46,0                S = 24,0

                       2) y = 45,0                S = 15,0

              Различия по t-тесту - не достоверны, p > 0,05.

                      Коэффициент корреляции - 0,91.

                  Уравнение регрессии: y = 0,87 + 0,73х.

2. Сравнение с автоматизированным методом, основанным на том же принципе (автоанализатор Техникон SMA 12/60):

     n = 40              x = 45,0                S = 21,0

                         y = 45,0                S = 25,0

              Различия по t тесту - не достоверны, р > 0,05.

                      Коэффициент корреляции - 0,93.

                 Уравнение регрессии: y = 0,33 + 0,93 x.

Калибровочная кривая линейна до концентрации альбумина 60 г/л.

Примечания.

1. Сыворотка должна быть свободной от гемолиза.

2. Билирубин не влияет на определение до концентрации 20 мг/100 мл.

3. Для построения калибровочной кривой можно пользоваться альбумином из набора отечественного производства для определения общего белка в сыворотке крови.

Литература

Shirardin V., Ney I. - Z. klin. Chem. klin. Biochem., 1972, 10, 338-344.

------------------------------

* - В оценке аналитической надежности для всех методов:

1) х - средняя арифметическая метода сравнения.

2) y - средняя арифметическая унифицированного метода.

3.2. Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы

Принцип. Белки сыворотки крови разделяют методом электрофореза с использованием в качестве носителя пленок из ацетата целлюлозы.

Реактивы.

1. 5,5-Диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

2. Лимонная кислота, чда, хч.

3. Барбитал-цитратный (мединал-цитратный) буфер, рН 8,6. 7,36 г 5,5-диэтилбарбитурата натрия (мединала), 0,3 г лимонной кислоты растворяют в 700 мл дистиллированной воды в мерной колбе емкостью 1 л, проверяют рН и доводят дистиллированной водой до метки.

4. Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор, чда.

5. Ртуть двухлористая (сулема, хлорная ртуть), чда.

6. Уксусная кислота, ледяная, хч.

7. Пунцовый С (Ponceau S).

8. Кислотный красный 2Ж (отечественного производства).

9. Трихлоуксусная кислота, ч, 50 г/л раствора.

10. Растворы для окрашивания:

а) Раствор бромфенолового синего, 0,5 г/л.

10,0 г двухлористой ртути, 20 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании на водяной бане, непрерывно помешивая до полного растворения сулемы. Отдельно растворяют 0,5 г бромфенолового синего в дистиллированной воде. Оба раствора смешивают, помещают в мерную колбу на 1 л и доводят дистиллированной водой до метки.

б) Раствор пунцового С.

0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты.

в) Раствор кислотного красного 2Ж.

0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты.

11. Отмывающий раствор - уксусная кислота 50 г/л раствора.

12. Просветляющий раствор.

а) Вазелиновое масло.

б) Смесь: ледяная уксусная кислота/ацетон (1:1).

Специальное оборудование.

Прибор для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.

Пленка из ацетата целлюлозы. Могут быть использованы пленки производства ВНИИСС, г.Владимир.

Денситометр.

Ход определения.

Подготовка прибора. Прежде чем приступить к работе, необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора. В соответствии с инструкцией заполняют камеры прибора буферным раствором. Следят, чтобы уровень буфера был одинаковым в обеих камерах.

Подготовка пленок из ацетата целлюлозы.

Смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 мин). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны провисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150 вольт в течение 5 мин., после чего выключают ток.

Нанесение сыворотки.

На катодный край пленки наносят 1 - 4 мкл сыворотки в виде узкой полоски так, чтобы полоска не доходила до края пленки.

Проведение электрофореза.

Включают ток и проводят элекрофоретическое разделение в течение 20 мин. при напряжении 150 вольт и силе тока 1 мА на 1 см полоски.

Обработка пленок из ацетата целлюлозы.

Выключают ток, вынимают пленки, высушивают их - вначале на воздухе в течение 5 - 10 мин., затем, для фиксации, в сушильном шкафу при 100°С в течение 10 мин. Окрашивают в течение 15 минут одним из указанных красителей, после чего пленки несколько раз отмывают от избытка красителя 50 г/л раствором уксусной кислоты до исчезновения фона (3 - 4 раза). После отмывки пленки промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе. Затем пленки просветляют в одном из просветляющих растворов.

Расчет. Измерение проводят на денситометре. Результаты выражают в процентах.

Нормальные величины. Нормальные величины зависят от вида красителя.

Белковые фракции в %	Окраска
Белковые фракции в %	пунцовый С (%)	бромфеноловый синий (%)
Альбумин Глобулины: aльфа1 aльфа2 бета гамма	52 (46,9-61,4) 3,3 (2,2-4,2) 9,4 (7,9-10,9) 14,3 (10,2-18,3) 21,1 (17,6-25,4)	58 (53,9-62,1) 3,9 (2,7-5,1) 8,8 (7,4-10,2) 13,0 (11,7-15,3) 18,5 (15,6-21,4)

Оценка аналитической надежности метода.

Воспроизводимость по каждой из фракций:

                       в серии:             V = 1,3 - 5%

     n = 20            изо дня в день:      V = 2,9 - 7,7%

Оценка правильности при определении белковых фракций по контрольной сыворотке "Versatol" фирмы Godecke (ФРГ) (n = 20).

Белковые фракции в %	Значения контрольной сыворотки "Versatol"	Значения, полученные при окраске пунцовыми С
Альбумин Глобулины: aльфа1 aльфа2 бета гамма	58,3 41,7 3,4 9,8 10,4 18,1	59,4 40,6 2,6 9,1 11,7 17,2

Сравнение результатов, полученных при окраске электрофореграмм пунцовым С и кислотным красным 2Ж:

Белковые фракции в %	Пунцовый С	Кислотный красный 2ж
Альбумин Глобулины: aльфа1 aльфа2 бета гамма	60,7 39,3 2,6 8,7 13,4 14,6	61,0 39,0 2,6 8,7 13,3 14,4

Примечания:

1. Можно использовать барбиталовый (мединал-вероналовый) буфер такого же состава, как и для электрофореза на бумаге.

2. После проведения электрофореза буфер из катодной и анодной камер смешивают, что позволяет использовать его несколько раз.

3. Для количественной оценки результатов можно использовать денситометр БИАН. При этом наносят большее количество сыворотки и изменяют режим работы с тем, чтобы получить большую длину разгонки.

Литература

Kohn J. In: Laboratory medicine V. 1. Hagerstown e.a., 1975. Сhap. 12 B.

3.3. Определение мочевой кислоты в сыворотке крови по реакции с фосфорновольфрамовым реактивом

Принцип. Мочевая кислота восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив с образованием комплекса голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевой кислоты.

Реактивы.

1. Серная кислота, чда, 0,35 моль/л. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты и доводят объем до 500 мл.

2. Натрий вольфрамовокислый, двухводный (Na2WO4 x 2H2O), чда, 100 г/л. Растворяют 50,0 г вольфрамовокислого натрия в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят водой до 500 мл.

3. Натрий углекислый (Na2CO3), чда, 103 г/л. Растворяют 51,5 г углекислого натрия в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят водой до 500 мл.

4. Ортофосфорная кислота, 85%, чда.

5. Литий сернокислый, (Li2SO4 x H2O), чда.

6. Литий углекислый (Li2CO3), чда.

7. Фосфорновольфрамовый реактив. В круглодонную колбу вместимостью 1,5 л вносят 40,0 г вольфрамовокислого натрия и 300 мл дистиллированной воды. Добавляют 32 мл 85% ортофосфорной кислоты и несколько стеклянных бусинок. Осторожно кипятят в течение 2-х часов на песочной или глицериновой бане с обратным холодильником. Охлаждают до комнатной температуры и доливают дистиллированной водой так, чтобы общий объем был 1 л. Добавляют 32,0 г сернокислого лития. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.

8. Мочевая кислота, имп.

9. Формалин, не менее 36,5 - 37,5%, фарм.

10. Основной калибровочный раствор мочевой кислоты, 1 г/л. Растворяют 0,6 г углекислого лития в 150 мл дистиллированной воды, фильтруют и нагревают до 60°С. Взвешивают 1,000 г мочевой кислоты, вносят в предварительно нагретую мерную колбу на 1 л, вливают теплый раствор углекислого лития и быстро встряхивают. После растворения мочевой кислоты колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 20 мл раствора формалина, наливают 300 - 350 мл дистиллированной воды. Добавляют несколько капель раствора метилового оранжевого, затем, встряхивая, медленно добавляют 20 - 22 мл 0,35 моль/л серной кислоты до изменения цвета в розовый. Доливают колбу до метки дистиллированной водой. Раствор стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла. 1 мл раствора содержит 1 мг мочевой кислоты.

11. Рабочий калибровочный раствор мочевой кислоты. 1 мл основного калибровочного раствора доводят до 200 мл дистиллированной водой. 1 мл содержит 0,005 мг мочевой кислоты. Стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.

Специальное оборудование.

1. Баня песочная или глицериновая.

2. Обратный холодильник.

3. Фотоэлектроколориметр.

Ход определения. Опытная проба. К 8 мл дистиллированной воды добавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл 0,35 моль/л серной кислоты и перемешивают. Затем добавляют 0,5 мл раствора вольфрамовокислого натрия и тщательно перемешивают. Через 5 - 10 минут фильтруют. К 3 мл фильтрата добавляют 1,5 мл раствора углекислого натрия, перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфорновольфрамового реактива, перемешивают, переворачивая пробирку. Через 30 минут измеряют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 590 - 700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба. Ставят как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл дистиллированной воды.

Калибровочная проба. Ставят и измеряют как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл рабочего калибровочного раствора.

Расчет проводят по формуле:

     Концентрация      Еоп x Ск x 10        Еоп x 5 x 0,059

     мочевой кислоты = -------------  x К = ----------------, где

     (ммоль/л)               Ек                   Ек

Еоп - экстинкция опытной пробы,

Ек - экстинкция калибровочной пробы,

Ск - концентрация рабочего калибровочного раствора в мг в 1 мл (0,5).

10 - пересчет на сыворотку (в опытную пробу берут 0,3 мл сыворотки, т.е. в 10 раз меньше, чем в калибровочную пробу).

К - коэффициент пересчета в единицы СИ мг/100 мл в ммоль/л равен 10/168,1 = 0,059 (10 - пересчет на 1 л сыворотки, 168,1 - относительная молекулярная масса мочевой кислоты).

Схема определения

Компоненты	Пробы (мл)
Компоненты	опытная	холостая	калибровочная
Дистиллированная вода Сыворотка Серная кислота Раствор вольфрамовокислого натрия	8,0 1,0 0,5 0,5	- - - -	- - - -
Перемешивают, через 5-10 минут фильтруют через бумажный фильтр в химическую пробирку
Фильтрат Дистиллированная вода Рабочий калибровочный раствор Раствор углекислого натрия	3,0 - - 1,5	- 3,0 - 1,5	- - 3,0 1,5
Перемешивают
Фосфорновольфрамовый реактив	1,0	1,0	1,0
Перемешивают, переворачивая пробирку Через 30 минут измеряют в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 590-700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы

     Нормальные величины. Концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови:

     мужчин: 0,24 - 0,50 ммоль/л (4,0 - 8,5 мг/100 мл),

     женщин: 0,16 - 0,44 ммоль/л (2,8 - 7,5 мг/100 мл).

     Оценка аналитической надежности метода (ммоль/л).

     Воспроизводимость: в серии: y = 0,28  V = 3,7%

     n = 20  изо дня в день:     y = 0,27  V = 4,6%

     Правильность:                     _

     1) Сравнение с уриказным методом (х)

     n = 10   x = 0,28             S = 0,10

              y = 0,34             S = 0,11

Различия по Т-тесту не достоверны (р > 0,05). Коэффициент корреляции: r = 0,76; уравнение регрессии: y = 0,055 +- 1,0x.

2) Сравнение с цианидно-фосфовольфрамовым методом (х1)

     n = 23      x1 = 0,37         S = 0,14

                 y = 0,35          S = 0,12

Различия по t-тесту не достоверны (р > 0,05). Коэффициент корреляции: r = 0,93, уравнение регрессии: y = 0,063 + 0,79x

Калибровочная кривая линейна до концентрации 0,94 ммоль/л (16,0 мг/100 мл).

Литература

Henry R.J., Sobel C., Kim J. - Amer. J. clin. Pathol., 1957, 28, 152.

3.4. Определение триглицеридов в сыворотке крови по цветной реакции с ацетилацетоном (HANTZSCH-реакция)

Принцип. Освобожденный в результате щелочного гидролиза триглицеридов глицерин окисляют до формальдегида метапериодатом натрия. Формальдегид образует с ацетилацетоном окрашенное соединение.

Реактивы.

1. Гептан, хч.

2. изо-Пропиловый спирт, хч.

3. Серная кислота, чда, хч 0,04 моль/л. К небольшому количеству дистиллированной воды добавляют 2,2 мл концентрированной серной кислоты, смешивают и после охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1 л.

4. Едкое кали, чда, хч. 17,5 г КОН растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор стабилен в течение 2 - 3-х месяцев при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

5. Натрий йоднокислый мета (метапериодат натрия, NaIO4).

6. Уксусная кислота, 50 г/л. 5 мл ледяной уксусной кислоты помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.

7. Периодатный реактив. 0,6 г NaIO4 растворяют в 100 мл 50 г/л раствора уксусной кислоты. Реактив стабилен в течение 2 - 3 месяцев при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре.

8. Аммоний уксуснокислый, чда, хч, 2 моль/л. 154,0 г уксуснокислого аммония растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем до 1 л, рН 8,6.

9. Ацетилацетон, чда.

10. Ацетилацетоновый реактив. 1,5 мл ацетилацетона доводят до 200 мл 2 моль/л раствором уксуснокислого аммония. Реактив стабилен в течение 2 - 3 месяцев при хранении в посуде из темного стекла в холодильнике.

11. Калибровочный раствор триолеина, 200 мг/100 мл. Растворяют 200 мг триолеина в изо-пропиловом спирте в мерной колбе на 100 мл. 1 мл калибровочного раствора содержит 2 мг триолеина.

Специальное оборудование.

1. Фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.

2. Баня водяная.

Ход определения. Опытная проба. К 0,5 мл сыворотки крови добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл изо-пропилового спирта и 1 мл 0,04 моль/л раствора серной кислоты. Тщательно перемешивают в течение 20 сек., оставляют стоять 5 мин. и центрифугируют 10 мин. К 0,4 мл из верхнего слоя жидкости добавляют 2 мл изо-пропилового спирта и 1 каплю раствора КОН. Тщательно перемешивают в течение 15 сек., пробирки закрывают пробками (притертыми или обернутыми фольгой) и нагревают на водяной бане в течение 10 мин. при 70°С. После охлаждения добавляют 0,2 мл периодатного реактива и 1 мл ацетилацетонового реактива, смешивают, закрывают пробками и вновь нагревают в течение 10 мин. на водяной бане при 70°С, после чего сразу, не допуская охлаждения пробы, измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 - 500 нм (синий светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя 0,5 см или на спектрофотометре - при 425 нм.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,5 мл воды.

Калибровочную пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки берут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл дист. воды.

Расчет проводят по формуле:

     Концентрация    Еоп x Ск

     триглицеридов = --------  x К,

     (ммоль/л)          Ек

     где: Еоп - экстинкция опытной пробы,

          Ек  - экстинкция калибровочной пробы,

          Ск  - концентрация  калибровочного  раствора  в  мг  на  100 мл

                (200,0),

          К   - коэффициент пересчета в единицы СИ - мг/100 мл в  ммоль/л

                равен 10/875 = 0,11 (10 - пересчет на 1 л сыворотки,  875

                - относительная молекулярная масса триолеина).

Схема определения

Компоненты	Пробы (мл)
Компоненты	опытная	калибровочная	холостая
Сыворотка Вода дистиллированная Калибровочный раствор Гептан изо-Пропиловый спирт Серная кислота 0,04 моль/л	0,5 - - 2 3,5 1	- 0,5 0,5 2 3,5 1	- 0,5 - 2 3,5 1
Перемешивают 20 сек., оставляют стоять 5 мин., центрифугируют 10 мин.
Верхний слой жидкости изо-Пропиловый спирт Едкое кали, раствор	0,4 2 1 капля	0,4 2 1 капля	0,4 2 1 капля
Перемешивают 15 сек., нагревают на водяной бане при 70°С 10 мин. и после охлаждения добавляют
Периодатный реактив Ацетилацетоновый реактив	0,2 1,0	0,2 1,0	0,2 1,0
Нагревают 10 мин. на водяной бане при 70°С и сразу измеряют в кювете 0,5 см при длине волны 400-500 нм (синий светофильтр) против холостой пробы.

Нормальные величины: 0,55 - 1,65 ммоль/л (50 - 150 мг/100 мл).

Оценка аналитической надежности метода (ммоль/л).

Воспроизводимость:

     n = 20          в серии:        y = 0,92       V = 3,8%

                     изо дня в день: y1 = 1,0       V = 7,0%

                                     y2 = 2,04      V = 3,3%

Правильность. Сравнение методов:

     а) с методом Карлсона (х1):       х1 = 1,32    S = 0,8

                         n = 50        y = 1,25     S = 0,78

             Различия по t-тесту - не достоверны (p > 0,05),

                    Коэффициент корреляции: r = 0,92.

                  Уравнение регрессии: y = 0,13 + 0,94х

б) с ферментативным методом (х2):

                         n = 30        x2 = 1,73     S = 1,2

                                       y = 1,76      S = 1,2

              Различия по t-тесту - не достоверны (p > 0,05)

                    Коэффициент корреляции: r = 0,93.

                  Уравнение регрессии: y = 0,67 + 0,98х

Калибровочная кривая линейна до 3,3 ммоль/л (до 300 мг/100 мл).

Примечания:

1. Исследование необходимо проводить в крови, взятой после 12 - 14 часового голодания.

2. Пробирки для исследования необходимо после обычного мытья тщательно прополоскать этиловым спиртом и высушить.

Литература

Gottfried S.P., Rosenberg B. - Clin. Chem., 1973, 19, 9, 1077-1078.

3.5. Определение свободного и эстерифицированного холестерина в сыворотке крови непрямым методом по реакции Златкиса-Зака

Принцип. Общий холестерин экстрагируют из сыворотки крови изо-пропиловым спиртом. Свободный холестерин осаждают из экстракта дигитонином и определяют в осадке по цветной реакции с хлорным железом. Эстерифицированный холестерин вычисляют по разности общего и свободного холестерина.

Реактивы.

1. изо-Пропиловый спирт, хч.

2. Уксусная кислота, ледяная, хч.

3. Серная кислота для пробы Саваля, чда, хч.

4. Ортофосфорная кислота, концентрированная, хч, чда.

5. Железо треххлористое (железо хлорное, FeCL3 x 6H2О), чда, хч.

6. Основной раствор хлорного железа. 2,5 г хлорного железа растворяют при нагревании на водяной бане в 80 мл ортофосфорной кислоты, охлаждают, доводят объем до 100 мл ортофосфорной кислотой. Раствор хлорного железа хранят в герметично закрытой посуде из темного стекла.

7. Рабочий раствор хлорного железа. 8 мл основного раствора хлорного железа осторожно смешивают с 80 мл серной кислоты и в охлажденную смесь доливают серную кислоту до объема 100 мл. Рабочий раствор хлорного железа стабилен при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре в течение месяца.

8. Раствор дигитонина, 10 г/л. 1,0 г дигитонина растворяют при нагревании на водяной бане в 50 мл этилового спирта; охлажденный раствор доливают до объема 100 мл дистиллированной водой, фильтруют.

9. Ацетон, ч, чда.

10. Основной калибровочный раствор холестерина, 40 мг/100 мл. Растворяют 40 мг холестерина в изо-пропиловом спирте в мерной колбе на 100 мл. 1 мл раствора содержит 0,4 мг холестерина.

11. Рабочий калибровочный раствор холестерина. К 20 мл основного калибровочного раствора холестерина в мерной колбе на 100 мл добавляют изо-пропиловый спирт до объема 100 мл. 1 мл рабочего раствора содержит 0,08 мг холестерина.

Специальное оборудование.

1. Фотоэлектроколориметр.

Ход определения.

Экстракция общего холестерина из сыворотки крови. К 0,2 мл сыворотки добавляют при постоянном встряхивании 4,8 мл изо-пропилового спирта, тщательно перемешивают и оставляют стоять 10 мин. при комнатной температуре. Центрифугируют 5 мин. и осторожно отсасывают надосадочную жидкость (экстракт). В экстракте определяют общий и свободный холестерин.

Определение общего холестерина. Опытная проба. К 1 мл экстракта добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл рабочего раствора хлорного железа, вновь тщательно перемешивают; оставляют стоять 10 - 14 мин., измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500 - 590 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против холостой пробы. Холостую пробу ставят как опытную пробу, но вместо экстракта берут 1 мл изо-пропилового спирта.

Определение свободного холестерина. Опытная проба. К 2 мл экстракта добавляют 1 мл 10 г/л раствора дигитонина и оставляют стоять в пробирках, закрытых пробками, в течение 30 мин., после чего центрифугируют 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно удаляют, к осадку добавляют 3 мл ацетона и вновь центрифугируют 5 мин. Надосадочную жидкость удаляют, пробирки оставляют открытыми в течение 5 - 10 мин. для испарения оставшегося ацетона. К осадку добавляют 1 мл изо-пропилового спирта, 2 мл ледяной уксусной кислоты, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл рабочего раствора хлорного железа, вновь тщательно перемешивают до полного растворения осадка и измеряют через 10 - 15 мин. на фотоэлектроколориметре при длине волны 500 - 590 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против холостой пробы. Холостая проба. К 1 мл изо-пропилового спирта добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл рабочего раствора хлорного железа, тщательно перемешивают и оставляют стоять на 10 - 15 мин. Калибровочная проба. К 1 мл рабочего калибровочного раствора добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты, тщательно перемешивают, добавляют 2 мл рабочего раствора хлорного железа, вновь тщательно перемешивают и через 10 - 15 мин. измеряют как опытную пробу.

Расчет проводят по формуле:

     Концентрация          Еоп x Ск    100        Еоп x 200

     общего холестерина = --------- x ----- x К = --------- x К,

     (ммоль/л)                 Ек      0,04           Ек

     где: Еоп - экстинкция опытной пробы,

          Ек  - экстинкция калибровочной пробы,

          Ск  - концентрация калибровочного раствора в мг на 1 мл (0,08).

         ---- - пересчет на 100 мл сыворотки, где 0,04 - объем пробы  при

         0,04   определении общего холестерина.

            К - коэффициент пересчета в единицы СИ - мг/100 мл в  ммоль/л

                равен 10/386,6 = 0,026 (10  - пересчет на 1 л  сыворотки,

                386,6 - относительная молекулярная масса холестерина).

Для свободного холестерина:

     Концентрация             Еоп x Ск    100        Еоп x 100

     свободного холестерина = -------- x ----- x К = --------- x К,

     (ммоль/л)                   Ек       0,08           Ек

     где: ---- - пересчет на  100 мл  сыворотки (0,08  - объем  пробы при

          0,08   определении свободного холестерина).

Остальные обозначения - те же, что и для общего холестерина.

Схема определения

Компоненты	Пробы (мл)
Компоненты	опытная	калибровочная	холостая
Экстракция
Сыворотка изо-Пропиловый спирт	0,2 4,8	- -	- -
Перемешивают, оставляют стоять 10 мин., центрифугируют 5 мин.
Определение общего холестерина
Экстракт Рабочий калибровочный раствор Изо-пропиловый спирт Уксусная кислота, ледяная	1,0 - - 2,0	- 1,0 - 2,0	- - 1,0 2,0
Тщательно перемешивают
Рабочий раствор хлорного железа	2,0	2,0	2,0
Тщательно перемешивают, измеряют через 10-15 мин.
Определение свободного холестерина
Экстракт Раствор дигитонина	2,0 1,0	- -	- -
Оставляют стоять 30 мин., центрифугируют 10 мин., надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют:
Ацетон	3,0	-	-
Центрифугируют 5 мин., надосадочную жидкость выливают, к осадку добавляют:
изо-Пропиловый спирт Рабочий калибровочный раствор Уксусная кислота, ледяная	1,0 - 2,0	- 1,0 2,0	1,0 - 2,0
Тщательно перемешивают
Рабочий раствор хлор- ного железа	2,0	2,0	2,0
Тщательно перемешивают, измеряют через 10-15 мин.

Нормальные величины.

Свободный холестерин составляет в среднем 30% от общего холестерина, эстерифицированный - 70%.

Содержание общего холестерина в сыворотке крови - 3,9 - 6,5 ммоль/л (150 - 250 мг/100 мл).

Оценка аналитической надежности метода (ммоль/л).

Воспроизводимость:

     в серии:             y = 2,01           V = 4,3%

     n = 20               y1 = 4,2           V = 3,3%

     изо дня в день:      y = 1,98           V = 4,4%

     n = 20               y1 = 1,0           V = 5,5%

Правильность:

Сравнение с ферментативным методом (метод Roschlau)

                          x = 2,26           S = 1,45

     n = 40               y = 2,18           S = 1,5

             Различия по t-тесту - не достоверны, (p > 0,05).

                     Коэффициент корреляции: r = 0,97

                  Уравнение регрессии: y = 0,03 + 0,95х.

Примечания:

1. Сыворотка должна быть свободной от гемолиза.

2. Очистка холестерина: 10 г холестерина растворяют в 300 мл ацетона при нагревании на водяной бане. Теплый раствор фильтруют; кристаллы, выпавшие после охлаждения, собирают на стеклянном фильтре и высушивают над силикагелем до постоянной массы. Очищенный холестерин хранят в защищенном от света и влаги месте.

Литература

Leffler H. - Amer. J. clin. Pathol., 1959, 31, 310-313.

Deutsches Arzneibuch. Diagnostische Laboratoriesmethoden. Berlin, 1968.

3.6. Определение общего кальция в сыворотке крови по цветной реакции с орто-крезолфталеинкомплексоном (о-КФК)

Принцип. о-КФК образует с кальцием в щелочной среде комплекс красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция.

Реактивы.

1. Борная кислота, чда, хч.

2. Кали едкое, чда, хч, 5 моль/л.

4. Боратный буфер. К 300 мл дистиллированной воды добавляют 200,0 г борной кислоты, прибавляют 580 мл 5 моль/л раствора едкого кали и растворяют при нагревании до 50 - 60°С. Объем доводят до 1 л дистиллированной водой в мерной колбе. Стабилен при хранении при комнатной температуре.

4. Гликокол (глицин); чда, хч.

5. Глициновый буфер, 2 моль/л. В 40 мл дистиллированной воды растворяют 7,5 г глицина и доводят объем до 50 мл в мерной колбе. Добавляют 2 капли хлороформа. Стабилен при хранении в холодильнике.

6. Этиловый спирт абсолютный.

7. Раствор 8-оксихинолина (оксина) в абсолютном спирте, 10 г/л.

8. Приготовление основного буфера. В мерную колбу на 500 мл вносят 12,5 мл боратного буфера, 5 мл глицинового буфера, 300 мл дистиллированной воды, перемешивают и 5 моль/л раствором едкого кали доводят рН до 10,5 - 10,6 (приблизительно 2 мл), добавляют 50,0 мл раствора 8-оксихинолина в абсолютном спирте и доводят объем до метки дистиллированной водой.

9. о-Крезолфталеинкомплексон (фталеинкомплексон, о-КФК), индикатор, чда.

10. Рабочий крезолфталеиновый раствор, 10,0 мг о-КФК растворяют в 100 мл основного буфера. Раствор хранят в холодильнике 2 - 3 дня.

11. Соляная кислота, чда, хч, 1 моль/л.

12. Магний хлористый (MgCL2 x 6H2O), чда, хч.

13. Раствор хлористого магния. 2,5 г хлористого магния (MgCL2 x 6H2O) растворяют в бидистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл и доводят объем до метки.

14. Кальций углекислый (СаСО3), хч. Для получения углекислого кальция квалификации хч приготовляют растворы: 100 г Са(NO3)2 x 4H2O (чда) в 200 мл дистиллированной воды и 47,0 г (NH4)2CO3 (ч) в 200 мл воды. Растворы фильтруют. По 10 мл каждого раствора медленно, с одинаковой скоростью, при перемешивании сливают в химический стакан с 200 мл дистиллированной воды. Дают отстояться и проверяют полноту осаждения, добавляя в случае необходимости еще раствор (NH4)2СО3. Осадок СаСО3 отсасывают и промывают его медленным током дистиллированной воды до полного удаления NO3, на что идет около 1,5 л дистиллированной воды. Промывают CaCO3, сушат при 110°С. Выход - 36 г препарата (94%) с содержанием 99,96% CaCO3 (Ю.В.Карякин, И.И.Ангелов "Чистые химические реактивы". М., Госхимиздат, 1955, 222).

15. Основной калибровочный раствор углекислого кальция. 0,2497 г углекислого кальция (хч) растворяют в 5 мл 1 моль/л раствора соляной кислоты в мерной колбе на 100 мл, доводят объем до метки бидистиллированной водой, добавляют несколько капель хлороформа. 1 мл раствора содержит 1 мг Са+2 (100 мг/100 мл раствора).

Ход определения. Опытная проба. В пробирку к 3 мл рабочего раствора о-КФК добавляют 0,05 мл сыворотки, перемешивают. Через 5 мин. измеряют в кювете с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 500 - 590 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов после добавления сыворотки. Холостую пробу ставят как опытную, но вместо сыворотки берут 0,05 мл бидистиллированной воды.

Расчет проводят по калибровочной кривой или по формуле.

Построение калибровочной кривой. Из основного калибровочного раствора готовят рабочие калибровочные растворы, как указано в таблице:

NN п/п	Основной калибровоч- ный раствор CaCO3 (мл)	Раствор MgCL2 (мл)	Бидистил. вода (мл)	Концентрация кальция (Са+2)
				мг/100 мл	ммоль/л
1. 2. 3. 4. 5.	5,0 7,5 10,0 12,5 15,0	1,0 1,0 1,0 1,0 1,0	94,0 91,5 89,0 86,5 84,0	5 7,5 10,0 12,5 15,0	1,24 1,86 2,49 3,10 3,70

К каждому рабочему калибровочному раствору прибавляют по несколько капель хлороформа.

Из каждого рабочего калибровочного раствора берут по 0,05 мл, обрабатывают и измеряют как опытную пробу.

Для получения более точных результатов ставят калибровочную пробу. Калибровочную пробу обрабатывают как опытную, но вместо сыворотки добавляют 0,05 мл рабочего калибровочного раствора N 3 (таблица) с содержанием ионов Са+2 10 мг/100 мл. В таком случае расчет ведут по формуле:

     Концентрация      Еоп x Ск

     общего кальция  = -------- x К,

     (ммоль/л)            Ек

     где: Еоп - экстинкция опытной пробы,

          Ек  - экстинкция калибровочной пробы,

          Ск  - концентрация калибровочного раствора в мг на 100 мл (10),

          К   - коэффициент пересчета в единицы СИ - мг/100 мл в  ммоль/л

                равен 10/40,08 = 0,249 (10  - пересчет на 1 л  сыворотки,

                40,08 - относительная молекулярная масса кальция).

Схема определения

Компоненты	Пробы (мл)
	опытная	холостая	калибровочная
Рабочий раствор о-КФК Бидистиллированная вода Рабочий калибровочный раствор N 3 Сыворотка	3,0 - - 0,05	3,0 0,05 - -	3,0 - 0,05 -
Перемешивают Через 5 мин. измеряют в кювете с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 500 - 590 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы

Нормальные величины: 1,9 - 2,5 ммоль/л (8 - 10 мг/100 мл).

Оценка аналитической надежности метода (ммоль/л).

Воспроизводимость:

     в серии:           y1 = 2,30           V = 2,4%

     n = 20             y2 = 3,07           V = 1,7%

     изо дня в день:    y1 = 2,29           V = 2,7%

     n = 20             y2 = 3,08           V = 1,8%

Правильность. Сравнение с методом атомноабсорбционной спектроскопии (х):

                     _             нормальные величины

     n = 59          x = 2,32               S = 0,22

                     y = 2,39               S = 0,20

              Различия по t-тесту - не достоверны (р > 0,05)

                    Коэффициент корреляции: r = 0,88.

                  Уравнение регрессии: y = 0,45 + 0,8x.

                         Патологические величины:

     n = 32          x = 1,97              S = 0,18

                     y = 1,89              S = 0,19

                    Коэффициент корреляции: r = 0,88.

                  Уравнение регрессии: y = 0,62 + 0,76x.

Калибровочная кривая линейна до концентрации 3,7 ммоль/л (15,0 мг/100 мл).

Примечание: Посуду моют обычным способом, затем кипятят несколько минут в 0,1 моль/л растворе соляной кислоты и споласкивают бидистиллированной водой.

Литература.

Boross M., Szilagyi L. - Kiserl. Orvostud, 1974, 26, 96-102.

3.7. Определение активности аспартатаминотрансферазы по оптическому тесту (UV-тест)

Принцип. Фотометрическое измерение изменения поглощения при 340 нм в результате окисления НАД x Н.

I. Основная реакция:

                           аспартатамино-

     L-аспартат +          трансфераза         щавелевоуксусная

     альфа-кетоглутарат ------------------->   кислота + L-глутамат

II. Индикаторная реакция:

     щавелевоуксусная кислота  малатдегидрогеназа

     + НАД x Н + Н+             -----------------> L-малат + НАД+

Равновесие реакции сдвинуто вправо. Активность фермента пропорциональная степени окисления НАД x Н в индикаторной реакции.

Реактивы.

1. Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4), хч.

2. Калий форфорнокислый двузамещенный (К2НРО4 x 3Н2О), чда.

3. L-аспарагиновая кислота или L-аспарагиновой кислоты натриевая соль.

4. Фосфатный буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4. 0,16 г однозамещенного фосфорнокислого калия и 2,07 г двузамещенного фосфорнокислого калия трехводного растворяют в 40 - 60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.

5. Субстратно-буферный раствор - 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4. 3,30 г L-аспарагиновой кислоты или 3,90 г натриевой соли L-аспарагиновой кислоты растворяют в 40 - 50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-аспарагиновую кислоту, то к навеске перед растворением в фосфатном буфере для установления рН 7,4 добавляют приблизительно 20 - 26 мл 1 моль/л раствора едкого натра и затем проверяют рН.

6. бета-Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л. 16,0 мг НАД x HNa2 x 4H2O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике.

7. альфа-Кетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л. 200,0 мг альфа-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и 0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль альфа-кетоглутаровой кислоты, то 260,0 мг соли растворяют в 3 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике. альфа-Кетоглутаровая кислота не должна содержать примесей пирувата и малата.

8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи (L-малат НАД+ оксиредуктаза КФ 1.1.1.37) МДГ. Суспензия в 50% растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность - выше 17 ммоль/(с x л). Примеси: аспартатаминотрансфераза < 0,005%, глутаматдегидрогеназа < 0,003%, лактатдегидрогеназа < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 20 мкл суспензии добавляют 5 мл воды.

9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи (L-лактат НАД+ оксиредуктаза КФ 1.1.1.27) ЛДГ. Суспензия в 50% растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность - выше 8,0 ммоль/(с x л). Примеси: аспартатаминотрансфераза < 0,01%, глутаматдегидрогеназа < 0,003%, аланинаминотрансфераза < 0,01%. Для приготовления рабочего раствора к 40 мкл суспензии добавляют 5 мл воды.

10. Натр едкий, 5 моль/л; 1 моль/л.

11. Натрий хлористый, 154 ммоль/л (физиологический раствор).

Все реактивы готовят на бидистиллированной воде, хранят при температуре от 0 до +4°С. Уменьшение стабильности может наступить за счет роста микроорганизмов. Поэтому в растворы рекомендуется добавлять несколько капель хлороформа.

Специальное оборудование.

Спектрофотометр с термостатированной кюветой. Колебания температуры не должны превышать +-0,1°С.

Ход определения. Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения.

Определение проводят по схеме:

Схема определения

В термостати- рованную кювету приливают (30°С или 37°С)	Опытная проба (мл)	Холостая проба (мл)	Конечная концентрация веществ в пробе
Субстратно-буферный раствор НАД x Н-раствор МДГ ЛДГ Сыворотка крови	3,0 0,05 0,05 0,05 0,5	3,0 0,05 0,05 0,05 -	80 ммоль/л фосфатный буфер 200 ммоль/л L-аспара- гиновой кислоты 0,18 ммоль/л 10 мкмоль/(с x л) 10 мкмоль/(с x л)
Прединкубация 10 минут при 30°С или 37°С
альфа-кетоглутарат- раствор	0,1	0,1	12 ммоль/л

Смешивают, тотчас измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 минуты (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию. Измерение опытной и холостой проб проводят против воды при 340 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Поправку на холостой опыт проводят по формуле:

      дельта Е       дельта Е        дельта Е

     (--------)оп - (--------)хол = (--------)скор

      дельта t       дельта t        дельта t

Обозначения - см. ниже.

Скорректированную величину опытной пробы используют в дальнейших расчетах.

Расчет производят по формуле:

     Каталитическая                V           дельта Е

     активность           = --------------- x (--------)скор,

     (моль/(с x м(в кубе)   эпсилон x l x v    дельта t

     где: V - объем реакционной смеси в литрах (3,75 x 10(-3).

          v - объем сыворотки в литрах (0,5 x 10(-3);

          t - время реакции в секундах;

     дельта Е

     -------- - изменение абсорбции за секунду;

     дельта t

     эпсилон - коэффициент молярной абсорбции НАД x Н  в  м2  x  моль(-1)

(6,3 x 10(2);

     1 - толщина слоя кюветы в метрах (1 x 10(-2).

Для данного метода имеет место следующее уравнение:

                         10(9) x (3,75 x 10(-3)

            -------------------------------------------------- x

            (6,3 x 10(2) x (1 x 10(-2) x (0,5 x 10(-3) x 10(3)

                  дельта Е                  10(6) x 3,75

               x (--------) нмоль/(с x л) = ------------ x

                  дельта t скор              6,3 x 0,5

                              дельта Е

                           x (--------) нмоль/(с x л)

                              дельта t скор

Перевод МЕ в единицы СИ: 1 МЕ = 1 мкмоль/(мин x л) = 16,67 нмоль/(с x л).

Нормальные величины - до 330 нмоль/(с x л) (до 20 МЕ) при 30°С.

Оценка аналитической надежности метода.

Воспроизводимость [нмоль/(с x л)]:

     в серии:        y1 = 280,0               V = 2,8%

     n = 20          y2 = 1300,0              V = 1,9%

     изо дня в день: y1 = 265,0               V = 6,0%

                     y2 = 1300,0              V = 5,4%

Правильность метода проверялась с помощью контрольной сыворотки с известной активностью фермента. Полученные результаты укладывались в пределы, указанные в аннотации к контрольной сыворотке (таблица).

Таблица

Оценка правильности метода [нмоль/(с x л)]

Контрольная сыворотка "Boehringer Mannheim" (ФРГ)	n	Должное значение и допустимые пределы в контрольной сыворотке	_ y +- S	t-тест
Precinorm Е Precipath Е	20 20	484 (410-550) 1360 (1130-1660)	482+-13 (460-520) 1370+-26 (1210-1410)	0,8 p>0,05 1,42 p>0,05

Реакция для аспартатаминотрансферазы линейна, т.е. величины дельтаЕ/дельта t постоянны, в течение 3 - 6 минут при величине активности фермента в сыворотке не более 4 000 нмоль/(с x л). Если величины дельтаЕ/дельта t больше 0,0025 в секунду или уменьшаются во время реакции, то сыворотку следует разбавить 154 ммоль/л раствором хлористого натрия.

Примечания:

1. По своим аналитическим качествам метод может быть использован в качестве временного референтного метода.

2. Метод определения активности аминотрансфераз по Райтману-Френкелю остается в качестве унифицированного (приказ N 290 от 11 апреля 1972 г.).

3. Для улучшения воспроизводимости результатов перед опытом можно готовить смесь реактивов на 10 определений в соотношении: 30 мл субстратно-буферного раствора и по 0,5 мл растворов НАД x Н, малатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

4. Материал для исследования. Предпочтительно использовать свежую сыворотку, свободную от гемолиза. Аспартатаминотрансфераза стабильна в сыворотке при хранении при +4°С не менее 7 дней.

Литература

Karmen A. - J.Clin. Invest. 1955, 34, 131.

Empfehlungen der deutschen Gessellschaft fur klinische Chemie. - Z. klin. Chem. klin. Biochem. 1970, 8, 658.

Делекторская Л.Н. - Вопросы мед. химии, 1978, 1, 92.

3.8. Определение активности гамма-глутамилтранспептидазы в сыворотке крови с субстратом L-гамма-глутамил-4-нитроанилидом

Принцип. Гамма-глутамилтранспептидаза (гамма-ГТП) катализирует реакцию переноса L-гамма-глутамилового остатка с L-гамма-глутамил-4-нитроанилида на глицилглицин. Освобожденный в ходе реакции 4-нитроанилин измеряется и служит мерой активности гамма-глутамилтранспептидазы.

Реактивы: Активность гамма-глутамилтранспептидазы можно определять набором реактивов, выпускаемым н/п "Лахема", ЧССР. Набор состоит из следующих реактивов:

1. Субстрат - 4 таблетки (1 таблетка содержит 28 мг L-гамма-глутамил-4-нитроанилида и 82 мг натрия хлористого).

2. Буферный раствор - 0,55 моль/л глицилглицина, рН 8,3 (11 мл).

3. Основной калибровочный раствор - 82,9 мг 4-нитроанилина на 100 мл (10 мл.).

Набор рассчитан на 50 определений.

Приготовление рабочих растворов реактивов.

1. Раствор субстрата. В пробирку наливают 10 мл дистиллированной воды и добавляют 1 таблетку субстрата. Таблетку измельчают стеклянной палочкой и, не переставая мешать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 секунд. Затем раствор охлаждают до 37°С и добавляют 2,5 мл буферного раствора. Приготовленный раствор субстрата во время работы хранят в водяной бане при 37°С. Неиспользованный раствор субстрата можно хранить в холодильнике в течение недели. Субстрат плохо растворим и при комнатной температуре выпадает в осадок. Поэтому перед употреблением выкристаллизовавшийся субстрат растворяют нагреванием в кипящей водяной бане. Нагревание и растворение субстрата можно повторять не более двух раз.

2. Раствор уксусной кислоты. Раствор уксусной кислоты не содержится в наборе. 10 мл ледяной уксусной кислоты, чда, доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Специальное оборудование.

Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.

Водяная баня.

Ход определения. Опытная проба. В пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню с температурой 37°С, приливают 0,05 мл сыворотки крови; содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 минут при 37°С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Холостую пробу ставят как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации. Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭКе при длине волны 400 - 500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет активности гамма-ГТП производят по калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой. Из основного калибровочного раствора готовят рабочие растворы, как указано в таблице.

N калиб. раст- воров	Калибровочный раствор 4-нитроанили- на (мл)	Дистиллиро- ванная вода (мл)	Активность гамма-ГТП
			мкмоль/ (мин. x л) МЕ, Е/л	нмоль/(с x л) коэф. пере- счета - 16,67
1. 2. 3. 4. 5. 6.	0,25 0,50 1,00 1,00 1,50 2,00	3,75 3,50 3,00 1,00 0,50 -	25 50 100 200 300 400	417 833 1667 3334 5001 6668

В каждую из 6 пробирок наливают по 0,05 мл рабочих калибровочных растворов NN 1 - 6, прибавляют по 3,5 мл раствора уксусной кислоты, перемешивают и измеряют экстинкцию против раствора уксусной кислоты при тех же условиях, что и опытную пробу. По полученным значениям экстинкций строят калибровочную кривую зависимости экстинкции от активности фермента.

Схема определения

Компоненты	Пробы
	опытная (мл)	холостая (мл)
Раствор субстрата	0,5	0,5
Нагревают на водяной бане несколько минут при 37°С
Сыворотка	0,05	-
Инкубируют 15 минут при 37°С
Сыворотка Раствор уксусной кислоты	- 3,0	0,05 3,0
Перемешивают и измеряют экстинкцию опытной пробы против холостой пробы в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 410 нм

     Перевод МЕ в единицы СИ: 1 МЕ = 1 мкмоль/(мин. x л) = 16,67 нмоль/(с

x л).

     Нормальные величины.

     Мужчины: 250 - 1767 нмоль/(с x л), (15 - 106 Е/л)

                                                                 при 37°С

     Женщины: 167 - 1100 нмоль/(с x л), (10 - 66 Е/л)

     Оценка аналитической надежности метода.

     Воспроизводимость [нмоль/(с x л)]:

              в серии:          y = 1167,0          V = 1,1%

     n = 20                     _

              изо дня в день:   y = 1200,0          V = 3,8%

Правильность. Сравнение унифицированного метода с методом непрерывного измерения с использованием в качестве субстрата L-гамма-глутамин-3-карбокси-4-нитроанилида (Rotochem II, фирма "Aminco", США, 30°С) в процентах от верхней границы нормы.

а) на нормальных величинах:

                                х = 56,9            S = 28,3

     n = 15                     _

                                y = 51,7            S = 23,3

              Различия по Т-тесту - не достоверны (р > 0,05)

                    Коэффициент корреляции: r = 0,89.

                   Уравнение регрессии: y = 8,7 + 0,7х.

б) на повышенных величинах: _ х = 243,0 S = 91,0 n = 15 _ y = 214,0 S = 72,4

Линейная зависимость между концентрацией 4-нитроанилина и оптической плотностью сохраняется до 5000,0 нмоль/(с x л), (до 300 Е/л).

Примечания:

1. Для увеличения точности количество реактивов и сыворотки увеличено вдвое по сравнению с набором.

2. Гемолиз не влияет на активность фермента.

3. Если полученная величина активности превышает 5000,0 нмоль/(с x л) (300 Е/л), то сыворотку следует разводить физиологическим раствором и результаты умножить на коэффициент разведения.

4. Фермент сохраняет стабильность в течение недели при температуре +4°С и 2 - 3 дня - при комнатной температуре.

Литература

Инструкция к набору реактивов Био-Ла-Тест для определения активности гамма-глутамилтранспептидазы в сыворотке крови, н/п "Лахема", ЧССР.

3.9. Скрининг-тесты для выявления наследственных или приобретенных дефектов обмена веществ у детей

Первый этап обследования
(исследование мочи)

Исследование проводят в моче, полученной в утренние часы. Собирают первую утреннюю, наиболее концентрированную, порцию мочи, измеряют ее количество.

3.9.1. Обнаружение белка

Проба с сульфосалициловой кислотой.

(См. Определение белка в моче, "Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования". М., 1973).

Проба с бромфеноловым синим.

Принцип. Изменение окраски индикатора в присутствии белка.

Реактивы.

1. 5,5-Диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

2. Натрий уксуснокислый (NaOOCCH3 x 3H2O).

3. Соляная кислота, 0,1 моль/л.

4. Барбитал-ацетатный буфер, рН 8,6. 8,16 г мединала и 6,48 г уксуснокислого натрия растворяют примерно в 100 мл дистиллированной воды, добавляют 60 мл соляной кислоты и доводят дистиллированной водой до 1 литра.

5. Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор.

6. Цинк сернокислый (ZnSO4 x 7H2O).

7. Раствор индикатора, 0,5 г бромфенолового синего. 50,0 г сернокислого цинка растворяют в 1 литре дистиллированной воды.

8. Уксусная кислота. К 1 мл уксусной кислоты добавляют 99 мл дистиллированной воды.

9. Раствор альбумина. 10,0 г альбумина на 1 литр физиологического раствора (хлористый натрий, 9 г/л). Рабочие растворы альбумина готовят путем разведения раствора альбумина дистиллированной водой в 2, 4, 8, 16 раз.

10. Натр едкий, 0,02 моль/л.

Ход обнаружения. 0,02 мл мочи наносят на фильтровальную бумагу, предварительно пропитанную барбитал-ацетатным буфером и высушенную. Еще раз высушивают, окрашивают, опуская бумагу в раствор с индикатором, затем отмывают в растворе уксусной кислоты в течение 5 - 7 минут.

Оценка результатов. Оценку результатов проводят визуально с помощью рабочих растворов альбумина, обработанных так же, как и опытная проба. Метод позволяет обнаружить в моче белок в концентрации 2 мкг в пробе.

3.9.2. Проба на гипераминоацидурию

Принцип. Аминокислоты с нингидрином при нагревании образуют соединения, окрашенные в сине-фиолетовый цвет.

Реактивы.

1. Нингидрин.

2. Ацетон.

3. Уксусная кислота ледяная.

4. Раствор нингидрина, 5,0 г нингидрина на 1 литр смеси. К 0,5г нингидрина добавляют 95 мл ацетона, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 4 мл дистиллированной воды.

5. Гликокол (глицин).

6. Раствор глицина. 150,0 мг глицина растворяют в 100 мл дистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1,5 мг глицина, что соответствует 0,28 мг аминоазота. Из данного раствора глицина готовят серию разведений: 1, 3, 6, 9, 18, 24, 36, 54 мл раствора глицина, доводят до 100 мл водой. Приготовленные растворы соответствуют 0,28; 0,84; 1,68; 2,52; 5,04; 6,72; 10,08; 16,12 мг аминоазота в 100 мл. Растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 1 месяца.

Ход обнаружения, 0.02 мл мочи наносят на фильтровальную бумагу и после подсушивания окрашивают раствором нингидрина, затем высушивают на воздухе до полного исчезновения запаха уксусной кислоты и помещают в сушильный шкаф при температуре 60°С на 15 минут.

Приготовленные растворы глицина обрабатывают так же, как мочу, беря по 0,02 мл каждого раствора глицина.

Оценка результатов. Окраску пробы сравнивают с окраской растворов глицина. Результаты выражают в мг аминоазота, выделенного с мочой за сутки.

Выделение аминоазота мочи за сутки у детей в норме не превышает 1 - 2 мг/кг веса. В ночное время выделяется 2/3 - 3/4 суточного количества аминоазота.

3.9.3. Обнаружение цистина и гомоцистина

Принцип. Азид натрия и иод образуют комплекс бурого цвета, который обеспечивается в присутствии цистина и гомоцистина.

Реактивы.

1. Натрий азид.

2. Иод кристаллический.

3. Раствор иода. 12,69 г кристаллического иода отвешивают в бюксе, растворяют в насыщенном растворе иодистого калия (37 г Kl в 26 мл дистиллированной воды), переносят в колбу и доливают дистиллированной водой до 1 литра. Можно использовать фиксанал иода, 0,1 н.

4. Этиловый спирт 96°.

5. Раствор азида натрия. 1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл раствора иода и доводят объем этиловым спиртом до 100 мл. Раствор хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.

Ход обнаружения. 1 каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу и после высушивания добавляют 1 каплю раствора азида натрия. В течение 5 минут наблюдают за исчезновением бурой окраски.

Оценка результатов. По времени (в минутах) исчезновения окраски судят о наличии указанных аминокислот в пробе. В норме окраска исчезает через 2-3 минуты. Для полуколичественной оценки окраску пробы можно сравнивать с цветной шкалой. Для получения шкалы готовят раствор цистина и гомоцистина, содержащий 0,6 мг каждой аминокислоты в 1 мл. Из этого раствора готовят растворы, содержащие от 0,3 до 0,6 мг аминокислот в 1 мл. Нижняя граница чувствительности пробы - 0,3 мг/мл.

Примечание. Ложноположительную реакцию дают ангидрид аргининянтарной кислоты, ацетон, некоторые лекарственные препараты.

3.9.4. Обнаружение пролина и других аминокислот

Принцип. Изатин образует с некоторыми аминокислотами специфически окрашенные соединения.

Реактивы.

1. Изатин.

2. Ацетон.

3. Раствор изатина в ацетоне, 0,2 г/л. Раствор хранят в холодильнике при +4°С.

4. Соляная кислота, 1 моль/л.

Ход обнаружения. Фильтровальную бумагу пропитывают раствором изатина в ацетоне и высушивают. Затем наносят на нее 1 каплю мочи, высушивают при 100°С в течение 10 минут, смачивают раствором соляной кислоты и промывают проточной водой.

Оценка результатов. Сине-серую окраску дает повышенное содержание фенилаланина, коричневую - триптофан, пурпурную - смесь различных аминокислот, а появление синей окраски в виде ободка свидетельствует о присутствии в моче свободного пролина (не менее 0,1 мг/мл).

Окраску пробы можно сравнить с цветной шкалой. Для получения шкалы готовят растворы пролина, фенилаланина и триптофана, содержащие по 0,5 мг аминокислоты в 1 мл. Из этих растворов готовят растворы, содержащие от 0,1 до 0,5 мг соответствующих аминокислот в 1 мл.

3.9.5. Обнаружение кетокислот (проба с треххлористым железом)

Принцип. Треххлористое железо в присутствии соляной кислоты дает с кетокислотами специфически окрашенные соединения.

Реактивы.

1. Железо треххлористое (FeCl3 x 6H2O), 100,0 г/л раствора.

2. Соляная кислота, 10% раствор.

3. Магний хлористый (МgCl2 x 6H2O).

4. Аммиак водный, концентрированный.

5. Раствор хлористого магния. К 11,0 г хлористого магния добавляют 20 мл концентрированного водного аммиака и объем доводят водой до 1 литра.

Ход обнаружения. Вариант I. К 0,5 мл мочи добавляют 0,25 мл раствора треххлористого железа. Реакция положительна при появлении темно-зеленого осадка.

Вариант II. К 4 мл мочи добавляют 1 мл раствора хлористого магния (для связывания фосфатов, мешающих реакции), перемешивают и через 5 минут фильтруют. К фильтрату добавляют 2 капли раствора соляной кислоты и 2 капли раствора треххлористого железа. Развитие окраски наблюдают в течение 5 минут.

Оценка результатов. Появляющаяся окраска может указывать также на присутствие в моче не только кетокислот, но и других соединений (таблица). О наличии кетокислот судят по характеру окраски (таблица).

Таблица

Цветная реакция различных соединений
с треххлористым железом

Окраска

Соединения

Желтая

Желтая, быстро исчезающая

Зеленая или сине-зеленая

Сине-зеленая

Темно-зеленая, позднее
коричневая

Красно-коричневая

Красно-коричневая с пере-
ходом в зелено-синюю

Розово-лиловая

Пурпурная

Пурпурная, переходящая в
красно-коричневую

Быстро появляющаяся темно-
коричневая

Сероватая с зеленым оттенком

Пировиноградная, альфа-кетоизовалериано-
вая кислоты

Парагидроксифенилпировиноградная, гомо-
гентизиновая кислоты

Фенилпировиноградная, имидазолпировиног-
радная кислоты

Билирубин

Ксантуреновая кислота

Ацетоуксусная, парааминосалициловая кис-
лоты

Ванилиновая кислота

Орто-гидроксифенилуксусная кислота

Производные фенотиазина, салицилаты

альфа-кетобутират

3-гидроксиантраниловая кислота

альфа-кетоизокапроновая, альфа-кетоизо-
валериановая, альфа-кетометилмалоновая
кислоты

3.9.6. Обнаружение кетокислот по реакции с (2,4-динитрофенил)-гидразином

Принцип. Кетокислоты образуют с (2,4-динитрофенил)-гидразином окрашенные гидразоны.

Реактивы.

1. Соляная кислота, 2 моль/л.

2. (2,4-Динитрофенил)-гидразин (2,4-ДНФГ).

3. Раствор 2,4-ДНФГ. 2,0 г 2,4-ДНФГ на 1 литр раствора 2 моль/л соляной кислоты.

4. Диэтиловый эфир.

5. Натрий углекислый (Na2CO3), 100 г/л раствора.

Ход обнаружения. 0,25 мл мочи и 1,0 мл раствора 2,4-ДНФГ смешивают. Через 10 минут прибавляют 1,25 мл диэтилового эфира и хорошо перемешивают. Слой диэтилового эфира отсасывают и переносят в пробирку, куда добавляют равный объем раствора углекислого натрия. Содержимое пробирки перемешивают.

Оценка результатов. Интенсивность развивающейся окраски оценивают визуально по шкале от 0 до 4. Желтая окраска соответствует цифре 2, оранжевая - 3, темно-оранжевая (почти коричневая) - 4. В норме окраска не появляется.

3.9.7. Обнаружение кетоновых тел (См. Обнаружение кетоновых тел в моче, 1.3.1.).

3.9.8. Обнаружение гомогентизиновой кислоты

Принцип. В щелочной среде гомогентизиновая кислота быстро окисляется с образованием соединений сине-фиолетового цвета.

Реактивы.

1. Натр едкий, 100 г/л раствора.

Ход обнаружения. 0,5 мл мочи подщелачивают несколькими каплями раствора едкого натра. Результаты оценивают через 1 - 2 минуты.

Оценка результатов. При положительной реакции моча окрашивается в сине-фиолетовый цвет. В норме окраска не появляется.

3.9.9. Обнаружение индикана (проба Обермейера)

Принцип. Превращение индикана в индоксил после гидролиза эфирной связи сильной минеральной кислотой и последующее окисление индоксила треххлористым железом с образованием окрашенного соединения.

Реактивы.

1. Свинец уксуснокислый [(CH3COO)2 x Pв x 3H2O] x 100 г/л раствора.

2. Соляная кислота, концентрированная.

3. Железо треххлористое (FeCl3 x 6H2O).

4. Реактив Обермейера. 0,4 г треххлористого железа растворяют в 100 мл концентрированной соляной кислоты.

5. Хлороформ.

6. Натрий серноватистокислый (натрий тиосульфат, Na2S2O3 x 5H2O), 200 г/л раствора.

Ход обнаружения. К 4 мл мочи прибавляют 0,4 мл раствора уксуснокислого свинца для осаждения желчных пигментов, солей и других веществ, мешающих реакции. Фильтруют. 1 - 2 мл фильтрата смешивают с равным объемом реактива Обермейера, прибавляют 0,5 - 1 мл хлороформа и острожно перемешивают. Если слой хлороформа (нижний) окрашивается в синий или в красный цвет, его отсасывают, переносят в другую пробирку и добавляют несколько капель раствора тиосульфата натрия.

Оценка результатов. При положительной реакции окраска слоя хлороформа не исчезает при добавлении раствора тиосульфата натрия. В норме реакция отрицательная.

Примечание. Наличие в пробе уротропина мешает определению индикана.

3.9.10. Обнаружение глюкозы

(См. Определение сахара в моче, "Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования", М., 1973).

3.9.11. Обнаружение фруктозы (проба Селиванова)

Принцип. Фруктоза с резорцином образует при нагревании соединение красного цвета.

Реактивы.

1. Соляная кислота, 1 моль/л.

2. Резорцин, 5,0 г на 1 литр раствора соляной кислоты.

Ход обнаружения. К 1 мл раствора резорцина прибавляют 2 мл мочи, быстро нагревают в водяной бане до закипания.

Оценка результатов. При положительной реакции быстро развивается интенсивное красное окрашивание. В норме окраска не появляется.

Примечание. При длительном кипячении положительную реакцию может дать глюкоза. Поэтому оценку пробы производят в момент закипания. Проба может быть положительной также при пищевой нагрузке фруктами и медом.

3.9.12. Обнаружение лактозы и мальтозы (проба Велька)

Принцип. Лактоза и мальтоза с аммиаком в щелочной среде образуют при нагревании окрашенные соединения.

Реактивы.

1. Аммиак водный, концентрированный.

2. Кали едкое, 200 г/л раствора.

Ход обнаружения. К 5 мл мочи прибавляют 2,5 мл концентрированного водного раствора аммиака, 0,2 мл раствора КОН и нагревают в водяной бане 30 мин. при 60°С.

Оценка результатов. При положительной реакции на лактозу через несколько минут появляется коричневая окраска, при положительной реакции на мальтозу - красное окрашивание. В норме окраска не появляется.

3.9.13. Обнаружение пентоз (проба Биаля)

Принцип. Пентозы с орцином и треххлористым железом в кислой среде образуют при нагревании окрашенные соединения.

Реактивы.

1. 5-метилрезорцин (орцин).

2. Соляная кислота, концентрированная.

3. Железо треххлористое (FeCl3 x 6H2O), 100 г/л раствора.

4. Реактив Биаля. 1,0 г орцина растворяют в 500 мл соляной кислоты и добавляют 1 мл раствора треххлористого железа.

Ход обнаружения. 5 мл реактива Биаля смешивают с 1 мл мочи и нагревают до кипения.

Оценка результатов. При положительной реакции появляется яркая окраска желто-зеленого цвета. В норме окраска не появляется.

3.9.14. Обнаружение глюкозоаминогликанов
(проба с цетилтриметиламмонием бромистым)

Принцип. Цетилтриметиламмоний бромистый с глюкозоаминогликанами образует в кислой среде осадок белого цвета.

Реактивы.

1. Лимонная кислота.

2. Натр едкий.

3. Цитратный буфер, 1 моль/л, рН 5,7. 210,0 г лимонной кислоты растворяют в небольшом количестве воды, добавляют 120,0 г NaOH, охлаждают и доводят дистиллированной водой до 1 литра.

4. Раствор цетилтриметиламмония бромистого (ЦТАБ), 25,0 г на 1 литр цитратного буфера.

Ход обнаружения. К 5 мл мочи прибавляют 1 мл раствора ЦТАБ и в течение 30 минут наблюдают образование осадка. Пробу ставят со свежей мочой при комнатной температуре.

Оценка результатов. Проба положительна при образовании осадка. В норме осадок не образуется. Проба дает до 40% ложноположительных результатов.

3.9.15. Обнаружение кальция (проба Сулковича)

Принцип. Ионы кальция с щавелевой кислотой образуют нерастворимую щавелевокислую соль.

Реактивы.

1. Щавелевая кислота.

2. Аммоний щавелевокислый.

3. Уксусная кислота, ледяная.

4. Реактив Сулковича. 2,5 г щавелевой кислоты, 2,5 г щавелевокислого аммония и 5 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в 50 мл дистиллированной воды; конечный объем раствора доводят водой до 150 мл.

Ход обнаружения. К 0,5 мл мочи прибавляют 0,5 мл реактива Сулковича, перемешивают. Через 1 - 2 минуты оценивают степень помутнения.

Оценка результатов. Степень помутнения сравнивают с профильтрованной мочой этого же образца и оценивают визуально:

0 - отсутствие помутнения,

1 - слабое помутнение,

2 - умеренное помутнение,

3 - значительное помутнение,

4 - резко выраженное помутнение.

Помутнение 3 и 4 степени может свидетельствовать о повышенном содержании кальция в моче.

3.9.16. Определение хлора

(См. Определение хлора в сыворотке крови, моче и в спинномозговой жидкости - "Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследований". М., 1973).

Литература

Файбель Г. Капельный анализ органических веществ. М., 1962.

Файбель Г. Капельный анализ неорганических веществ. М., 1974.

Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София, 1968.

4. Иммунологические исследования

4.1. Определение поверхностного антигена вирусного гепатита в (НBsAG) в сыворотке крови

4.1.1 Метод двойной диффузии в геле

Принцип. Антисыворотка против поверхностного антигена вирусного гепатита В, реагируя в геле с поверхностным антигеном гепатита В, иммунодиагностикума и с поверхностным антигеном гепатита B, находящимся в исследуемой сыворотке, образует с каждым из них полосы преципитации, плавно переходящие друг в друга, что указывает на серологическое тождество сравниваемых антигенов.

Реагенты.

1. Иммунодиагностикум для выявления поверхностного антигена вирусного гепатита В и антител к нему. Иммунодиагностикум представляет собой комплект из двух лиофилизированных препаратов: 1) моноспецифической антисыворотки к НВs-антигену (АТ) и 2) человеческой сыворотки, содержащей НВs-антиген (АГ). В качестве АТ может быть использована сыворотка крови человека, содержащая антитела к HBs-антигену.

2. Натрий хлористый.

3. Трис-(оксиметил)-аминометан.

4. 5,5-Диэтилбарбитуровая кислота (веронал).

5. 5,5-Диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

6. Растворы для приготовления геля: а) раствор хлористого натрия: 9 г хлористого натрия растворяют в 400 мл дистиллированной воды, доводят рН до 7,0 - 7,2 0,1 моль/л раствором NaOH или HCl и доливают дистиллированной водой до 500 мл; б) Трис-буфер, рН 8,0: трис-(оксиметил)-аминометан 6,0 г, хлористый натрий 5,85 г, дистиллированной воды до 500 мл; в) барбиталовый буфер (мендинал-вероналовый), 0,025 моль/л, рН 8,6: мединал 4,38 г, веронал 0,69 г, хлористый натрий 5,85 г, воды дистиллированной до 500 мл.

7. Агар или агароза для приготовления геля. Используют агар фирмы "Дифко", дальневосточный агар специальной очистки, агарозу или агар, очищенный одним из способов, описанных в приложении к методу.

8. Гель. 1 г агара или агарозы расплавляют на кипящей водяной бане в 50 мл дистиллированной воды до полного расплавления агара или агарозы, т.е. до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и совершенно однородным. В горячем виде его смешивают с равным по объему количеством одного из перечисленных в пункте 6 растворов, разливают по пробиркам или флаконам и хранят в холодильнике при 4°С. В день постановки опыта расплавляют на кипящей водяной бане требуемое для работы количество геля. Расплавлять гель более 2 раз не рекомендуется.

9. Хлористый натрий, 100 г/л раствора.

10. Аммоний сернокислый, 450 г/л раствора или кадмий сернокислый, 0,65 г/л раствора.

Специальное оборудование.

1. Стеклянные пластинки. Удобно использовать отмытые от эмульсии фотопластинки размером 9 х 12 см, разделенные перегородками на 3 равных отсека. Перегородки делают из такой же фотопластинки, разрезанной на полоски, шириной 4 - 5 мм и приклеивают их к стеклу.

Для предотвращения подсыхания геля такие же полоски приклеивают по краям пластинки. Можно пользоваться и стеклами других размеров, например 6 х 9 см, 3 х 6 см или 2,5 х 7,5 см, которые на отсеки не делят.

2. Столик с уровнем, на котором производят заливку геля на пластинки.

3. Штамп для просечения контуров лунок в геле представляет собой пластинку (удобнее всего из плексигласа), в которой неподвижно укреплены 7 пробойников (6 из них расположены по периферии вокруг одной центральной). Расстояние между их центрами - 4 - 6 мм. Каждый из пробойников штампа представляет собой металлическую трубку, диаметром 2 - 3 мм, один конец которой остро заточен изнутри. Пробойник закрепляется в пластинке так, чтобы заточенный конец выступал над пластинкой на 10 - 15 мм, причем кромки заточенных концов пробойников должны находиться строго на одной поверхности.

4. Вакуумный (водоструйный или масляный) насос.

5. Металлическая или стеклянная трубочка, диаметром несколько меньше, чем у пробойника штампа, для отсасывания гелевых пробок.

6. Колба или склянка для улавливания гелевых пробок, вмонтированная между вакуумом и трубочкой для отсасывания геля.

7. Пастеровские пипетки с оттянутыми концами или капилляры.

8. Влажная камера (например, эксикатор), на дно которой налита вода с антисептиком - тимолом или фенолом (1 - 2 кристаллика).

Ход определения. Отмытые и обезжиренные стеклянные пластинки помещают на строго горизонтальную поверхность столика, установленного по уровню, и в каждый отсек заливают расплавленный на водяной бане гель вровень с поверхностью разделительной перегородки (примерно по 5 - 6 мл). После застывания геля (через 15 - 30 минут) просекают в геле контуры лунок штампом и удаляют гелевые пробки отсасыванием с помощью трубки, диаметр которой меньше, чем у пробойника штампа, подсоединенной через колбу-улавливатель к вакууму. В одном отсеке пластинки можно разместить 3 фигуры, в каждой из которых - по 4 исследуемых сыворотки.

Чтобы получить такую же толщину слоя геля на стеклах других размеров, наливают 6 - 7 мл геля на стекло, размером 6 х 9 см, и размещают на нем 6 - 8 фигур в два ряда, а на стеклах 3 х 6 и 2,5 х 7,5 см - по 3 мл геля и по 3 - 4 фигуры.

Лунки заполняют с помощью капилляров или пастеровских пипеток с оттянутыми концами точно до краев лунок, вровень с поверхностью геля. Для каждого образца используют отдельный капилляр. В центральную лунку заливают АТ иммунодиагностикума, в первую и четвертую периферические лунки - АГ иммунодиагностикума, в остальные четыре - исследуемые сыворотки. Сразу после заполнения лунок пластинку помещают во влажную камеру на 18 - 24 часа при комнатной температуре или в термостат при 28°С или 37°С. Для предотвращения подсыхания геля на свободной его поверхности просекают дополнительные лунки, которые заполняют физиологическим раствором.

Оценка результатов. По окончании инкубации пластинку помещают на 1 час в 100 г/л раствор хлористого натрия, после чего просматривают ее на темном фоне в косом проходящем ярком свете (лампа не менее 100 ватт) и отмечают наличие или отсутствие полос преципитации.

Затем пластинку вновь инкубируют в течение 7 суток, причем условия инкубации зависят от того, на каком растворе приготовлен гель. Пластинки с гелем, приготовленным на буфере, помещают для инкубации во влажную камеру, а пластинки с гелем, приготовленным на растворе хлористого натрия, помещают в 100 г/л раствор хлористого натрия и ставят в холодильник. В целях предосторожности помещать пластинки в раствор хлористого натрия и вынимать из него необходимо в резиновых перчатках.

Обычно линии преципитации выявляются в первые 3 дня, однако более слабые могут проявиться и позднее; поэтому отрицательный ответ выдается только по завершении 7-дневной инкубации. По прошествии указанного времени проводят окончательный учет результатов. Для усиления полос преципитации пластинку помещают после инкубации в раствор сульфата аммония или в раствор сернокислого кадмия на 10 минут.

Приведенная схема постановки реакции позволяет одновременно определять в исследуемой сыворотке наличие как HBs-антигена, так и HBs-антител, так как исследуемые сыворотки находятся в смежном положении как с АТ, так и с АГ иммунодиагностикума.

Положительной на наличие HBs-антигена реакция считается в том случае, если линия преципитации, образовавшаяся между исследуемой сывороткой и АТ имммунодиагностикума, сливается с линией преципитации, образовавшейся между компонентами иммунодиагностикума.

Возможно неполное слияние полос преципитации с образованием отростка - "шпоры", которое наблюдается в случае частичной идентичности антигена в исследуемой сыворотке с АГ иммунодиагностикума и обусловлено наличием, помимо общих, дополнительных детерминант. В этих случаях дается также положительный ответ.

Отрицательной на наличие HBs-антигена реакция считается при отсутствии линий преципитации между исследуемой сывороткой и АТ иммунодиагностикума.

В отдельных случаях исследуемые сыворотки образуют с АТ иммунодиагностикума полосу преципитации, не сливающуюся с полосой преципитации, образованной АГ и АТ иммунодиагностикума, или пересекающую ее. Это свидетельствует о наличии в исследуемой сыворотке неидентичных, антигенно отличных от поверхностного антигена гепатита В антигенов и расценивается также как отрицательная реакция.

Положительной на наличие антител к HBs-антигену реакция считается в том случае, если между исследуемой сывороткой и АГ иммунодиагностикума образуется линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации, образованной компонентами иммунодиагностикума.

4.1.2. Метод встречного иммуноэлектроосмофореза

Принцип. Поверхностный антиген вирусного гепатита В (HBsAg), обладая электрофоретической подвижностью альфа-глобулинов, в электрическом поле передвигается в направлении анода. Антитела к HBs-антигену - гамма-глобулины - под действием эндоосмоса двигаются в направлении катода. Встречаясь в зоне эквивалентности, они образуют видимую линию преципитации, расположенную перпендикулярно к направлению тока.

Реагенты.

1. Иммунодиагностикум для выявления поверхностного антигена вирусного гепатита В и антител к нему. Тот же, что и в методе двойной диффузии в геле.

2. 5,5-Диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

3. Натрий уксуснокислый.

4. Соляная кислота, 0,1 моль/л.

5. Буферный раствор для приготовления геля и для заполнения электродных камер, (ацетат-барбиталовый буфер), рН 8,1 - 8,4: мединал 8,14 г; уксуснокислый натрий 6,48 г; соляная кислота 0,1 моль/л, 90 мл; дистиллированной воды до 500 мл. Растворение реактивов производят в указанной последовательности. Корректируют рН 0,1 моль/л раствором HCl или NaOH. Для заполнения электродных камер буфер разводят вдвое дистиллированной водой.

Для приготовления геля и заполнения электродных камер можно пользоваться также барбиталовым буфером (мединал-вероналовым), рН 8,6: мединал 10,32 г, веронал 1,84 г, дистиллированной воды до 1 литра.

6. Агар или агароза. Те же, что и в методе двойной диффузии в геле.

7. Гель. Готовится так же, как в методе двойной диффузии в геле.

8. Натрий хлористый, 100 г/л раствора.

9. Аммоний сернокислый, 450 г/л раствора или кадмий сернокислый, 0,65 г/л раствора.

Специальное оборудование.

1. Стеклянные пластинки 9 х 12 см или 13 х 18 см (отмытые от эмульсии фотопластинки).

2. Столик с уровнем, на котором производят заливку геля на пластинки.

3. Штамп для просечения контуров лунок в геле. Он представляет собой пластинку с пробойниками, расположенными попарно рядами. Диаметр пробойников - 4 - 5 мм, расстояние между центрами пробойников в ряду и в паре - 8 - 10 мм, расстояние между рядами пар пробойников - 20 - 30 мм.

4. Вакуумный (водоструйный или масляный) насос.

5. Металлическая или стеклянная трубочка для отсасывания гелевых пробок, диаметром несколько меньше, чем у пробойника штампа.

6. Колба или склянка для улавливания гелевых пробок, вмонтированная между вакуумом и трубочкой для отсасывания.

7. Стеклянные капилляры или пастеровские пипетки с оттянутыми концами.

8. Прибор для электрофореза.

Ход определения. На тщательно обезжиренных стеклянных пластинках отмечают анод и катод и номер постановки опыта. Пластинку помещают на строго горизонтальную поверхность надписанной стороной вниз и заливают ее расплавленным гелем так, чтобы получился слой геля толщиной примерно 1,5 мм, для чего на пластинку размером 9 х 12 см наливают 15 - 18 мл геля, а на пластинку размером 13 х 18 см - примерно 30 мл геля. Через 15 - 20 минут, после застывания геля, в нем просекают контуры лунок с помощью штампа. Лунки пробивают парами, располагая их ряды на расстоянии 2,5 см от края пластинки. Штамп при просечении лунок следует держать строго вертикально, чтобы края лунок не получились скошенными, так как это приводит к искажению полос преципитации. Гелевые пробки из лунок осторожно отсасывают с помощью вакуума.

В лунки на стороне анода капилляром или пастеровской пипеткой вровень с поверхностью геля вносят АТ иммунодиагностикума, в первую и последнюю лунки на стороне катода - АГ иммунодиагностикума, в остальные лунки на стороне катода - исследуемые сыворотки. После заполнения лунок пластинку помещают в прибор для электрофореза. На два противоположных края стекла со стороны электродов накладывают смоченные буфером двойные полосы фильтровальной бумаги, ширина которых соответствует ширине стекла. Они должны плотно прилегать к гелю и закрывать 0,5 - 1,0 см его. Свободные концы полосок бумаги опускают в электродные камеры с буфером. Включают прибор. Для пластинки размером 9 х 12 см устанавливают силу тока примерно 28 - 30 мА и напряжение тока примерно 110 - 120 В, для пластинки размером 13 х 18 см - силу тока примерно 30 мА и напряжение - 180 - 200 В. Через 1,5 - 2 часа прибор выключают, бумажные полосы убирают и пластинку просматривают в косом проходящем свете на черном фоне, начиная с контрольных лунок. Буферный раствор из электродных камер сливают и, после контроля рН, используют в следующих исследованиях.

Оценка результатов. Для более полного выявления полос преципитации пластинку помещают во влажную камеру на ночь при комнатной температуре. После инкубации ее помещают на 1 час в 100 г/л раствор хлористого натрия, а затем обрабатывают раствором сернокислого аммония или раствором сернокислого кадмия в течение 10 минут, после чего повторно отмечают наличие или отсутствие полос преципитации.

Учитывая, что при проведении этой реакции могут образовываться неспецифические полосы преципитации ввиду присутствия в сыворотке человека нескольких преципитирующих систем, необходимо сравнивать все видимые полосы преципитации по положению и форме с контрольными полосами преципитации, образованными АГ и АТ иммунодиагностикума. При отсутствии линий преципитации между реагентами иммунодиагностикума опыт следует повторить.

Положительным результатом считается наличие линии преципитации между исследуемой сывороткой и АТ иммунодиагностикума, находящейся ближе к лунке с исследуемой сывороткой.

Отрицательный результат - отсутствие линии преципитации.

4.1.3. Метод прерывистого встречного иммуноэлектроосмофореза

Принцип. Эта модификация встречного иммуноэлекроосмофореза основана на уменьшении ионной силы барбиталового буфера в агаровом геле по сравнению с буфером в электродных камерах. В этих условиях гель нагревается при прохождении через него тока до 30°С - 35°С, НBs-антиген и антитела к нему быстрее двигаются по направлению друг к другу, линии преципитации образуются через 50 - 60 минут на одинаковом удалении от лунок с антигеном и антителами, что позволяет их легче учитывать и отличать от неспецифических линий преципитации, расположенных обычно у самых лунок.

Реагенты.

1. Иммунодиагностикум - тот же, что в описанных методах.

2. 5,5-Диэтилбарбитуровая кислота (веронал).

3. 5,5-Диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

4. Барбиталовый буфер рН 8,6 для заполнения электродных камер: веронал 1,84 г, мединал 10,3 г, дистиллированной воды до 1 л. Корректируют рН 0,1 моль/л раствором NaOH или HCl. Используется только один раз.

5. Барбиталовый буфер рН 8,6 для приготовления геля: буферный раствор для заполнения электродных камер (рН 8,6) разводят в 5 раз дистиллированной водой.

6. Агароза.

7. Гель: 0,5 г агарозы расплавляют на кипящей водяной бане в 50 мл буферного раствора. Лучше готовить гель перед употреблением.

Специальное оборудование.

С 1 по 8 то же, что в методе встречного иммуноэлектроосмофореза.

9. Прибор для электрофореза. Электродные камеры прибора должны иметь объем не менее 600 мл каждая.

Ход определения. Такой же, как в методе встречного иммуноэлектроосмофореза, за исключением времени работы прибора: в методе прерывистого иммуноэлектроосмофореза оно сокращается до 1 часа - 1 часа 15 минут.

Оценка результатов. Такая же, как в методе встречного иммуноэлектроосмофореза.

Примечание:

1. Встречный иммуноэлектроосмофорез и прерывистый встречный иммуноэлектроосмофорез менее специфичны, чем метод двойной диффузии в геле, поэтому они используются как отборочные методы при необходимости получения быстрого ответа.

Сыворотки, давшие в этих методах положительный результат, целесообразно идентифицировать методом двойной диффузии в геле.

2. Метод двойной диффузии в геле специфичен, но недостаточно чувствителен; поэтому получение отрицательных результатов исследования не исключает наличия вирусного гепатита В.

3. Поверхностный антиген вирусного гепатита В описанными методами можно определять и в других биологических жидкостях.

Приложение к методам 4.1.

Способы очистки агара

1. Готовят гель агара на дистиллированной воде (2 г агара расплавляют на кипящей водяной бане в 100 мл дистиллированной воды), в горячем виде центрифугируют при 1500 об/мин. 15 - 20 минут, затем застывший столбик геля извлекают из центрифужного стакана, отсекают прилегающий ко дну мутный слой, а оставшийся прозрачный гель используют для приготовления геля для постановки реакций.

2. Сухой агар помещают в марлевый мешок и отмывают в проточной теплой водопроводной воде 2 - 3 часа, после чего высушивают его при 60°С - 80°С. 1 г высушенного агара расплавляют на кипящей водяной бане в 100 мл дистиллированной воды и фильтруют в горячем виде через фильтр для бактериологических препаратов "Ф-140" с дополнительной прокладкой под асбестовой пластиной 3 - 4 слоев фильтровальной бумаги. Во избежание застывания агара во время фильтрования целесообразно корпус фильтра оборудовать обогревом. Профильтрованный агар высушивают лиофильно. Если это невозможно, готовят агаровый гель не на дистиллированной воде, а на физиологическом растворе или на буфере и после фильтрования разливают по пробиркам или флаконам и хранят в холодильнике не более недели.

Литература

Наставление по применению иммунодиагностикума на антиген гепатита В и антител к нему, утвержденное Комитетом вакцин и сывороток МЗ СССР 19 октября 1977 г.

Исследование крови доноров на антиген гепатита В. Методические рекомендации, утвержденные ГУЛПП МЗ СССР 11 июля 1974 г.

Иммунохимический анализ. Под ред. Л.А.Зильбера. Изд. Медицина, М., 1968.

4.2. Определение иммуноглобулинов методом простой радиальной иммунодиффузии в геле

Принцип. Иммуноглобулин исследуемой сыворотки реагирует со специфической антисывороткой, равномерно распределенной в агаре, образуя кольцо преципитации, площадь которого прямо пропорциональна концентрации иммуноглобулина.

Реагенты.

1. 5,5-Диэтилбарбитуровая кислота (веронал).

2. 5,5-Диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал).

3. Барбиталовый буфер (мединал-вероналовый), 0,2 моль/л, рН 8,6. 5,52 г веронала растворяют при нагревании в 300 мл дистиллированной воды, добавляют 35,04 г мединала и после его растворения доводят дистиллированной водой до 1 литра.

4. Мертиолат, 10 г/л раствора.

5. Агар. Используется агар Дифко, Феррак или советский дальневосточный особой очистки.

6. Агаровый гель. В зависимости от качества агара опытным путем подбирают минимальную концентрацию в геле: лунки в агаровом геле должны пробиваться легко, и при этом в них не должна накапливаться жидкость. 1 - 3 г (в зависимости от качества агара) помещают в мерную посуду на 100 мл и 2 - 3 раза промывают дистиллированной водой, осторожно сливая воду. После промывки приливают к агару 50 мл воды и расплавляют на кипящей водяной бане до получения однородного раствора, что проверяется просматриванием на просвет. К расплавленному агару добавляют 2 мл раствора мертиолата (в качестве антисептика) и доводят до 100 мл барбиталовым буфером. Разливают в пробирки по 10 - 12 мл и закрывают резиновыми пробками. Хранят в холодильнике при 4°С не более месяца.

7. Антисыворотки для количественного определения иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле. Выпускаются НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР, Горьковским институтом эпидемиологии и микробиологии и Московским НИИ вакцин и сывороток им. И.Н.Мечникова МЗ СССР. Рабочее разведение сыворотки указано в инструкции.

8. Стандартная сыворотка с известным содержанием иммуноглобулинов для построения калибровочной кривой. Разводят, как указано в инструкции. Разведенная стандартная сыворотка стабильна при хранении в холодильнике не более 7 дней. Для рационального использования стандартной сыворотки ее следует разлить дробными порциями (для однократного использования) и хранить при -30°С.

9. Уксусная кислота ледяная.

10. Амидо черный 10Б.

11. Раствор амидо черного 10Б. 1 г амидо черного, 100 мл ледяной уксусной кислоты, дистиллированной воды до 1 л. Через 12 часов краску фильтруют через бумажный фильтр.

12. Раствор для отмывания краски. К 70 мл ледяной уксусной кислоты добавить дистиллированной воды до 1 л.

13. Натрий хлористый, 9 г/л раствора.

Специальное оборудование. 1. Стеклянные пластинки 9 х 12 см (можно использовать отмытые фотопластинки).

2. П-образная рамка, толщиной 1 мм (может быть изготовлена из плексигласа).

3. Зажимы.

4. Микрошприц на 2 - 3 мкл.

5. Штампы или отдельные пробойники.

6. Полая игла или трубка, диаметром 1 - 1,5 мм, для удаления агаровых пробок из лунок.

7. Измеритель.

8. Штангенциркуль или любой другой прибор, где есть шкала с нониусом, для измерения диаметра колец преципитации с точностью до 0,1 мм.

9. Водяной термостат на 56°С.

10. Уровень.

11. Влажная камера.

Ход определения. Между двумя тщательно обезжиренными стеклянными пластинками устанавливают П-образную рамку и всю систему скрепляют зажимами. Антисыворотку разводят барбиталовым буфером до концентрации, вдвое крепче рабочего разведения, и смешивают с равным объемом раплавленного и охлажденного до 56°С агара. Эту смесь в количестве примерно 8 - 10 мл на каждую пластинку вливают в пространство между пластинками, держа их под углом, чтобы в агар не попали пузырьки воздуха. Оставляют стоять на 10 мин. при комнатной температуре. После застывания агара снимают зажимы, одну пластинку и рамку. В агаре штампом или отдельным пробойником по трафарету делают лунки, диаметром 2 мм, на расстоянии 20 мм друг от друга.

После этого готовят разведения стандартной сыворотки, меняя пипетки после каждого разведения.

В лунки микрошприцем вносят по 2 мкл каждого разведения стандарта или исследуемой сыворотки. Пластинки помещают во влажную камеру и инкубируют в строго горизонтальном положении при 4°С в течение 24 часа (для IgA и IgG) или 48 часов (для IgM). Через указанный срок (точно) пластинки вынимают из влажной камеры, погружают в раствор NaCl и отмывают от непрореагировавших белков в течение 2 суток с 3-кратной сменой раствора. Затем пластинки сушат под фильтровальной бумагой, окрашивают раствором амидо черного в течение 10 - 15 минут и отмывают от избытка краски раствором уксусной кислоты, меняя его до тех пор, пока он не станет бесцветным.

Оценка результатов возможна и в неокрашенных препаратах. В этом случае пластинки после инкубации во влажной камере помещают на 1 - 2 часа в раствор NaCl и просматривают их на темном фоне с косым освещением.

Диаметр кольца преципитации измеряют чертежным измерителем и это расстояние определяют с точностью до 0,1 мм по шкале с нониусом (например, штангенциркулем).

Расчет результатов. Измеряют диаметр колец преципитации исследуемых сывороток и по калибровочной кривой находят концентрацию иммуноглобулинов. Результаты должны быть выражены в международных единицах.

Построение калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят для каждой пластинки. Для этого в четыре лунки вносят по 2 мкл (так же, как и исследуемую сыворотку) разведений стандартной сыворотки: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. После инкубации измеряют диаметр колец и строят кривую на полулогарифмической бумаге, откладывая на оси ординат известную концентрацию иммуноглобулинов, а на оси абсцисс - диаметр кольца преципитации. Полученные четыре точки должны иметь линейную зависимость, т.е. располагаться по прямой линии.

Источники ошибок.

1) Для предотвращения протеолитического расщепления иммуноглобулинов сыворотки и сывороточные препараты для исследования методом радиальной иммунодиффузии должны использоваться свежими или хранившимися при -15 - 30°С.

2) Наличие в исследуемой сыворотке парапротеинов или низкомолекулярного (7S) IgM приводит к получению ложных результатов.

3) Если результат не укладывается в пределы значений стандартной сыворотки, то исследуемую сыворотку разводят и исследуют повторно.

Оценка аналитической надежности метода.

Воспроизводимость:

в серии:

              IgA x = 109,2          V = 3,5%

     n = 20   IgG x = 116,0          V = 4,2%

              IgM x = 70,0           V = 8,0%

изо дня в день:

              IgA x = 80,2          V = 8,4%

     n = 20   IgG x = 102,0         V = 7,1%

              IgM x = 68,7          V = 8,9%

Литература

Чернохвостова Е.В., Герман Г.П., Гольдерман С.Я. Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле. Методические указания, М., 1975.

Heremans J., Masson P. - Clin. Chem., 1973, 19, 3, 294-300.

Mancini G., Сarbonara A., Heremans J. - Immunochem., 1965, 2, 3, 235-254.

<< Приложение 1. Перечень унифицированных методов клинических лабораторных исследований
	Содержание Приказ Минздрава СССР от 21 ноября 1979 г. N 1175 "Об унификации клинических лабораторных методов исследования"

Приложение 2. Методические указания по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас