Приложение 7.5 (справочное). Бактериологический метод контроля эффективности работы парового стерилизатора (Извлечение из "Методических указаний по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов" 1991 г. (N 15/6-5 Минздрава СССР)

Приложение 7.5

(справочное)

Бактериологический метод контроля эффективности работы парового стерилизатора
(Извлечение из "Методических указаний по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов" 1991 г. (N 15/6-5 Минздрава СССР)

1. Бактериологический контроль работы стерилизаторов проводят после монтажа и ремонта аппаратуры, а также в процессе его эксплуатации (плановый - 2 раза в год и при получении неудовлетворительных результатов контроля).

Контроль эффективности работы стерилизаторов осуществляют бактериологическим методом, используя биотесты на основании гибели спор тест-культуры.

Биотесты представляют собой флаконы из стеклянной трубки для лекарственных средств ФИ/1-5 НС 1 ТУ64-0709-10-88 (инсулиновые флаконы) или чашечки из алюминиевой фольги (диск размером 14 мм с луночкой - вдавливание от неоточенного края карандаша), содержащие высушенные споры тест-культуры Вас. stearothermophilus ВКМ В-718, помещенные в пакеты из упаковочной бумаги (ОСТ 42-21-2-85). Упакованные тесты нумеруют и размещают в контрольные точки паровых стерилизаторов (5 - 10 тестов). По окончании стерилизации биотесты подвергают бактериологическому исследованию.

2. Штамм Вас. stearothermophilus ВКМ В-718 подвижная термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно, культивируется при температуре 55+-1°С, исключающей развитие других широко распространенных микроорганизмов. Споры овальные, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (рН 7,3+-0,1) через 24 часа образует помутнение среды, на мясо-пептонном агаре (рН 7,3+-0,1) - слабо выпуклые колонии диаметром 2 - 4 мм с ровным краем. Штамм непатогенен для человека и животных. Штамм получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов, хранится в музее культур НИИ профилактической токсикологии и дезинфекции (117246, г.Москва, Научный проезд, 18).

Приготовление биотеста

В ампулу с лиофилизированной культурой вносят 0,2 мл стерильной водопроводной воды и оставляют в течение 30 минут при комнатной температуре.

Одну-две капли культур засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ, Хоттингера, питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную бульонную культуру засевают в пробирки на скошенный агар (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельнопептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55°С в течений 10 - 12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80 - 90% спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. В целях освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают на водяной бане при температуре 65 - 70°С в течение 30 мин, центрифугируют трехкратно с частотой вращения 33, 33с-1 (2000 об/мин) по 15 минут, промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2 года).

Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки.

Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии десятикратно разводят до 10(-7) стерильной дистиллированной водой, высевая на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл ориентировочно из 10(-5) - 10(-7) (предел разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение 48 часов, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Пример расчетов. Предположим, что при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1:100000 (10(-5)), подсчитано 140, 110, 134 колонии. Аналогичные высевы из разведений 10(-6) привели к образованию 12, 14 и 16 колоний; из 10(-7) - 5, 3 и 7 колоний. Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний для каждого разведения 128, 14 и 5.

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем титр жизнеспособности спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:

28 х 10 х 10(5) = 12,8 х 10(7); 14 х 10 х 10(6) = 14,0 х 10(7); 5 х 10 х 10(7) = 50,0 х 10(7).

Таким образом, титр исходной суспензии составит:

(12,8 + 14,0 + 50,0) х 10(7):3 = 2,5 х 10(8) спор в 1 мл.

Исходная суспензия должна содержать не менее 2,5 х 10(7) - 2,5 х 10(8) спор в 1 мл. Споры с количестве 5 х 10(5) - 5 х 10(6) вносят из исходной суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) в 0,02 мл в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки Петри), подсушивают в термостате при 37°С или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 часов.

Для определения фактической обсемененности исследуют не менее 3-х биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги, отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10 мл) и встряхивают в течение 10 минут на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл суспензии из трех последовательных десятикратных разведений.

3. Определение устойчивости спор тест-культур к воздействию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре 120 +-2°С.

Биотесты в упаковочной бумаге помешают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере 0,11 +-0,01 МПа (1,1 +-0,1 кгс/см2) проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 минут при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от 0,01 до 0,02 МПа (от 0,1 до 0,2 кгс/мс2). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до 0,11 +-0,01 МПа (1,1 +-0,1 кгс/см2) температура 120 +-2°С и через 5 минут (времени выживания спор тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 мин, спуск - в течение 3 мин.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 мин выдержки (время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование.

Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

4. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный тест (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55°С в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки, из проросших емкостей.

При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (рН 7,7+-0,1) на желто-оранжевый (рН 6,7+-0,1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты. В целях исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (N 7,5; 12,5).

Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения. При наличии роста тест-штаммов проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов. Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста тест-культур в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации) устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры, несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред, условий культивирования).

5. Для спорообразования используют:

- картофельно-пептонный агар (пептон - 5,0 мел - 1,0 агар - 25,0 картофельная вода - 1000 мл.), рН 7,1+-0,1. Сырой картофель (200 г очищенного картофеля на 1 л водопроводной воды) тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 мин после закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят объем фильтрата до первоначального. Устанавливают рН 7,1+_0,1. Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. После стерилизации среду во флаконе скашивают;

- пшеничный агар (пшеничная крупа "Артек" или "Полтавская" - 500,0, агар - 25,0, дистиллированная вода - 1000 мл), рН 7,3+-0,1.

Пшеничную крупу "Артек" ("Полтавская") заливают дистиллированной водой. Через 12 часов аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 час). Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают рН 7,3+-0,1. Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 часу в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.

6. Для контроля используют бульон Хоттингера рН 7,3+-0,1, агар Хоттингера рН 7,3+_0,1, питательный бульон сухой рН 7,1+-0,1, (Дагестанский НИИ питательных сред), питательный агар сухой рН 7,3+-0,1 (Дагестанский НИИ питательных сред), среду питательную для контроля стерильности сухую (предприятие Центрального НИИВС им. И.М.Мечникова) рН 7,0+-0,1, бульон из перевара кровяных сгустков, полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным рН 7,7+-0,1 (аммоний фосфорно-кислый однозамещенный - NH4H2PO4 - 1,0 г; магний серно-кислый MgSO4 - 0,2 г, калий хлористый KCl - 0,2 г, глюкоза - 5,0 г, феноловый красный - 0,02 г, бульон Хоттингера с содержанием аминного азота - 140 - 160 мг% - 200 мл, дистиллированная вода - 800 мл, рН 7,7+-0,1. Компоненты смешивают и растворяют при нагревании на водяной бане, доводят рН до 7,7+-0,1, разливают во флаконы, стерилизуют при 110°С в течение 30 мин).