Методические указания МУК 4.2.1007-00 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента Биовита и хлортетрациклина Streptomyces aurefaciens 777 в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 декабря 2000 г.)

4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы
Методические указания МУК 4.2.1007-00
"Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента Биовита и хлортетрациклина Streptomyces aurefaciens 777 в воздухе рабочей зоны"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 декабря 2000 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Общие положения и область применения

ГАРАНТ:

См. Методические указания МУК 4.2.1005-00 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента Биовита и хлортетрациклина Streptomyces aurefaciens 777 в атмосферном воздухе населенных мест" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 декабря 2000 г.)

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента Биовита и хлортетрациклина Streptomyces aurefaciens 777 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Str. aurefaciens 777 в воздухе производственных помещений биотехнологических производств и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТа 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТа 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий научно-исследовательских институтов, работающих в области промышленной гигиены.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

2. Биологическая характеристика штамма-продуцента Streptomyces aurefaciens 777 и его гигиенический норматив

Продуцент Биовита и хлортетрациклина - Streptomyces aurefaciens 777 относится к актиномицетам, является облигатным аэробом. Период развития характерных колоний составляет 10 - 12 суток. Оптимальная температура роста - 28 - 30°С.

На агаризованной среде СР-12 дает колонии с обильным воздушным мицелием серого цвета, выделяющие в среду темно-коричневый пигмент. Гифы мицелия утолщены, сильно ветвящиеся. Колонии плоские, слабоскладчатые с глубоким кратером в центре.

Предельно допустимая концентрация Streptomyces aurefaciens 777 в воздухе рабочей зоны - 5х10(3) кл/м3, пометка А, 3 класс опасности.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента Биовита в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 м3 при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод измерения концентрации штамма-продуцента Streptomyces aurefaciens 777 основан на аспирации аппаратом Кротова микробных клеток (спор, обрывков мицелия) на поверхность плотной питательной среды СР-12 и подсчета выросших колоний, которые выявляются при задержке роста тест-культуры (Bacillus subtilis), происходящего вследствие диффузии в агар антибиотика хлортетрациклина, выделяемого штаммом-продуцентом Streptomyces aurefaciens 777.

При данном методе на чашке Петри после забора пробы может быть учтено до 50 колоний, т.к. большее количество колоний на чашке могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что приводит к занижению результатов.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

 Прибор для бактериологического анализа воздуха,     ТУ 64-12791-77

 модель 818 (щелевой прибор Кротова)

 Термостаты  электрические   суховоздушные   или

 водяные

 Автоклав электрический                               ГОСТ 9586-75

 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

 Холодильник бытовой

 Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

 Микроскоп биологический с иммерсионной системой

 типа "Биолам" Л-211

 Водяная баня или водяной термостат

 Газовая горелка или спиртовка лабораторная

 Чашки Петри

 Петли бактериологические

 Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл       ГОСТ 10515-75

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10515-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                       ГОСТ 10515-75

 Пипетки мерные на 1, 5, и 10 мл                      ГОСТ 1770-74

 Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл           ГОСТ 1770-74

 Секундомер                                           ГОСТ 9586-75

 Барометр                                             ГОСТ 246 96-79

 Марля медицинская                                    ГОСТ 9412-77

 Вата медицинская гигроскопическая                    ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

 Среда CP-12,  агаризованная  питательная  среда

 для продуцента Виовита

 Агаризованная среда Хоттингера, рН 6,8-7,0

 Спирт этиловый ректификат                            ГОСТ 5962-67

 Хлороформ

 Тетрациклина гидрохлорид

 Амфотерицин В для внутривенного введения

Тест-культура Вас. subtilis вариант Л_2 музейный штамм, споры хранят в виде водной суспензии при температуре 4°С.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента Биовита и хлортетрациклина в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТом 12.1.005-88.

- Правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

- Требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980).

- Положения инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (1977).

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях в соответствии с ГОСТом 15150-69 при температуре воздуха 20+-5°С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации Streptomyces aurefaciens 777 воздух производственных помещений аспирируют со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды СР-12 в чашку Петри, помещенную в аппарат Кротова.

Аппарат Кротова перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. На подвижной диск устанавливают чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку прибора закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают крышку прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. В период отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или других стерильных емкостях.

Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора.

9.2. Выполнение анализа

Агаризованную среду СР-12 расплавляют и остужают до 50 - 60°С. Затем добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг на 1 л среды для подавления посторонней воздушной грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 10 мл. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при 37°С на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.

После отбора проб воздуха на чашки Петри в аппарате Кротова их помещают в термостат при температуре 28 - 30°С на 48 часов.

После инкубации чашки помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю поверхность наливают 1,5 мл хлороформа, чашку с посевом вверх донышком вставляют в крышку так, чтобы выросшие колонии бактерий находились в парах хлороформа не менее 20 - 30 минут. Затем каждую чашку вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова закрывают крышками и переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на 2 часа при комнатной температуре для преддиффузии.

Затем чашки Петри заливают 5 мл агаризованной среды Хоттингера с тест-культурой Вас. subtilis вар. Л2 из расчета 3х10(7) споровых клеток на 1 мл среды (Государственная фармакопея СССР. - Вып. XI, 1989. - 206 с.)

Чашки Петри с застывшей средой Хоттингера донышком вверх помещают в термостат при 37°С на сутки. По окончании инкубации, т.е. через 3 суток после отбора пробы воздуха производят подсчет зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу проросших клеток штамма-продуцента Streptomyces aurefaciens 777. Учитывают зоны диаметром не менее 5 мм.

10. Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации микробных клеток Streptomyces aurefaciens 777 в 1 м3 воздуха производят по формуле:

               П х 1000

          X = ----------, где

               Т х B

        Х - количество микробных клеток в воздухе (1 м3);

        П - число зон задержки раста тест-культуры, что соответствует  числу

            колоний, выросших на чашке Петри;

        Т - время забора пробы воздуха, мин;

        В - скорость подачи воздуха, л/мин;

     1000 - коэффициент перевода 1 л в 1 м3.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

     Протокол N

     количественного   микробиологического   анализа    штамма-продуцента

     Streptomyces aurefaciens 777 в воздухе рабочей зоны.

     1. Дата проведения анализа ______________________

     2. Место отбора пробы  __________________________

     3. Название лаборатории  ________________________

     4. Юридический адрес организации ________________

                 "Результаты микробиологического анализа"

Шифр или N пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл/м3

     Ответственный исполнитель

     Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности, М. - 1980. - 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности, М. - 1977. - 7 с.

5. Государственная фармакопея СССР, 1989. - Вып. XI. - 206 с.

Главный государственный санитарный врач РФ - Первый заместитель министра здравоохранения РФ

Г.Г. Онищенко