Методические указания МУК 4.2.1008-00 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина В_12 в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 декабря 2000 г.)

4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы
Методические указания МУК 4.2.1008-00
"Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина В_12 в воздухе рабочей зоны"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 21 декабря 2000 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина В_12 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТа Р8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

2. Характеристика штамма-продуцента витамина B_12

Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 является продуцентом витамина В. Штамм растет на агаризованных средах на основе мелассы при температуре 28°С. B_12 течение 3-х суток образует округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45 - 0,85х0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М, рисгтомицину, цефалотину и эритромицину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл/м3.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток продуцента витамина В_12 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В_12 на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

 Прибор для  бактериологического  анализа  воздуха,     ТУ 64-12791-77

 модель 818 (щелевой прибор Кротова)

 Термостаты электрические суховоздушные или водяные

 Автоклав электрический                                 ГОСТ 9586-75

 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

 Холодильник бытовой

 Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

 Микроскоп биологический  с  иммерсионной  системой

 типа "Биолам" Л-211

 Лупа с увеличением х10                                 ГОСТ 25706-83

 Чашка   Петри   бактериологические   плоскодонные,

 стеклянные, диаметром 100 мм

 Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл         ГОСТ 10515-75

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10515-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                         ГОСТ 10515-75

 Пипетки мерные на 1, 5, и 10 мл                        ГОСТ 1770-74

 Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл             ГОСТ 1770-74

 Секундомер                                             ГОСТ 9586-75

 Барометр                                               ГОСТ 246 96-79

 Марля медицинская                                      ГОСТ 9412-77

 Вата медицинская гигроскопическая                      ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: левомицитин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.

 Спирт этиловый ректификат                              ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента.

Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH4)2HPO4 - 1,3 г; MgSO4 7H2O - 1,0 г; (NH4)2SO4 - 0,5 г; MnSO4H2O - 0,1 г; ZnSO4H2O - 0,1 г; агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 - 7,0; стерилизация 121°С, 30 минут.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента витамина В_12 в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20+-5°С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента витамина В_12 воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60°С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицитин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28°С. Через 48 - 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:

          N x 1000

     Х = -----------, кл/м3,

             V

 где:

        Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

        N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

     1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

        V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 см2.

Составляем пропорцию:

на 100 см2 за 1 мин оседает 2 л воздуха

на 78,54 см2 - Х л

Х = 1,57 л/мин

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха

Надо определить количество клеток в 1 м3 воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57 x Тл.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток-спор, обрывков мицелия), а в 1 м3 воздуха содержится -

     N х 1000     N x 636,9

     --------- = -----------

     1,57 х Т         T

Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м3 воздуха содержится

     12 x 636,9

     ---------- = 253 клетки

         30

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 в воздухе рабочей зоны. Дата проведения анализа ____________________ Место отбора пробы ________________________ Название лаборатории _______________________ Юридический адрес организации _______________

"Результаты микробиологического анализа"

Шифр или N пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл/м3

     Ответственный исполнитель

     Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1. 005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности, М. - 1980. - 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности, М. - 1977. - 7 с.

Главный государственный санитарный врач РФ - Первый заместитель министра здравоохранения РФ

Г.Г.Онищенко