Методические рекомендации "Исследование наркотических средств с предварительной пробоподготовкой методом твердофазной экстракции" (утв. на заседании Постоянного комитета по контролю наркотиков 25 августа 1995 г., протокол N 40)

Методические рекомендации *
"Исследование наркотических средств с предварительной пробоподготовкой методом твердофазной экстракции"
(утв. ПККН, протокол от 25 августа 1995 г. N 40)

Введение

В экспертной практике в роли объектов исследования часто выступают наркотические и сильнодействующие средства, которые крайне редко являются индивидуальными соединениями. Наибольшие сложности возникают при исследовании наркотических и сильнодействующих средств, представляющих собой многокомпонентные системы, смеси, содержащие большое количество примесных и балластных веществ, высокоактивные наркотические средства, присутствующие в смесях в очень низких концентрациях, предметы-носители, содержащие следовые количества вещества.

Трудности, возникающие при исследовании таких объектов, обусловлены следующими причинами: сложность препаративного разделения многокомпонентных систем, очистки от балластных веществ и примесей традиционными методами (например, экстракцией в системе жидкость-жидкость), а также сложность концентрирования разбавленных растворов. Все это приводит к ограничению возможностей применения хроматографических и спектральных методов при дальнейшем исследовании и, следовательно, затрудняет идентификацию вещества.

Как показывает практика, решение такого рода проблем возможно при применении на стадии пробоподготовки метода твердофазной экстракции, позволяющего осуществлять одновременное разделение, выделение и концентрирование целевых компонентов. Такой подход дает возможность получения веществ в чистом виде, что в дальнейшем позволяет проводить идентификацию методами ИК- и УФ-спектроскопии, не требующими наличия образцов сравнения. Кроме того, использование твердофазной экстракции расширяет пределы применения методов тонкослойной и газовой хроматографии. В пользу твердофазной экстракции как способа подготовки образцов свидетельствуют также литературные данные *(1) и предварительные эксперименты, проведенные в ЭКЦ МВД России.

Пробоподготовка осуществляется с помощью патронов, заполненных силикагелем или модифицированными сорбентами на его основе. Подбор и варьирование типов патронов, а также применение различных растворителей в качестве элюентов дает возможность проводить одновременно процессы разделения, выделения, очистки и концентрирования веществ с высокой скоростью и эффективностью.

В настоящее время существуют отработанные методики очистки наркотических средств методом твердофазной экстракции с целью дальнейшего их исследования хроматографическими методами *(2). Необходимые для этих целей патроны широкого ассортимента (например, Диапак) уже выпускаются в России.

Высокая эффективность выпускаемых патронов позволяет использовать их для пробоподготовки широкого круга объектов - от лекарственных препаратов сложного состава до "уличных наркотиков" и биологических жидкостей (моча, кровь, сыворотка и т.д.), а также экстрактов биологических жидкостей.

Основные проблемы пробоподготовки при исследовании наркотических и сильнодействующих средств

Целью многих экспертиз и исследований, проводимых в экспертно-криминалистических подразделениях органов внутренних дел, часто является решение вопроса о принадлежности того или иного объекта к наркотическому или сильнодействующему средству. Нередко объектами исследования являются поступающие из незаконного оборота синтетические наркотические средства, которые производятся в подпольных лабораториях, например метадон, 3-метилфентанил, 3,4-метилендиоксиамфетамин (МДА), 3,4-метилендиоксиметамфетамин (МДМА), фенциклидин (РСР). Лекарственные и наркотические средства, поступающие на исследование, в подавляющем большинстве случаев имеют в своем составе различные наполнители и добавки (сахар, соль жирных кислот, крахмал, сода, тальк и др.).

Чаще других на экспертизу поступают лекарственные и наркотические средства в виде порошков, таблеток, растворов, свечей, а также предметы-носители, содержащие следовые количества вещества. Предварительный осмотр в таких случаях почти не дает полезной информации из-за отсутствия у объектов каких-либо внешних индивидуализирующих признаков. Поэтому исследование подобных объектов заключается в выделении целевых компонентов и их последующей идентификации инструментальными или неинструментальными методами.

На стадии выделения целевых компонентов часто возникают некоторые сложности, например:

- наркотические и лекарственные средства очень редко представляют собой индивидуальные вещества, поскольку чаще всего являются многокомпонентными системами либо содержат загрязнения или промежуточные и побочные продукты синтеза; при этом разделение, выделение и очистка целевых компонентов традиционными методами (например, жидкостной экстракцией) неэффективны, а иногда просто невозможны;

- высокоактивные наркотические средства обычно представляют собой растворы, содержание в которых наркотически активного компонента крайне низко, поэтому для его обнаружения и идентификации необходимо концентрирование; использование для этого обычных методов часто не позволяет добиться желаемого результата.

Таким образом, применение общепринятых способов пробоподготовки в большинстве случаев не обеспечивает возможности получения необходимого количества веществ, обладающих чистотой, достаточной для дальнейшего исследования методами ПК- и УФ-спектроскопии.

Идентификация перечисленных объектов, как правило, также вызывает затруднения. При применении спектроскопических методов это объясняется сильной загрязненностью пробы посторонними веществами, при использовании хроматографических методов - отсутствием необходимых образцов сравнения. Кроме того, метод хроматомасс-спектрометрии практически неприменим во многих экспертно-криминалистических подразделениях вследствие отсутствия приборной базы. Таким образом, из перечисленных инструментальных методов идентификации наркотических и сильнодействующих средств особое значение имеет спектроскопия (прежде всего, молекулярная), поскольку соответствующим оборудованием оснащены практически все ЭКП. Кроме того, ИК-спектроскопия может применяться для анализа широкого круга объектов *(3) без использования образцов сравнения, так как поиск в данном случае осуществляется по имеющимся компьютерным базам данных или по атласам спектров.

Из сказанного очевидно, что при исследовании наркотических и лекарственных средств сложного состава необходимо применение такого метода пробоподготовки, который бы позволил осуществлять разделение многокомпонентных смесей, выделение и концентрирование целевых компонентов и обеспечивал возможность их последующей идентификации с помощью ИК-спектроскопии.

Решение изложенных проблем возможно при использовании на стадии пробоподготовки метода твердофазной экстракции.

Так, многие из указанных образцов исследовались в ЭКЦ МВД России, и идентификация их традиционными методами вызвала определенные трудности. Применение твердофазной экстракции позволило легко решить эти задачи.

При отработке методики в качестве объектов исследования использовались следующие вещества:

1. Образцы наркотических средств, изымаемых из незаконного оборота:

метадон в ампулах в виде водного раствора в смеси с димедролом;

3,4-метилендиоксиамфетамин (МДА) в таблетках;

фенциклидин;

смесь анальгин-дионин-папаверин;

метаквалон в таблетках;

кокаин, содержащий в качестве добавок сахара и лидокаин;

2. Лекарственные средства:

содержащие сахара:

норфин, представляющий собой водный раствор бупренорфина;

кодеина фосфат в виде сиропа;

различные формы трамала, содержащие сильнодействующее вещество трамадол (капсулы, ампулы):

солутан, содержащий эфедрин;

барбамил, содержащий амитал натрия;

этаминал натрия в виде таблеток;

оксазепам в таблетках (тазепам).

3. Экстракты биологических объектов, содержащие кетамин.

Твердофазная экстракция как метод пробоподготовки

В основе метода твердофазной экстракции лежит принцип колоночной хроматографии, который основан на специфическом взаимодействии распределенных в матрице компонентов с твердой фазой. Матрица представляет собой газообразную или жидкую среду, в которой растворяется исследуемый объект, а твердая фаза - специальный сорбент, заключенный между двумя пористыми фильтрами, находящимися на входе и выходе патрона, выполненного из инертного материала.

В качестве сорбента применяются силикагель и продукты его модификации. Для модификации используются вещества, содержащие различные функциональные (нитрильные, диольные, амино-, карбокси- и сульфогруппы), а также алифатические (С_1 - С_18) и ароматические (фенильные) группы.

В зависимости от применяемых для модификации сорбента веществ существуют различные типы патронов для твердофазной экстракции (ТФЭ). В табл. 1 приведены типы патронов, а также "степень извлечения", характеризующая необратимую сорбцию веществ на патроне, особенно важная для работы с микроколичествами определяемых веществ. Области применения патронов и используемые при этом растворители *(4) приведены в табл. 2.

Процесс твердофазной экстракции заключается в сорбции исследуемого вещества и примесей, содержащихся в матрице, на сорбенте. Разделение при этом происходит за счет различного сродства компонентов разделяемого раствора к сорбенту и элюирующему растворителю, а также благодаря возможности использования ступенчатого элюирования. Сорбированные компоненты смываются растворителями, отличными по полярности от матрицы.

Таблица 1

Основные типы патронов Диапак

Тип патрона	Краткая характеристика сорбента	Степень извлечения кокаина
Диапак Силикагель	Гидрофильный слабокислотный сорбент	0,80
Диапак С_1	Гидрофобный сорбент с привитыми углеводородными группами	-
Диапак С_8	Более гидрофобный, чем Диапак С_1	-
Диапак С_16	Более гидрофобный, чем Диапак С_8	0,66
Диапак Фенил	Гидрофобный сорбент с привитыми фенильными группами	-
Диапак Нитрил	Слабогидрофобный сорбент с привитыми нитрильными группами	-
Диапак Диол	Гидрофильный нейтральный сорбент с привитыми диольными группами	-
Диапак Амин	Слабоосновный анионообменник с привитыми аминогруппами	-
Диапак ДЕАЕ	Слабоосновный анионообменник с привитыми третичными аминогруппами	-
Диапак ТА	Сильноосновный анионообменник с привитыми четвертичными аммонийными группами
Диапак Карбокси	Слабокислотный карбоксильный катионообменник	-
Диапак Сульфо	Сильнокислотный катионообменник	-
Диапак ИДК	Комплексообразующий сорбент с привитой иминодиуксусной кислотой	-

Таблица 2

Общие сведения о патронах для твердофазной экстракции

Тип патрона	Вид экстракции	Матрица	Типичные растворители	Исследуемые объекты
C_1, C_8, C_16, Фенил, Нитрил	Обращенно- фазовая	Вода, биологические жидкости	Метанол, ацетонитрил, этилацетат	Наркотики, пептиды, пестициды
Нитрил, Диол, Силикагель	Адсорбционная	Гексан, масла, хлороформ	Метанол, изопропанол, ацетон	Метаболиты, фенолы, витамины
Карбокси, Сульфо	Катионо- обменная	Вода, кислые буферы, биологические жидкости	Основные буферы	Гербициды, фармпрепараты
Амин, ТА	Анионо- обменная	Вода, основные буферы, биологические жидкости	Кислые буферы	Витамины, органические кислоты, жирные кислоты

В зависимости от вида сорбента механизм разделения на патроне для твердофазной акстракции различен. Процесс очистки состоит из четырех последовательных стадий (рис. 1):

1 - кондиционирование патрона, т.е. предварительная очистка патрона от возможных загрязнений промывкой каким-либо полярным растворителем (метанолом, этилацетатом и др.) с последующим приведением патрона в рабочее состояние путем промывки матрицей;

2 - пропускание через патрон раствора исследуемого объекта в матрице с целью разделения, выделения и (или) концентрирования целевых компонентов;

3 - промывка патрона матрицей с целью повышения эффективности разделения;

4 - элюирование сорбированных компонентов.

В общем случае разделение компонентов раствора исследуемого объекта в матрице может происходить тремя различными путями:

- Примеси и все мешающие компоненты удерживаются на патроне, а определяемые проходят через него.

- Мешающие компоненты проходят через патрон, а определяемый компонент сорбируется на патроне, после чего смывается более полярным растворителем.

- Определяемые и мешающие компоненты сорбируются на патроне, после чего могут фракционироваться за счет применения ступенчатого элюирования (изменение рН, ионной силы элюирующего растворителя).

Применяя патроны с различными типами сорбентов, а также подбирая элюенты и матрицы, можно добиться степени концентрирования и степени очистки определяемого компонента, достаточных для дальнейшего исследования его методом ИК-спектроскопии.

Стадия кондиционирования патронов обязательна, поскольку все сорбенты, особенно модифицированные, изначально загрязнены. Необходимость промывки патрона перед исследованием была подтверждена в процессе предварительных экспериментов; результаты показали, что для кондиционирования патронов Диапак с сорбентами Нитрил, Фенил, Силикагель, Диол достаточно однократной промывки 2 мл метанола, а для кондиционирования патронов Диапак С_16 необходима последовательная промывка 2 мл этилацетата и 2 мл метанола. Чтобы привести патроны в рабочее состояние после кондиционирования, через них пропускают 2 мл матрицы.

Из литературы известно, что при очистке наркотических средств методом твердофазной экстракции наиболее целесообразно использовать патроны, заполненные немодифицированным силикагелем и силикагелем, модифицированным гексадецильными группами C_16 *(2). С целью подтверждения этого факта, а также для проверки эффективности отечественных патронов Диапак была проведена серия экспериментов, в ходе которых для очистки одного и того же вещества использовались различные патроны. Было выяснено, что наибольшей эффективностью обладают патроны Диапак Силикагель и Диапак С_16. В некоторых случаях оказалось целесообразным использование патронов с привитыми CN- и фенильными группами.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности твердофазной экстракции и возможности ее применения при исследовании широкого круга объектов.

По результатам выполненных экспериментов были составлены общие схемы исследования неизвестных веществ с применением твердофазной экстракции как метода пробоподготовки с последующей идентификацией методом ИК-спектроскопии (см. рис. 2).

-------------------------------------------------------------------------

Примечание.

* Если вещество полностью или частично не растворяется, то экстракты исследуют по приведенной схеме, а нерастворимый осадок исследуют отдельно другими методами.

** Идентификацию проводят после упаривания растворителя посредством прессования таблетки с КВr, снятия ИК-спектра и поиска по библиотекам спектров.

Методики исследования наркотических и сильнодействующих средств с применением на стадии пробоподготовки метода твердофазной экстракции

Рассмотрим методики пробоподготовки для так называемых "уличных наркотиков" и лекарственных препаратов, наиболее часто встречающихся в незаконном обороте на территории России. К этим методикам следует прибегать в случаях, когда имеется какое-либо подозрение на наличие в исследуемых объектах наркотических средств, перечисленных ниже.

Перед исследованием патроны для твердофазной экстракции необходимо привести в рабочее состояние.

Пропускание элюентов через патрон осуществляется с помощью шприца "Eppendorf", вставляемого в верхний патрубок патрона. Скорость прокачивания жидкости - примерно 1 капля в секунду. При использовании обычных пластмассовых медицинских шприцев необходимо проверить упаренные хлороформные и метанольные смывы с них на предмет их чистоты (отсутствие фталатов и поликарбонатов).

Метадон

Пробоподготовка при исследовании метадона включает следующие стадии: к 1 мл исследуемой жидкости добавляют 1-2 капли насыщенного водного раствора аммиака, 1 мл хлороформа, после чего смесь тщательно перемешивают и дают ей расслоиться. После расслоения отбирают нижний слой (хлороформный экстракт) и пропускают его через патрон Диапак Силикагель, предварительно очищенный описанным выше способом. Затем сорбент последовательно промывают 10 мл хлороформа и 3 мл метанола. Для дальнейшего исследования собирают последний миллилитр метанольного смыва. Такая подготовка образца позволяет избавиться от примесей и добавок (прокаин, димедрол, новокаинамид), имеющихся в исследуемом объекте.

3,4-Метилендиоксиамфетамин (МДА)

Перед исследованием таблетки, содержащей МДА, ее растирают в фарфоровой ступке, отбирают 50 мг порошка, заливают 1 мл воды, добавляют 1-2 капли водного раствора аммиака (25%) и 1 мл хлороформа. После тщательного перемешивания жидкости дают расслоиться, отбирают нижний (хлороформный) слой и пропускают отобранную жидкость через наполненный силикагелем патрон Диапак. Затем патрон последовательно промывают 2 мл хлороформа и 2 мл метанола. Собирают последние 1,5 мл метанольного смыва.

Фенциклидин

Очистку фенциклидина проводят на патроне Диапак С_16, промывка которого описана выше. Навеску образца массой 20-40 мг растворяют в дистиллированной воде при нагревании; после охлаждения пропускают через патрон. Затем сорбент промывают 4 мл дистиллированной воды и 2 мл метанола. Собирают последние 0,7 мл метанольного смыва.

Этилморфин (дионин)

Перед разделением смеси анальгин-дионин-папаверин методом ИК-спектроскопии выявляют основной компонент (которым чаще всего бывает анальгин), для чего смесь перетирают с бромидом калия, прессуют в таблетку и регистрируют ИК-спектр. После этого осуществляют разделение смеси и выделение дионина и папаверина с использованием патронов Диапак Нитрил, промытых по описанной выше методике. Для выделения папаверина часть исследуемой смеси растворяют в 2 мл воды и пропускают через сорбент. После этого патрон промывают 4 мл воды и 2 мл метанола. Для дальнейшего исследования собирают второй миллилитр метанольного смыва, содержащий папаверин. Для выделения дионина оставшуюся часть исходной смеси растворяют в воде при нагревании; после охлаждения добавляют каплю аммиака и 1 мл хлороформа. Жидкость встряхивают, дают расслоиться, отбирают хлороформный экстракт (нижний слой) и пропускают его через второй патрон, который затем промывают 2 мл метанола, собирая последние 0,5 мл метанольного смыва.

Кокаин

Кокаин, содержащий в качестве добавки лидокаин и маннитол, очищают на патроне Диапак C_16, предварительно промывая его, как указано выше. Навеску вещества массой 20-30 мг растворяют в горячей дистиллированной воде (при необходимости воду подкисляют). После охлаждения полученный раствор пропускают через патрон, промывают 10 мл воды, а затем 2 мл метанола. Первый миллилитр метанола отбрасывают, а следующие 0,5 мл собирают.

Метаквалон

Метаквалон в таблетках измельчают в ступке и 20-30 мг вещества растворяют в воде. Очистку производят на патроне Диапак С_16, как и в случае кокаина, отбрасывая первый миллилитр метанольного смыва и собирая следующие 0,5 мл.

Кодеин и бупренорфин

Лекарственные средства, содержащие сахара (кодеина фосфат и норфин), очищают на патронах Диапак Фенил: 2 мл исследуемого раствора, в который при необходимости уменьшения вязкости добавлена дистиллированная вода, пропускают через патрон. После этого патрон промывают последовательно 10 мл дистиллированной воды и 2 мл метанола. Собирают последний миллилитр метанольного смыва.

Трамадол

Для выделения из лекарственного средства Трамал его действующего начала (трамадола) используют патрон Диапак С_16. При исследовании капсулы 30 мг ее содержимого заливают 1 мл дистиллированной воды, доводят до кипения и охлаждают. Полученный раствор фильтруют. При исследовании трамадола в виде свечи часть ее в количестве 50 мг заливают 1,5 мл дистиллированной воды, при перемешивании доводят до кипения и охлаждают. Раствор отбирают пипеткой, стараясь не затронуть наполнитель свечи, затвердевший на поверхности. Полученный раствор, а также раствор из ампулы подвергают разделению, пропуская 1 мл раствора через патрон, после чего патрон промывают 7 мл дистиллированной воды и 1 мл метанола. Собирают последние 0,5 мл метанольного смыва.

Эфедрин

Эфедрин, содержащийся в лекарственном средстве Солутан, экстрагируют из 2 мл препарата 1 мл хлороформа, добавляя при этом каплю 25%-го водного раствора аммиака. Затем хлороформный экстракт пропускают через патрон Диапак Силикагель, который промывают после этого последовательно 4 мл хлороформа и 3 мл метанола. Последние 1,5 мл метанольного смыва собирают.

Барбамил и этаминал натрия

При исследовании лекарственных средств Барбамил и этаминал натрия таблетку растирают в ступке и 20-30 мг полученного порошка растворяют в дистиллированной воде. Разделение проводят на патроне Диапак С_16, промывая пробы 5 мл дистиллированной воды и 1 мл метанола. Первые 0,5 мл метанольного смыва отбрасывают, а последние 0,5 мл собирают.

Оксазепам

Оксазепам в таблетках растирают и растворяют в хлороформе (20-30 мг на 1 мл хлороформа); полученную смесь фильтруют. Для очистки используют патрон Диапак Нитрил, промытый 2 мл метанола и 2 мл хлороформа. Полученный хлороформный раствор пропускают через патрон, после чего патрон промывают 5-8 мл хлороформа, а затем смывают оксазепам 2 мл метанола, собирая последние 0,5 мл.

Кетамин

При исследовании водных биологических экстрактов, содержащих кетамин, к нескольким миллилитрам экстракта прибавляют каплю концентрированного аммиака и 2 мл хлороформа. После расслоения хлороформный слой отбирают и пропускают через патрон Диапак Силикагель; затем патрон промывают 10 мл хлороформа. Собирают последний миллилитр хлороформного смыва.

Полученные описанным способом метанольные смывы метадона, МДА, фенциклидина, кокаина, дионина, папаверина, бупренорфина, кодеина, трамадола, эфедрина, амитала натрия, этаминала натрия, оксазепама и хлороформный смыв кетамина исследуют методом ИК-спектроскопии. Для этого смывы переносят в агатовую ступку и упаривают досуха в сушильном шкафу при 50-60°C. Полученные остатки перетирают с бромидом калия и прессуют в таблетки, после чего регистрируют ИК-спектры веществ.

Спектры МДА можно также получить после нанесения соответствующего органического смыва на кристалл из оптического материала KRS-5 и подсушивания.

Спектры исследуемых объектов, полученные с применением различных способов пробоподготовки и записанные на приборах "Specord М 80" (фирма "Carl Zeiss Jena", Германия), "Perkin Elmer 1760X" (фирма "Perkin Elmer", США), "Impact 400" (фирма "Nicolet", США), приведены на рис. 1-9 приложения. Очевидно, что ИК-спектры, получаемые после пробоподготовки методом твердофазной экстракции, в отличие от спектров, полученных при очистке традиционными методами, могут быть использованы при идентификации компонентов исследуемых смесей.

Аналогично можно получать УФ-спектры веществ, очищенных на патронах Диапак. На рис. 10-12 приложения приведены УФ-спектры метанольного раствора смеси анальгин-папаверин-дионин, УФ-спектр метанольного смыва дионина с патрона Диапак Нитрил и УФ-спектр метанольного раствора дионина. Спектр регистрировали на приборе "UV/VIS Spectrometer Lambda 14 P" фирмы "Perkin-Elmer" (США) в диапазоне 210-340 нм.

Описанный метод твердофазной экстракции позволяет осуществлять разделение многокомпонентных смесей, а также проводить очистку веществ от примесей и (или) их концентрирование. Такие возможности метода позволяют использовать его для пробоподготовки при исследовании биологических жидкостей и их экстрактов, лекарственных и нативных наркотических средств и др. Основные преимущества метода твердофазной экстракции по сравнению с традиционными методами пробоподготовки - возможность одновременного выделения и концентрирования целевого компонента, а также значительное увеличение скорости и эффективности экстракции. Высокая степень разделения смесей и концентрирования веществ с помощью патронов для твердофазной экстракции позволяет проводить дальнейшие исследования и идентификацию методом ИК-спектроскопии, а также расширить пределы применения хроматографических методов анализа.

Разработанные методики пробоподготовки методом твердофазной экстракции позволяют проводить идентификацию наркотических средств с применением достаточно простого оборудования, широко распространенного в экспертно-криминалистических подразделениях органов внутренних дел.

Литература

1. Zief М. Sample Preparation Technology. Zymark Corp., 1982.

2. Sample Preparation Products: Applications Bibliography. Varian. USA., 1992.

3. Смит А. Прикладная ИК-спектроскопия. М., 1982.

4. Sample Preparation Products. Varian. USA., 1992.

-------------------------------------------------------------------------

* Подготовлены: А.В.Беляев, К.В.Понкратов, В.И.Сорокин, Е.П.Семкин