Приложение 2 (обязательное). Ведение эталонных культур

Приложение 2
(обязательное)

Ведение эталонных культур

Ведение эталонных культур обеспечивает максимальное сохранение типовых свойств штаммов, что достигается соблюдением принципов их культивирования, контроля и хранения.

Согласно санитарным правилам СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов III - IV групп патогенности", п.3.1.6 "Производственным предприятиям, контролирующим готовую продукцию, разрешается иметь только коллекцию типовых культур, предусмотренных нормативно-технической документацией".

Хранение культур осуществляется в соответствии с п.3.2.12 СП 1.2.036-95. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами III - IV групп патогенности.

1. Ведение бактериальных культур аэробов и факультативных анаэробов

Основные положения

В качестве контрольных тест-штаммов используют эталонные культуры, полученные из официально признанной коллекции микроорганизмов (п.4.5).

Хранение запасов рабочей культуры осуществляется в столбике полужидкого агара, срок хранения 3 мес.

Для целевого использования пригодна суточная ("ночная") культура эталонного штамма, прошедшая не более 2 пассажей на питательных средах, с момента высева со среды для хранения запасов рабочей культуры.

Восполнение запасов рабочей культуры допускается не более трех раз. В этой связи срок использования эталонной культуры с момента вскрытия ампулы - 1 год.

На этапах восстановления из лиофилизированного состояния и восполнения запасов рабочих культур осуществляется контроль сохранения видовых и паспортных свойств тест-культуры.

Культура с измененными свойствами в анализе не используется.

По истечении года необходимо получить новую лиофилизированную эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.

Процедура ведения культуры включает следующие этапы:

- восстановление лиофилизированной культуры;

- создание и хранение запасов рабочей культуры;

- восполнение запасов рабочей культуры;

- подготовка культуры для целевого использования в анализе;

- контроль видовых и паспортных свойств.

1.1. Восстановление лиофилизированной эталонной культуры

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят приблизительно 0,5 мл питательного бульона (п.5.2.1) для регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при (37 +- 1)°С в течение 18 - 24 ч.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар в две пробирки (п.5.3.1).

При восстановлении штамма E. coli K12F(+) Str(R) посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (п.5.3.5).

Посевы инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч.

Одну пробирку с посевом используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортным свойствам (п.п.1.5.2 - 1.5.5 прилож.2).

Второй посев на скошенном питательном агаре используют для создания запасов рабочей культуры (п.1.2 прилож.2).

Оставшуюся бульонную культуру Е. coli M17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано в пункте 1.5.1 приложения 2.

При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам и (или) при наличии более 25% полиморфных (нетипичных) колоний в R-форме полученную культуру для работы не используют.

1.2. Создание запасов рабочей культуры

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов (п.п.1.5.1 - 1.5.5 прилож.2) культуру со скошенного питательного агара (для E.coli K12F(+) Str(R) - с питательного агара со стрептомицином) засевают уколом в столбик с полужидким агаром (п.5.3.4). В зависимости от интенсивности работы лаборатории посев проводят в 4 - 10 пробирок, из расчета по 1 - 3 пробирки на 1 мес. работы и 1 пробирки для восполнения запасов рабочей культуры через 3 мес. на следующий квартал (п.1.3 прилож.2).

Посевы инкубируют 18 - 24 ч при 37°С. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми (силиконовыми) пробками и закладывают на хранение при температуре (4 - 8)°С.

Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.

1.3. Восполнение запасов рабочей культуры

Восполнение запасов рабочей культуры производится в конце третьего, шестого и девятого месяца с момента вскрытия ампулы (каждые 3 мес.).

Для восполнения запасов рабочей культуры используется субкультура на среде хранения, полученная ранее при создании запасов или при очередном их восполнении.

Из пробирки с культурой, предназначенной для восполнения запасов, производят посев в питательный бульон. Посевы инкубируют при 37°С 18 - 24 ч.

После инкубации из питательного бульона делают высев петлей в две пробирки со скошенным питательным агаром (п.5.3.1). При ведении штамма E.coli К12 F(+) Str(R) посев осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (5.3.5). Посевы инкубируют при 37°С (18+- 2) ч.

Один из посевов используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортным свойствам (п.п.1.5.2 - 1.5.5 прилож.2).

Второй посев на скошенном питательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры (п.1.2 прилож.2).

Оставшуюся бульонную культуру E.coli М17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как это описано в п.1.5.1 прилож.2.

При наличии более 25% полиморфных (нетипичных) колоний и (или) при несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам полученную культуру для дальнейшей работы не используют.

Необходимо получить новую ампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов процедура закладки культуры на хранение осуществляется согласно п.1.2 прилож.2.

Восполнение запасов рабочей культуры проводят только три раза.

По истечении года использования необходимо получить новую эталонную культуру из коллекции микроорганизмов.

1.4. Подготовка культуры для целевого использования в анализе

Накануне использования культуру с полужидкого агара высевают на 2 пробирки со скошенным питательным агаром (п.5.3.1). Для культуры Е. coli К12 F(+) Str(R) используют питательный агар со стрептомицином (п.5.3.5). Посев инкубируют 18 - 24 ч при 37°С.

Культуру из одной пробирки используют по назначению. Вторая пробирка с культурой на скошенном питательном агаре используется для получения культуры для работы на следующий (второй) день.

При необходимости получения культуры тест-штамма на третий день высев снова производят с полужидкого агара.

7.5. Контроль эталонных бактериальных культур

Постановка контроля включает:

- оценку степени диссоциации культуры Е. coli М17-02;

- проверку видовых свойств бактериальных культур;

- проверку способности Е. coli К12 F(+) Str(R) проверку культуры Е. coli К12 F(+) Str(R) на однородность и отсутствие загрязнения фагом.

1.5.1. Оценка степени диссоциации культуры Е. coli М17-02

Из 18-часовой бульонной культуры делают 10-кратные разведения физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5 и 6 разведения засевают на 2 чашки питательного агара предварительно подсушенные в термостате. Шпателем посевы распределяют по поверхности агара по полного исчезновения влаги и инкубируют в термостате при температуре (37 +- 1)°С в течение 18 - 24 ч.

Выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 100 колоний.

Проверку тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуального просмотра изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном свете через бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.

На питательном агаре бактерии вида Е. coli образуют колонии средней величины 3 - 5 мм, плоско-выпуклые, круглые, гладкие с ровным краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные в прямом и непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящем свете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.

В R-форме колонии эшерихий более плоские, большего размера, неправильной формы с неровными краями и шероховатой, матовой поверхностью.

При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация, др.) подсчитывают количество измененных колоний и общее количество просмотренных колоний.

Общее количество просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затем рассчитывают процент диссоциации по формуле:

                     количество измененных

                           колоний

     % диссоциации = ---------------------- х 100%

                        общее количество

                      просмотренных колоний

Если процент диссоциированных колоний более 25%, то данная культура не пригодна для дальнейшего использования.

1.5.2. Контроль видовых свойств Е. coli М17-02 и Е. соli К12 F(+) Str(R)

После восстановления лиофилизированной культуры проводится типирование культуры по биохимическим свойствам до вида.

Идентификацию рекомендуется проводить с использованием тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae, разрешенных к применению. При этом следует руководствоваться рекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных биохимических тестов.

Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценку эталонного штамма Е. coli проводят путем подтверждения следующих основных свойств:

- отсутствие оксидазной активности;

- грам-негативности;

- способности образовывать на среде Эндо характерные темно-красные (малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком на среде;

- способности утилизировать лактозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч и 44°С в течение 24 ч;

- способности утилизировать глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 ч.

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.

1.5.3. Проверка чувствительности Е. соli К12 F(+) Str(R)

Способность Е. coli К12 F(+) Str(R) лизироваться специфичным фагом, является основополагающим свойством тест-культуры, на котором основан метод определения колифагов в воде.

Проверка чувствительности осуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая пробирка с рабочей культурой, хранящейся на полужидком агаре.

Выполнение анализа

Бактериальную взвесь готовят по п.8.5.2.3. На 100 мл расплавленного и остуженного до (45 - 49)°С питательного агара вносят 1 мл бактериальной взвеси и разливают в чашки. После застывания чашки на поверхность агара наносят каплю (0,05 мл) суспензии фага, не захватывая хлороформа. Инкубируют в течение 18 - 24 ч при 37°С. Просмотр посевов следует осуществлять в проходящем свете.

Культура считается восприимчивой и пригодной для проведения анализов воды при наличии четких зон лизиса. При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования и подлежит замене.

1.5.4. Проверка культуры Е. coli К12 F(+) Str(R) на загрязненность фагом

Бактериальную взвесь готовят по п.8.5.2.3, вносят в расплавленный и остуженный до температуры (45 - 49)°С питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Чашку Петри заливают приготовленной смесью, инкубируют при температуре 37°С 18 - 24 ч.

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Культура должна давать равномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует о загрязненности культуры фагами.

1.5.5. Контроль видовых свойств Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens

Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:

- наличия оксидазной активности;

- грам-негативности;

- роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с образованием кольца сине-зеленого пигмента;

- наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 С;

- способности роста на питательном агаре при 42°С в течение 24 ч (для Pseudomonas aeruginosa);

- способности роста на питательном агаре при 4°С в течение 24 ч (для Pseudomonas fluorescens).

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего использования.

2. Культивирование, хранение и контроль эталонных культур бактериофагов

В качестве эталонного штамма для проведения контроля культуры клеток-хозяина при проведении анализа на колифаги используется РНК-содержащий фаг MS2.

Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоит из 2 функциональных блоков:

- восстановление лиофилизированной культуры;

- создание запасов эталонной культуры и культур для целевого использования.

2.1. Восстановление лиофилизированной культуры

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего появляются трещины.

Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят приблизительно 0,5 мл питательного бульона для регидратации.

2.2. Создание запасов эталонных культур фага и культур для целевого использования

Рабочую культуру Е. coli К12 F(+) Str(R), хранящуюся на полужидком агаре, засевают в пробирку с 10 мл питательного бульона. Посевы инкубируют при (37 +- 1)°С 18 - 24 ч.

После инкубации 0,1 мл полученной бульонной культуры повторно засевают в 3 - 4 пробирки с 10 мл питательного бульона и помещают в термостат при (37+-1)°С. Через 2 ч инкубации в каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага MS_2, инкубацию продолжают до 18 - 24 ч. После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в холодильнике.

Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 мл хлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.

Одну пробирку используют для целевого назначения в контроле чувствительности культуры Е. coli К12 F(+) Str(R) к фагу. Две других служат запасом эталонного фага.

Активность полученной культуры определяется титром фага. Для использования допускается культура с титром более 10(7) - 10(8). Через год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получить новую культуру или провести определение титра хранящегося фага.

2.3. Определение титра фага

Для определения титра фага выполняется серия десятикратных разведений культуры фага (п.2.2). По 1 мл каждого разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного агара и Е. coli К12 F(+) Str(К), приготовленной аналогично описанному в п.1.5.4 прилож.2. Посевы инкубируют при (37 +- 1)°С. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми или силиконовыми пробками и хранят до получения результатов при температуре (4 +- 2)°С для приготовления рабочих суспензий фага.

Через 18 - 24 ч инкубации просчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых отмечается рост 30 - 100 негативных колоний фага.

При получении титра менее 10(7) фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описанную процедуру.

После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживание ультрафиолетовым облучением.