Временные методические рекомендации "Лабораторная диагностика "Атипичной пневмонии" (SARS) методом ПЦР" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 3 мая 2003 г.)

ГАРАНТ:

См. материалы по клинике и дифференциальной диагностике тяжелого острого респираторного синдрома

См. указание Минздрава РФ от 25 августа 2003 г. N 1013-У "Об организации исследований по диагностике тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и других инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в центрах госсанэпиднадзора"

См. письмо Минздрава РФ от 2 февраля 2004 г. N 2510/872-04-32 "О порядке лабораторного исследования тяжелого острого респираторного синдрома (SARS)"

1. Введение

1.1. Настоящие методические рекомендации определяют временный порядок и правила проведения лабораторных исследований по специфической детекции РНК коронавирусов, вызывающих синдром острого респираторного заболевания, или атипичную пневмонию, или SARS (далее по тексту SARS) до завершения разработки и внедрения в практику диагностических препаратов к вирусу SARS.

1.2. Рекомендации разработаны для специалистов противочумных институтов, противочумных станций и других учреждений, осуществляющих лабораторную диагностику SARS, в соответствии с "Временной инструкцией по лабораторной диагностике синдрома острого респираторного заболевания (атипичной пневмонии) (SARS)" (письмо Первого заместителя Министра здравоохранения Российской Федерации от 21.04.03 г.).

1.3. Инкубационный период SARS составляет 2-14 суток, в среднем 7-10 суток, лихорадочный период - до 10-14 суток. РНК вируса методом ПЦР выявляют в биологических жидкостях: крови, мокроте, смывах носоглотки на 1-10 сутки заболевания.

1.4. В связи с существенными трудностями в культивировании и выделении коронавирусов, методы генодиагностики являются в настоящее время ведущими в подтверждении связи заболевания "атипичной пневмонией" с вирусом SARS. Принцип метода состоит в направленной амплификации кДНК, синтезируемой с помощью обратной транскриптазы, на основе специфичного фрагмента РНК вируса. С целью повышения достоверности анализа рекомендуется проведение ПЦР с двумя парами праймеров (используются раздельно).

1.5. В методических рекомендациях представлены протоколы ПЦР, основанные на рекомендациях ВОЗ, до появления первых случаях заболеваний "атипичной пневмонии" в России. Протоколы могут быть модифицированы в дальнейшем, по мере изменения ситуации.

1.6. В соответствии с "Временной инструкцией..." вирус SARS отнесен к II группе патогенности. С учетом отсутствия регламентированных методов инактивации вирусов при исследованиях проводимых методом ПЦР и доказанной высокой опасности заражения медицинского персонала вся работа проводится с тщательным соблюдением мер биобезопасности регламентированных СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности" и СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности".

2. Отбор проб и транспортировка биологического материала

ГАРАНТ:

См. Методические указания МУ 1.3.1877-04 "Порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторного анализа биологического материала от больных (и умерших) пациентов с подозрением на тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.

См. Инструкцию по порядку отбора проб при патологоанатомическом исследовании лиц, предположительно погибших от атипичной пневмонии (SARS), утвержденную Главным государственным санитарным врачом РФ 3 мая 2003 г.

2.1. Отбор проб от больных и подозрительных на заражение вирусом SARS осуществляет медицинский персонал, с соблюдением правил противоэпидемического режима.

2.2. Материал для исследования методом ПЦР забирают в стерильные пробирки с герметично завинчивающимися крышками. Консервант (мертиолят натрия) не добавляется.

2.2.1. Кровь. Забор производят из локтевой вены в количестве 4,5 мл стерильным шприцем, в который предварительно вносят 0,5 мл стерильного 4% раствора натрия цитрата и переносят в пробирку. Аккуратно перемешивают покачиванием.

2.2.2. Мазки и смывы с носоглотки, бронхоальвеолярные смывы, плевральную жидкость отбирают в количестве 5 мл. Мазки забирают тампонами и помещают в стерильные пробирки с 5 мл физиологического раствора. Не рекомендуется использовать тампоны на деревянной палочке, так как они могут содержать субстраты инактивирующие вирусы и ингибирующие ПЦР.

2.2.3. Секционный материал. Исследуют легкие, сегментарные бронхи, кровь, печень, селезенку. Кусочки органов весом 5-10 г помещают в стерильные герметично закрывающиеся емкости.

2.2.5. Кровь, смывы с дыхательных путей хранят и транспортируют в лабораторию для исследований при температуре минус 20°C.

3. Организация работ при проведении исследований с использованием ПЦР

3.1. Исследования материала от больного подозрительного на зараженность вирусом SARS методом ПЦР проводят в учреждениях, имеющих разрешение на работу с ПБА I-II групп патогенности.

3.2. Для проведения генодиагностических исследований выделяют четыре отдельные комнаты, предназначенные для выполнения следующих этапов ПЦР-анализа:

а - первичная подготовка, выделение РНК и постановка реакции обратной транскрипции (синтез кДНК);

б - проведение ПЦР;

в - учет результатов реакции амплификации;

г - приготовление реакционных смесей для реакции обратной транскрипции и ПЦР (чистое помещение).

Комнаты "а", "б", "в" укомплектовываются емкостями с дезинфицирующим средством и баками для автоклавирования.

3.3. Помещение "а" должно быть оборудовано боксирующим устройством (боксом безопасности). В боксе размещают поддон с салфеткой, смоченной 6% раствором перекиси водорода, для разбора и первичной подготовки проб, оборудование для выделения РНК и проведения реакции обратной транскрипции: микроцентрифугу, вортекс, твердотельный термостат. В этой комнате находится низкотемпературный холодильник для хранения нативного материала. В помещении "б" расположен амплификатор для постановки ПЦР. В помещении "в" находится оборудование для проведения электрофореза, учета и документирования результатов (источник тока, камера для электрофореза, трансиллюминатор с устройством для документирования результатов электрофореза и поддон с салфеткой, смоченной 6% раствором перекиси водорода.

3.4. Подготовку реакционных смесей (master mix) для реакции обратной транскрипции и ПЦР осуществляют в отдельном "чистом" помещении "г". Пробирки с приготовленными реактивами передают в комнаты "а" и "б" для внесения в них исследуемых проб.

3.5. Каждое помещение должно иметь свой набор, автоматических пипеток, наконечников (с фильтрами), пластиковой и стеклянной посуды, используемых только в данной комнате (боксе) и имеющих соответствующую маркировку. Наконечники должны строго соответствовать автоматическим пипеткам, пробирки для амплификации - термоциклерам (в соответствии с инструкцией фирмы - производителя прибора).

3.6. Аптечка дополнительно комплектуется: 1% раствором борной кислоты, интерфероном.

4. Рекомендуемые наборы реактивов, оборудование и расходные материалы

4.1. Наборы реактивов.

- набор для выделения РНК "Рибо-сорб" (производство ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва);

- набор для реакции обратной транскрипции "Реверта"; (производство ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва);

- олигонуклеотидные праймеры (синтез осуществляет ООО "Синтол" г. Москва);

- маркеры молекулярного веса (производство ООО "Синтол" г. Москва)

4.2. Оборудование и расходные материалы для ПЦР (могут быть заменены на аналогичные по своим характеристикам)

- амплификатор (программируемый термоциклер) Терциктм МС 2 (ЗАО "ДНК-технология", Россия);

- малогабаритная высокоскоростная лабораторная микроцентрифуга "ЦиклоТемп-201", 16000 об/мин, со сменными роторами для пробирок - 0,5 мл и 1,5/2,0 мл (НПФ "СТМ-Ц", Россия);

- микроцентрифуга/встряхиватель ТЭТА 2 (ООО "Биоком", Россия);

- программируемый твердотельный термостат Т-2415 с диапазоном рабочих температур от 20°C до 120°C (ООО "Биоком", Россия);

- автоматические пипетки "Ленпипет" Россия 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 мкл;

- программируемый охладитель проб ОП-01 для пробирок 0,5 и 1,5 мл (ООО "Биоком", Россия);

- источник тока "Эльф-4" (ЗАО "ДНК-технология", Россия);

- миникамера для электрофореза SE-1 (ООО "Хеликон", Россия);

- УФ трансиллюминатор LKB 2011 ("LKB", Швеция);

- фотоаппарат с оранжевым или интерференциальным (594 нм) сфетофильтром или видиосистема для компьютерного документирования;

- микроцетрифужные пробирки объемом 0,6 мл (QSP, США);

- микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой);

- наконечники для автоматических пипеток с фильтрами на 10, 200 и 1000 мкл (QSP, США).

5. Проведение анализа

5.1. Первичная подготовка проб.

Контейнер (герметичную тару, бикс) с доставленными на исследования пробами устанавливают в поддон, в бокс безопасности на 35-40 мин. Затем осторожно открывают крышку контейнера и, убедившись в целостности емкости(ей) с материалом, выставляют их на поддон предварительно обработав снаружи дезраствором. Емкости маркируют и регистрируют (лист регистрации выносят из "заразной" зоны только после обработки погружением в дезинфицирующий раствор).

5.2. Выделение РНК

В микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой, содержащие 450 мкл лизирующего буфера 1, вносят по 100 мкл исследуемых проб, перемешивают и инкубируют при 65°C в течение 10 мин на твердотельном термостате. Оставшийся материал помещают в холодильник на минус 20°C для хранения. Использованные пробирки и наконечники, супернатант помещают в емкость, заполненную на 1/3 объема 0,1 N раствором гидроокиси натрия.

Затем в пробирку вносят 30 мкл нуклеосорбента, периодически встряхивают на вортексе (микроцентрифуге/встряхивателе) в течение 5 мин. После этого центрифугируют при 8000 g в течение 30 сек., супернатант удаляют, а к осадку добавляют 300 мкл буфера 2.

Содержимое пробирки вновь перемешивают на вортексе до гомогенного состояния, центрифугируют при 8000 g в течение 30 сек., супернатант отбирают, а к осадку добавляют буфер 3. Осадок ресуспендируют на вортексе и центрифугируют при 8000 g в течение 1 мин. Супернатант удаляют, к осадку добавляют 500 мкл буфера 4. Содержимое перемешивают на вортексе, затем центрифугируют при 8000 g в течение 30 сек, супернатант удаляют. Осадок высушивают при температуре 65°C в течение 5-7 мин. К осадку добавляют 30 мкл деионизованной стерильной воды и выдерживают при температуре 65°C в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. По окончании взвесь центрифугируют при 8000 g в течение 1 мин; 10 мкл супернатанта используют для проведения реакции обратной транскрипции.

5.3. Проведение реакции обратной транскрипции

Обратную транскрипцию РНК проводят с использованием набора "Реверта", обеспечивающего синтез комлементарной ДНК (кДНК), в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Пробирки с реакционной смесью, в количестве соответствующим числу проб, переносят в комнату "а", где вносят по 10 мкл каждой пробы экстрагированной РНК, аккуратно перемешивают, инкубируют при 37°C в течение 30 мин.

5.4. Постановка ПЦР

Для проведения ПЦР используют две пары праймеров, обеспечивающие амплификацию фрагментов гена РНК-зависимой РНК-полимеразы:

1) CDC1-5' - gggttgggactatcctaagtgtga - 3', CDC2-5' - ccatcatcagatagaatcatcata - 3', размер ампликонов 440 п.н. (CDC, 2003);

2) SAR1s-5' - cctctcttgttcttgctcgca - 3', SAR1as-5' - tatagtgagccgccacacatg - 3', размер ампликонов 121 п.н. (Drosten C., et al. 2003).

ПЦР с каждой парой праймеров проводят в двух отдельных пробирках.

Готовят необходимое количество микропробирок объемом 0,6 мл, по 2 пробирки на каждую пробу и одну - для отрицательного контроля, нумеруют их. Реактивы для постановки ПЦР полностью размораживают и перемешивают на вортексе в течение 10 сек. Предварительно в помещении "г" готовят общую реакционную смесь, исходя из того, что на одну реакцию необходимо: Н2О - 14,8 мкл; 2,5 мкл 10 Х Б (0,7 мМ Трис, 0,2 мМ (NH4)2SO4, 0,1% Твин 20, 200 мкг/мл БСА, рН 8,5); 2,5 мкл дНТФ (2 мМ раствор дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ); 1,0 мкл 50 мМ раствора MgCl2, по 1 мкл каждого праймера с концентрацией 12 пмоль/мкл, 0,2 мкл фермента Taq-полимеразы с концентрацией 5 ед/мкл. Тщательно перемешивают на вортексе и переносят во все пробирки по 23 мкл. Наслаивают на поверхность по 25-30 мкл минерального масла.

Пробирки переносят в помещение "б" и во все, кроме контрольной, вносят под масло по 2 мкл полученной кДНК. В пробирку, помеченную как отрицательный контроль, вносят 2 мкл деионизованной воды. При наличии положительного контроля в соответствующую пробирку добавляют 2 мкл положительной кДНК. Пробирки помещают в программируемый термоциклер и проводят амплификацию по следующей программе:

95°C - 3 мин:

10 циклов

94°C - 10 сек,

60°C - 10 сек, (с понижением каждый следующий цикл на 1°C)

72°C - 30 сек;

40 циклов

94°C - 10 сек,

56°C - 10 сек,

72°C - 30 сек;

72°C - 7 мин.

Полученные образцы хранят при температуре 4°C.

После завершения программы амплификации пробирки переставляют из прибора в штатив, который помещает в контейнер для транспортировки.

Контейнер обрабатывает снаружи дезсредством и передают для переноса в комнату "в".

5.5. Учет результатов.

В комнате "в" штатив с пробирками помещают на поддон. Для учета результатов используют электрофорез в 2,5% агарозном геле. К продуктам амплификации с помощью автоматической пипетки добавляют 1 мкл буфера для нанесения проб (0,25% бромфеноловый синий, 15% фиколл 400 на дистиллированной воде), тщательно перемешивают пипетированием и по 10 мкл вносят в лунки геля. Использованные наконечники помещают в емкость. При отсутствии положительного контроля в лунку геля вносят маркер молекулярного веса ДНК с шагом 50 или 100 п.н., например ФХ 174 DNA/BsuRI (HaeIII) MBI Fermentas, USA). После чего гель переносят в камеру для электрофореза, заполненную 1ХТАЕ буфером (Трис - 4,84 г., ледяная уксусная кислота - 1.16 мл, 0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0 - 4 мл). Закрывают крышку аппарата и включают его в электросеть через блок питания.

Электрофорез проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора в течение 1-1,5 ч, при градиенте напряжения 10 В/см, пока красителю останется пройти до анодного края геля 2-1,5 см. Окрашенную бромидом этидия в ходе электрофореза ДНК в геле визуализируют под ультрафиолетовым освещением, для чего используют трансиллюминатор. В случае появления в треках, соответствующих исследуемым образцам светящихся полос их размер определяют относительно маркера молекулярного веса ДНК. При использовании праймеров SARS1s и SARS1as при положительной реакции размер ампликонов 121 п.н., а с праймерами CDC1 и CDC2 - 440 п.н. Полученные результаты документируют фотографированием или с помощью компьютерной видиосистемы.

4.2.6. По окончанию работы емкости с отработанным материалом помещают в бак для автоклавирования. В боксе и комнатах проводят текущую дезинфекцию.

6. Режимы обеззараживания различных объектов при лабораторной диагностике SARS (в соответствии с СП 1.2.011-94)

6.1. Обеззараживание поверхностей помещения (пол, стены, двери), оборудования, рабочих столов и др. - двукратным протиранием с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода или 3% раствором хлорамина (экспозиция 120 мин) с последующей обработкой УФ в течение 60 мин.

6.2. Обеззараживание защитной одежды осуществляют:

а) кипячением в 2% растворе соды в течение 30 мин с момента закипания;

б) замачиванием на 30 мин при 50°C в 3% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

в) при использовании КЗМ - протиранием 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства или орошением 3% раствором хлорамина.

6.3. Обеззараживание перчаток - замачиванием на 60 мин в 6% растворе перекиси водорода с 0,5% моющего средства или в 3% растворе хлорамина.

6.4. Обеззараживание защитных очков - двукратным протиранием 6% раствором перекиси водорода с интервалом 15 мин, с последующим обмыванием водой

6.5. Обеззараживание лабораторной посуды, автоклавируемых дозаторов, наконечников, вируссодержащих жидкостей, агарозного геля, инструментария из металла проводится методом автоклавирования - давление 2,0 кГс/см2 (0,2 МПа), температура 132 +- 2°C, время 45 мин.

6.6. Обеззараживание дозаторов - двукратным протиранием с интервалом 15 мин 6% раствором перекиси водорода, с последующей обработкой УФ в течение 60 мин.

Полученный методом ПЦР положительный результат с одной или с двумя парами праймеров не является безусловным доказательством наличия вируса SARS, а проба от данного больного подлежит направлению в специализированный центр для проведения подтверждающего анализа.

Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г.Онищенко