Методические указания МУ 4.2.1103-02 "Приготовление проб с имитаторами патогенных биологических агентов" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27 января 2002 г.)

4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы

Методические указания МУ 4.2.1103-02
"Приготовление проб с имитаторами патогенных биологических агентов"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27 января 2002 г.)

Дата введения: 1 апреля 2002 г.

1. Общие положения и область применения

1.1. Методические указания устанавливают требования к приготовлению проб с применением имитаторов патогенных биологических агентов.

1.2. Методические указания предназначены для учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и других учреждений, проводящих в Системе наблюдения и лабораторного контроля индикацию патогенных биологических агентов и лабораторный контроль продовольствия на зараженность возбудителями опасных инфекционных заболеваний и токсинами с применением экспрессных и ускоренных методов исследования.

1.3. Методические указания разработаны с целью установления единого подхода к приготовлению проб с учетом требований по специфической индикации патогенных биологических агентов. Унификация методов приготовления проб наряду с едиными требованиями к проведению тренировочных учений по их индикации способствует разработке единого подхода к оценке полученных результатов.

2. Нормативные ссылки

2.1. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24.07.00 N 554.

2.2. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24.07.00 N 554.

ГАРАНТ:

Постановлением Правительства РФ от 15 сентября 2005 г. N 569 названное Положение признано утратившим силу и утверждено Положение об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации

2.3. СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности". Утверждены Госкомсанэпиднадзора России 04.05.94.

2.4. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности". Утверждены Госкомсанэпиднадзора России 28.08.95.

2.5. СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности и гельминтами". Утверждены Минздравом России 03.02.99.

2.6. Методическое пособие для врачей эпидемиологов и микробиологов. Бактериологическая разведка и индикация бактерийных (биологических) средств. Утверждены Минздравом СССР 16.04.70.

2.7. Дополнение к методическому пособию "Документация, используемая при проведении специфической индикации биологических поражающих агентов". Утверждено Минздравом СССР 26.08.81.

2.8. Инструкция по лабораторному контролю продовольствия на зараженность возбудителями опасных инфекционных заболеваний и токсинами. Утверждена Минздравом СССР, 1983.

2.9. Методические указания по подготовке и применению имитаторов биологических агентов с целью проверки готовности учреждений санэпидслужбы к работе по специфической индикации и лабораторному контролю. Утверждены Минздравом СССР 02.04.86.

2.10. Руководство по индикации и идентификации бактериальных (биологических) средств. Минобороны СССР, 1989.

2.11. Отраслевой стандарт 91500.05.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. Утвержден Минздравом РФ 29.02.00 N 32.

2.12. Письмо Минздрава России от 24.02. 00 года N 1100/474-0-113.

3. Термины и определения*

3.1. Патогенные биологические агенты (ПБА) - патогенные для человека микроорганизмы (бактерии, вирусы, хламидии, риккетсии, простейшие, грибы, микоплазмы), генно-инженерно-модифицированные микроорганизмы, яды биологического происхождения (токсины), гельминты, а также материал (включая кровь, другие биологические жидкости и экскреты организма), подозрительные на содержание перечисленных агентов (2.5).

3.2. Специфическая индикация - комплекс специальных мероприятий, проводимых для подтверждения факта применения бактериальных (биологических) средств, выявления и определения вида ПБА в исследуемых пробах (2.10).

3.3. Экспрессный метод исследования - непосредственное (без накопления) исследование нативного материала, проб (2.6).

3.4. Ускоренный метод исследования - исследование мазков, взвесей после предварительного биологического накопления на питательных средах, культуре клеток, биопробных животных, эмбрионах (2.6).

3.5. Медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) - лекарственные средства, предназначенные для иммунологической профилактики, иммунологической диагностики и иммунологической терапии (2.11).

3.6. Вакцины - препараты, получаемые из живых аттенуированных штаммов или убитых культур микроорганизмов или их антигенов, предназначенные для активной иммунизации (2.11).

3.7. Диагностические иммунобиологические препараты - препараты, предназначенные для диагностики инфекционных заболеваний (2.11).

3.8. Коммерческие иммунобиологические препараты - МИБП, реализация которых в соответствии с требованиями письма Минздрава России (2.12) проводится при наличии документов:

- свидетельства о регистрации препарата;

- сертификата (паспорта) фирмы - изготовителя на данную серию;

- сертификата производства (прежнее название - сертификат качества) иммунобиологического препарата, выданного ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

3.9. Имитаторы ПБА:

- вакцинные штаммы некоторых возбудителей инфекционных заболеваний I-II группы патогенности;

- диагностикумы, содержащие корпускулярные и (или) растворимые антигены микроорганизмов;

- штаммы, которые обладают всеми признаками микроорганизмов II группы патогенности, но не имеют патогенных свойств, в связи с чем отнесены к III или IV группе (например - V. cholerae О1 нетоксигенный);

- безопасные в работе токсины.

3.10. Проба с имитаторами ПБА (далее - проба) - образец материала для исследования, в который с учетом требований настоящего и других действующих документов добавлены имитаторы ПБА из числа перечисленных в п. 3.9, в целях проведения внешне- и внутрилабораторного контроля готовности учреждений (лабораторий) к проведению специфической индикации этих агентов и контроля продовольствия на зараженность возбудителями опасных инфекционных заболеваний и токсинами.

4. Требования по конструированию проб

4.1. Пробы могут содержать один и более различных агентов, в т.ч. и не относящихся к имитаторам ПБА в следующих сочетаниях:

- один имитатор ПБА;

- два и более имитаторов ПБА (миксты);

- один или более ПБА из группы имитаторов и один или более ПБА IV группы патогенности (условно патогенных микроорганизмов);

- один или более ПБА IV группы патогенности (без имитаторов).

Применение проб без ПБА (стерильных) нецелесообразно.

4.2. При осуществлении контроля за готовностью лабораторий к проведению специфической индикации ПБА или лабораторному контролю продовольствия на зараженность возбудителями опасных инфекционных заболеваний и токсинами в качестве имитаторов ПБА должны использоваться коммерческие вакцины, токсины и другие препараты, для индикации которых имеются коммерческие диагностические препараты. Для научно-исследовательских целей (отработка новых методов индикации ПБА и других), учебных и иных специальных задач могут использоваться имитаторы ПБА, не обязательно отвечающие требованиям, изложенным в п. 3.8. Перечень некоторых препаратов, которые могут быть использованы в качестве имитаторов ПБА, представлен в прилож. 3, куда включено 16 препаратов. По мере увеличения выпуска коммерческих МИБП, в т.ч. диагностических препаратов для проведения иммуноферментного анализа, ДНК-диагностики и других методов исследования, перечень имитаторов ПБА может быть расширен.

4.3. Условно патогенные микроорганизмы в связи с отсутствием соответствующих коммерческих диагностических препаратов не подлежат идентификации в сроки, необходимые для проведения экспрессного и ускоренного анализа. Они являются "фоном" для имитаторов ПБА, имеющим большое значение, поскольку в реальности практически все пробы из объектов окружающей среды и многие пробы биологического материала, поступающие на исследование, содержат те или иные микроорганизмы (сапрофитные, условно патогенные и другие). В пробы, которые в нормальных условиях не должны содержать условно патогенные микроорганизмы или их антигены (кровь и некоторые другие биологические субстанции, консервированные пищевые продукты), эти микроорганизмы могут не добавляться.

4.4. В качестве "фона" можно использовать такие микроорганизмы, как Е.coli, St.aureus, St.epidermidis, В.cereus, Y.enterocolitica, Ps.aeruginosa и другие. Выбранные штаммы этих микроорганизмов должны отвечать следующим требованиям:

- не проявлять антагонистического (например, колициногенного) действия по отношению к жизнеспособным микроорганизмам - имитаторам ПБА;

- формировать на простых питательных средах, не содержащих ингибиторы роста, зрелые колонии в течение 18-24 часов. Такие колонии служат в определенной степени ориентиром для обнаружения под микроскопом на поверхности пластинки агара мельчайших колоний микроорганизмов, обладающих замедленным ростом (возбудителя чумы, бруцелл и других);

- не иметь или иметь слабую и замедленную подвижность на простых питательных средах, не содержащих ингибиторы подвижного (ползучего) роста.

Не рекомендуется использовать в качестве "фона" культуру Y.pseudotuberculosis в пробах, содержащих в качестве имитатора вакцинный штамм Y.pestis в связи с трудностями их дифференциации экспрессными методами.

4.5. В качестве фона может рассматриваться и V.cholerae не О1 и не О139, т.к. коммерческие препараты для обнаружения возбудителя в МФА и РНГА не выпускаются. Однако данные микроорганизмы для отдельных задач можно считать имитатором ПБА, поскольку классический метод исследования с использованием сред накопления без ингибиторов роста (без теллурита калия) позволяет лабораториям, не имеющим возможности проводить экспрессное исследование, выдать тем не менее окончательный ответ о выделении культуры этого микроорганизма в сроки, необходимые для обнаружения других имитаторов ПБА.

4.6. Допускается использование в качестве "фона" смывов с каких-либо объектов окружающей среды, проверенных на содержание в них микроорганизмов. Смывы получают с нескольких участков поверхности, каждый раз ополаскивая тампон в физиологическом растворе до получения значительной мутности. На 5 мл пробы добавляют 2 капли такой взвеси. Т.к. объекты окружающей среды подвергаются многим внешним влияниям, смывы с них, несмотря на проверку, не гарантируют стабильности результатов. Поэтому более предпочтительным является дозированное внесение отобранных условно патогенных микроорганизмов из взвеси, приготовленной по стандартному образцу мутности 10 единиц (10(9) для кишечной палочки) или 5 единиц (5 х 10(8)). Фактическое количество микробных клеток в такой взвеси для мелких микроорганизмов может быть более высоким, а для крупных - меньшим, чем 10(9). Примерное содержание различных микроорганизмов во взвеси представлено в таблице на следующей странице.

Примерное содержание различных микроорганизмов, соответствующее стандарту мутности 5 и 10 единиц

N п/п	Наименование микроорганизма	Соотношение размера с кишечной палочкой	Число микробных клеток по стандарту мутности
			5 единиц	10 единиц
1	E.coli	Х	5,0 х 10(8)	10(9)
2	St.aureus	1,0	5,0 х 10(8)	10(9)
3	Y.pestis	1,0	5,0 х 10(8)	10(9)
4	Вас.anthracis - споры	1,0	5,0 х 10(8)	10(9)
5	Вас.anthracis (вегетативная форма)	10,0	5,0 х 10(7)	10(8)
6	Вас.cereus (вегетативная форма)	10,0	5,0 х 10(7)	10(8)
7	V.cholerae	0,5	10(9)	2,0 х 10(9)
8	Br.abortus	0,6	8,0 х 10(8)	1,6 х 10(9)
9	Fr.tularensis	0,2	2,5 х 10(9)	5,0 х 10(9)
10	R.prowazekii	0,8	6,5 х 10(8)	1,3 х 10(9)
11	C.burneti	0,15	3,3 х 10(9)	6,6 х 10(9)
12	B.mallei	1,0	5,0 х 10(8)	10(9)
13	B.pseudomallei	1,0	5,0 х 10(8)	10(9)
14	C.immitis	200	2,5 х 10(6)	5,0 х 10(6)
15	H.capsulatum	100	5,0 х 10(6)	10(7)

4.7. Живые вакцинные штаммы можно подготавливать для внесения в пробы в двух вариантах:

- с предварительным подращиванием на плотных питательных средах, что рекомендуется для чумной вакцины, сибиреязвенной вакцины, которую в вегетативной форме целесообразно вносить в биологические объекты. Подращивание проводят при 37 +- 0,5°С в течение 1 суток (для штамма EV чумного микроба - 1 сутки при 28 +- 0,5°С и 1 сутки при 37 +- 0,5°С, что способствует обнаружению микроба за счет образования фракции F1, выявляемой при помощи МФА и РНГА). Более длительное выращивание биологических агентов нежелательно, т.к. оно приводит к увеличению числа отмерших микробных клеток и в суспензии, приготовленной по стандартному образцу мутности, будут присутствовать как живые, так и нежизнеспособные клетки;

- без подращивания, непосредственно после 3-6 часовой регидратации содержимого ампулы. В таком виде хорошо обнаруживаются методами экспрессного анализа вакцинные штаммы туляремийного, бруцеллезного микроба, споры сибиреязвенного микроба, которые целесообразно вносить в небиологические объекты окружающей среды. Этот способ может быть использован и в отношении чумной вакцины, но концентрация микробных клеток должна быть в 5-10 раз выше по сравнению с подрощенным штаммом, т.к. не все клетки обнаруживаются при экспрессном исследовании.

4.8. Концентрация микробных клеток в ампулах с живыми вакцинами может колебаться в зависимости от серии препарата. Определить ее с помощью стандартного образца мутности не всегда представляется возможным из-за цветовых различий жидкости в разведенной вакцине и стандарте. В этом случае определение концентрации клеток для их дозированного внесения в пробы возможно двумя способами:

- содержимое ампулы регидратируют до первоначального объема дистиллированной водой, выдерживают несколько часов, готовят ряд промежуточных разведений и проводят непосредственный подсчет микробных клеток одного из разведении в камере Горяева. Концентрацию клеток вычисляют математически с учетом разведения;

- содержимое ампулы разводят как указано выше и концентрацию клеток рассчитывают математически, исходя из того, что одна прививочная доза вакцины должна содержать определенное количество микробных клеток, обеспечивающих необходимый иммунный ответ. Число прививочных доз указано на ампуле, что позволяет к определенному объему разведенной вакцины (0,1 мл) добавить расчетное количество физраствора для получения необходимой концентрации микробных клеток. Расчеты для некоторых вакцин представлены ниже.

Наименование вакцины	Количество м.к. в прививочной дозе	Количество физраствора на одну прививочную дозу (мл)	Получаемая концентра- ция м.к. в 1 мл
Чумная - накожная	3,0 х 10(9)	0,3	10(9)
Чумная - подкожная	3,0 х 10(8)	0,03	10(9)
Бруцеллезная	1,33 х 10(10)	1,33	10(9)
Сибиреязвенная	4,0 х 10(8)	0,4	10(8)
Туляремийная	2,0 х 10(8)	0,2	10(8)

Пример: в ампуле содержится 7 доз бруцеллезной вакцины в 1 мл. Для получения суспензии 1 млрд (10(9)) м.к./мл необходимо после регидратации вакцины в 1 мл дистиллированной воды отобрать из ампулы 0,1 мл суспензии и добавить физраствор в количестве 1,33 х 7 ~ 9,3 мл.

4.9. Инактивированная холерная корпускулярная вакцина Эль-Тор выпускается с содержанием 8 х 10(10) и 1,6 х 10(11) м.к./мл. Для получения суспензии 10(9) м.к./мл содержимое ампулы регидратируют соответственно в 1,0 или в 2,0 мл дистиллированной воды и к 0,1 мл суспензии добавляют 7,9 мл физраствора.

4.10. Сибиреязвенная вакцина из штамма СТИ как после регидратации, так и после подращивания содержит конгломераты споровых или переплетенные цепочки вегетативных клеток. В связи с этим при внесении небольших количеств имитатора в пробу может оказаться, что при микроскопии мазка во многих полях зрения светящиеся клетки не будут обнаружены, а в каком-нибудь одном поле встретится конгломерат из многих клеток. Предупредить такое явление могло бы тщательное разбивание хлопьев на единичные клетки. Однако без специальной обработки (например ультразвуковой или добавления поверхностно активных веществ) сделать это затруднительно. Крупные хлопья частично можно разбить тщательным пипетированием через узкий кончик пастеровской пипетки или шприцом с тонкой иглой, но мелкие комочки остаются. В таких случаях избежать ложных отрицательных результатов микроскопического исследования можно за счет предварительного просмотра мазков с объективами х20, х40, позволяющими увеличить размер полей зрения.

4.11. Выбор материала для внесения ПБА и самих агентов не должны противоречить условиям "легенды". Нерационально, например, готовить токсиносодержащую пробу на мембранном фильтре или в "соскоб с карбункула" вносить холерный вибрион. Некоторые из возможных сочетаний наименований проб по легенде с фактическим материалом представлены в таблице на стр. 13. Используемый материал перед внесением биологических агентов должен быть или проверен на содержание микроорганизмов (почва, трава, листья, кровь, сыворотка крови, кал) или быть стерильным (физраствор, тампоны, мембранные фильтры, почва, кал, зерно, сено и др.).

Некоторые материалы, используемые для приготовления проб

Объекты	Наименование пробы по легенде	Используемый материал
		Проба	Объем, вес
Окружающая среда	Смыв с поверхности	физраствор	5; 10 мл
		тампон
		мембранный фильтр
	Фураж	зерно	2-5 г
	Подстилочный материал	сено, солома	2-5 г
	Растения	трава, листья, хвоя	3-5 г
	Воздух	физраствор	5; 10 мл
		мембранный фильтр
	Вода	вода	500 мл
		мембранный фильтр
	Осколок боеприпаса	физраствор	5 мл
		тампон
	Почва	почва, песок	10 г
Биологичес- кие	Пунктат бубона	физраствор	1 мл
	Смыв (соскоб) карбункула	физраствор	1 мл
	Смыв с судна (с рвотными массами и пр.)	физраствор	5; 10 мл
		тампон
	Смыв с носоглотки	физраствор	5; 10 мл
		тампон
	Кровь	кровь, сыворотка крови	2-5 мл
	Раневое отделяемое	физраствор	1 мл
		тампон
	Кал	кал в физрастворе	1 г; 5 мл
		тампон

4.12. При внесении в сухие пробы биологических агентов в малом объеме жидкости происходит быстрое ее высыхание, что приводит к отмиранию микроорганизмов. Зерно в месте попадания жидкости после ее высыхания склеивается в плотный комок, требующий тщательного растирания. При необходимости сохранить биологические агенты в жидкой фазе достаточно длительное время целесообразно добавлять физиологический раствор или вносить ПБА из менее концентрированных исходных суспензий.

4.13. Рекомендуется добавлять жидкие компоненты в пробы в следующей очередности:

- физиологический раствор в сухие пробы;

- диагностикумы, токсины и инактивированные вакцинные штаммы;

- условно-патогенные микроорганизмы;

- живые вакцинные штаммы неспорообразующих микроорганизмов;

- живые вакцинные штаммы спорообразующих микроорганизмов.

Живые микроорганизмы одного вида можно вносить одной пипеткой (одним наконечником), начиная с меньших концентраций.

4.14. Имитаторы различных бактериальных агентов удобно вносить в пробы из исходных концентраций от 10(5) до 10(9) м.к./мл, а условно-патогенные микроорганизмы - из концентраций 10(4)-10(5) м.к./мл. В самой пробе объемом 5 или 10 мл происходит уменьшение концентрации клеток (разбавление суспензии) соответственно в 5 и 10 раз, а при усреднении пробы до 20 мл происходит дополнительное разбавление суспензии соответственно в 4 и в 2 раза. Все это следует учитывать для расчета количества микробных клеток не только при подготовке, но и при дальнейшем исследовании проб. Так, например, если исходная концентрация кишечной палочки составляет 10(5) м.к./мл (100 тыс.) и в пробу вносится 50 мкл такой суспензии (5,0 х 10(3)) на 5 мл, то в 1 мл пробы теоретически будет содержаться 10(3) м.к./мл, а в посевной дозе (0,1 мл) - 10(2) или 100 клеток. Исходную суспензию можно вносить в пробу каплями, исходя из предположения, что одна капля на конце тонкой пипетки Пастера равна 25 мкл. Этот метод является более грубым, т.к. размер капли в зависимости от густоты суспензии может меняться. Применение современных механических и электронных пипеток и пипеточных дозаторов позволяет проводить дозирование быстрее и точнее, чем капельное. Объемы исходной суспензии, которые необходимо добавить в пробы для получения требуемой концентрации микробных клеток, указаны в прилож. 1, которое дано в двух вариантах (1.1 и 1.2).

4.15. В качестве имитатора ботулотоксина используют стандартный препарат токсического комплекса ботулинического токсина типа С (прилож. 3, N 16). Случаи пищевого отравления токсином типа С не отмечены, однако работа с препаратом требует соблюдения правил личной гигиены. Целесообразно сначала приготовить промежуточное разведение, для чего к содержимому ампулы (0,1 мл - 2000 dlm) добавляют 4,9 мл физраствора, получая концентрацию 400 dlm/мл. Пробу готовят из расчета добавления 50 мкл (20 dlm) разведенного токсина на 1 мл. Таким образом, в пробу, конечный объем которой составит 20 мл, необходимо добавление 1 мл разведенного токсина (400 dlm). В этой концентрации наглядную гибель белой мыши на 2-3 день (не позже 4 дня) вызывает инокуляция 0,5 мл пробы (10 dlm).

4.16. В качестве имитатора вируса оспы используют коммерческую живую вакцину против оспы (осповакцину). Работа с препаратом должна проводиться при строгом соблюдении правил противоэпидемического режима, особенно не привитыми лицами. Вакцина содержит около 10(6) оспообразующих единиц (ООЕ) вируса в одной прививочной дозе. В ампулу вносят по 100 мкл дистиллированной воды или физраствора на 1 дозу, а затем вакцину дополнительно разводят в 10 и 100 раз, получая 3 различных концентрации вакцины: цельную (10°) с содержанием вируса 10(7) ООЕ/мл, 1:10 (10(-1)) с содержанием вируса 10(6) ООЕ/мл и 1:100 (10(-2)) с содержанием вируса 10(5) ООЕ/мл. В пробу вносят по 10 мкл вакцины из того или иного разведения на 1 мл пробы с учетом конечного объема пробы (см. п. 4.14). При этом обычно вирус из разведения 10° вызывает заражение большого числа клеток VERO, НЕР-2, RK-13 и других в первые сутки; из разведения 10(-1) - гнездное заражение клеток в течение 30-40 часов, а из разведения 10(-2) - заражение отдельных клеток позднее 40 часов. Указанный эффект должен быть предварительно проверен, т.к. он зависит от серии вакцины, условий ее хранения, чувствительности клеток.

4.17. Приготовление проб с имитаторами ПБА проводят с учетом санитарных правил (п. 2.5).

5. Приготовление проб с имитаторами возбудителей сапа, мелиоидоза, глубоких микозов

5.1. Имитатор возбудителя сапа (Burkholderia mallei) представляет собой смешанную взвесь бактерий В.mallei 10230, Р-1 и 712, выращенных при 37°С в течение 1-2 суток на МПА с 5% глицерина; имитатор возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) - взвесь трех штаммов В.pseudomallei С 141, 101 и 111 (из различных эндемичных регионов мира), выращенных при 37 +- 0,5°С в течение 1 суток на МПА с 5% глицерина. Взвеси обеззаражены формалином в конечной концентрации 1%, что определяет возможность проведения только экспрессного анализа.

5.2. Ввиду антигенного родства обоих микроорганизмов, их обнаружение и идентификацию проводят с помощью как групповых, так и видоспецифических иммунодиагностических препаратов. Диагностикум эритроцитарный иммуноглобулиновый сапной взаимодействует с растворимыми и клеточными антигенами возбудителей и сапа, и мелиоидоза. При использовании в МФА группоспецифических люминесцирующих иммуноглобулинов, окрашивающих клетки и В.pseudomallei, и В.mallei, дифференциация их по морфологии клеток практически невозможна. Для видовой дифференциации предназначены видоспецифические препараты.

5.3. Оба имитатора расфасованы в ампулы по 1 мл с содержанием 1,0 х 10(9) микробных клеток по оптическому стандарту (ОСО) мутности 10 ед. Чувствительность МФА составляет 1,0 х 10(5) м.к., а РНГА - 5,0 х 10(5) м.к. Дозы имитаторов, вносимые в образцы проб окружающей среды, зависят от характера исследуемых объектов, от их сорбционных свойств. В пробы воздуха, воды, смывов с гладких поверхностей в расчете на 20 мл пробы добавляют 100-200 мкл (1,0 х 10(8)-2,0 х 10(8) м.к.) имитатора, в пробу почвы - 100 мкл.

5.4. Для приготовления имитатора возбудителя кокцидиоидомикоза используется взвесь мицелиальной фазы С.immitis 36s (штамм Сильвейра), а имитатора возбудителей гистоплазмоза - типичный штамм Н.capsulatum 6650. Возбудители выращивают 28 суток при 28°С на агаре Сабуро с 1,5% дрожжевого экстракта и обезвреживают добавлением формалина до конечной концентрации 0,5%. Это определяет возможность проведения только экспрессного исследования.

5.5. Ввиду наличия общих антигенных связей между возбудителями особо опасных глубоких микозов используются как группо-, так и видоспецифические диагностические препараты. Препараты на основе антител к Н.capsulatum могут выявлять имитатор как этого гриба (причем и мицелиальную фазу, и дрожжеподобные формы), так и С.immitis. Кокцидиоидозные люминесцирующие антитела и эритроцитарные иммуноглобулиновые диагностикумы предназначены для видоспецифической идентификации С.immitis. Особенность МФА состоит не только в степени люминесценции взвеси гриба, но и в выявлении специфически окрашенных характерных для данного вида морфологических элементов (артроконидий с "усиками"). В РНГА выявляется комплекс растворимых антигенов гриба, преимущественно полисахаридной природы.

5.6. Концентрация микробных клеток в ампуле, рассчитанная по ОСО 10 ед. отличается от фактического количества грибных клеток при подсчете в камере Горяева (коэффициент пересчета, как показано в таблице п. 4.6. на стр. 10, составляет для С.immitis 1:200, для H.capsulatum - 1:100). Концентрация клеток и чувствительность МФА и РНГА при исследовании чистых культур представлены ниже.

Вид возбудителя	Содержание в ампуле (м.к./мл)		Чувствительность метода (м.к./мл)
	ОСО 10 ед.	фактическое	ОСО 10 ед.	фактическое
С.mmitis	1 х 10(9)	5 х 10(6)	2 х 10(5)- 2 х 10(6)	1 х 10(3)- 1 х 10(4)
H.capsulaturn	1 х 10(9)- 5 х 10(9)	1 х 10(7)- 5 х 10(7)	6 х 10(5)- 6 х 10(6)	6 х 10(3)- 6 х 10(4)

5.7. Дозы имитаторов, вносимые в образцы проб окружающей среды, зависят от характера исследуемых объектов, от их сорбционных свойств. Рекомендуемые дозы для проб с конечным объемом 20 мл представлены в таблице.

Вид возбудителя	Воздух, вода, смывы с гладких поверхностей			Почва
	объем (в мкл)	содержание микробных клеток		объем (в мкл)	содержание микробных клеток
		по ОСО 10 ед.	фактичес- кое		по ОСО 10 ед.	фактичес- кое
С.immitis	40	2 х 10(8)	2 х 10(6)	200	1 х 10(9)	1 х 10(7)
Н.capsulatum	40	5 х 10(7)	5 х 10(5)	200	3 х 10(9)	3 х 10(7)

6. Приготовление проб с риккетсиями и коксиеллами

6.1. Для приготовления проб используются коммерческие препараты, представленные в прилож. 3 (NN 7, 12-15). Растворимые антигены в препаратах, предназначенных для постановки реакции связывания комплемента, хорошо выявляются с помощью реакции пассивной гемагглютинации, а корпускулярные антигены - в МФА. При этом возможно проведение только экспрессной диагностики. В целях ускоренной диагностики и проверки режима работы с микроорганизмами используется вакцина Е сыпнотифозная комбинированная живая сухая. Работа с ней требует строгого соблюдения противоэпидемического режима и сопряжена с необходимостью проведения 3-4-кратного пассажа штамма на куриных эмбрионах. Интенсивность роста риккетсий контролируют микроскопией мазков-отпечатков стенок желточного мешка с помощью МФА.

6.2. Оптимальной вносимой в пробу дозой диагностикума Провачека или Сибирика, выпускаемых для целей исследования материала в РСК, является доза с концентрацией антигена, дающей положительный результат в РПГА не менее чем в трех последовательных разведениях. Такая концентрация обеспечивается при использовании 1 ампулы диагностикума для приготовления одной имитированной пробы объемом 20 мл. Недостаточное количество антигена в пробе приводит к получению ложноотрицательного результата РПГА, а его избыточная концентрация - к перерасходу сыворотки для торможения РПГА (РТПГА).

6.3. Диагностикумы разводят согласно указанию на ампуле и выдерживают 3 ч при комнатной температуре для полной регидратации. Корпускулярный антиген после разведения тщательно диспендируют шприцом с тонкой иглой, или пипеткой с тонко оттянутым концом, как это было уже указано в п. 4.10, титруют и приготовляют мазки на предметном стекле (антигенные пятна). Мазки подсушивают, фиксируют 30 мин в ацетоне или в 96°-ном этаноле и окрашивают люминесцирующей сывороткой. Оптимальным считается наличие 5-10 корпускул в поле зрения. Выбранную концентрацию увеличивают в несколько раз с учетом последующего усреднения пробы. Для корпускулярного Ку-риккетсиозного диагностикума, разведенного в объеме 1 мл, ориентировочной дозой является 15 мкл суспензии на 1 мл пробы. Количество корпускул в пробе для каждой серии диагностикума должно быть проверено указанным выше способом.

6.4. В пробу целесообразно вносить и растворимый, и корпускулярный антигены.

7. Программа составления проб

7.1. При подготовке значительного количества проб для одной или нескольких лабораторий целесообразно заранее составлять программу добавления биологических агентов, которая позволяла бы предвидеть конечный результат специфической индикации ПБА. В программе для каждой пробы указывается "легенда", число микробных клеток в исходной суспензии, объем суспензии и содержащееся в нем число микробных клеток (антигена или количества токсина), добавляемых в пробу и т.д. Программа оформляется в виде протокола внесения патогенных агентов в пробы. Образец такого протокола представлен в прилож. 4. Данный образец содержит 17 различных разновидностей биологических агентов (имитаторы ПБА и условно-патогенные микроорганизмы), расположенных в порядке внесения в пробы согласно п. 4.13. Так как некоторые биологические агенты вносятся в пробы из разных разведений, то всего в образце протокола представлено внесение этих 17 БА в 29 различных вариантах. Эти варианты могут быть использованы для приготовления большого количества разнообразных проб. В графе 9 протокола указаны ПБА, внесенные в пробы NN 1-24, а последующие всевозможные номера отмечены точками.

7.2. Подготовка имитаторов в разных разведениях позволяет готовить пробы с различными концентрациями имитатора, высокой, средней и низкой. Высокая концентрация обнаруживается достаточно уверенно, а низкая выявляется только при хорошем уровне подготовки лаборатории, после предварительной концентрации проб или заведомо рассчитана на обнаружение ПБА после подращивания микроорганизмов.

7.3. Поскольку экспрессное исследование проводится из пробы объемом 3-5 мл, то теоретически рассчитанное количество БА, указанное в графе 6 прилож. 4, можно заранее сопоставить с чувствительностью МФА и РНГА. В графе 8 указано теоретическое количество микробных клеток, которое можно ожидать при высевах на плотные питательные среды.

7.4. Протокол внесения патогенных биологических агентов может быть подготовлен в варианте, когда ПБА указаны для каждой пробы индивидуально. Такой вариант для двух лабораторий (для проб NN 1-24) представлен в прилож. 5.

7.5. Протокол внесения биологических агентов может быть подготовлен также с указанием ожидаемых результатов (прилож. 6). В этом виде протокол можно использовать в ходе проведения специфической индикации. Ожидаемое время получения первого положительного ответа в соответствии с п. 7.3 ориентировано на использование МФА и РНГА. При добавлении "подпороговых" количеств имитатора время ожидаемого первого ответа, как отмечено выше, составляет до 24 ч. Однако при использовании лабораторией дополнительных высокочувствительных методов исследования, таких как ИФА и (или) ПНР, ответ может быть получен уже при экспрессном исследовании.

7.6. V.cholerae не О1 в протоколе 3 отнесен к имитаторам ПБА (см. п. 4.5), в связи с чем указан результат исследования и возможное время выдачи ответа. Направление должно содержать указание на проведение соответствующих исследований, т.к. в противном случае поиск может ограничиться только теми ПБА, обнаружение которых возможно при экспрессном анализе.

7.7. Содержание БА в пробах NN 1-24 всех трех протоколов одинаковое. При передаче проб в исследовательскую лабораторию можно использовать один, два или все три протокола, т.к. они не дублируют друг друга. Каждый из них, как видно из таблицы, имеет определенное назначение.

Варианты использования протоколов внесения имитаторов

Показатель	N протокола
	1	2	3
Возможность перемены посредником номеров проб (шифрования проб)		-	-
Целесообразность использования при внесении БА	-
Наличие информации о содержащемся в пробе количестве внесенных биологических агентов	-
Наличие "легенды"		-	-
Удобство использования лабораторией для анализа полученных ею результатов	-
Удобство использования посредником		-	-
Возможность использования посредником - не микробиологом			-
Возможность применения протокола в ходе проведения специфической индикации			-

7.8. В пробах, содержащих живые микроорганизмы, при хранении и транспортировании может происходить частичное отмирание клеток, зависящее от влияния "фоновой" среды, антагонизма клеток, температуры хранения и других, не всегда предсказуемых факторов, что приводит в ряде случаев к появлению ложных отрицательных результатов. Из этого вытекает необходимость контроля качества проб, который может осуществляться путем непосредственного наблюдения за ходом проведения исследования в проверяемой лаборатории. При отсутствии такой возможности целесообразно отбирать небольшое количество содержимого проб с низкими концентрациями имитаторов ПБА. Эти контрольные образцы начинают исследовать примерно в одно время с наиболее удаленной из проверяемых лабораторий. Результаты контроля фиксируются в журнале. Полученные в процессе индикации результаты целесообразно сопоставлять не только со сведениями, находящимися у посредника и отражающими состояние проб непосредственно в момент приготовления, но и с контрольными результатами, что особенно важно при наличии расхождений в результатах исследований.

8. Сопроводительная документация

8.1. Приготовление и выдача проб сопровождается следующей документацией:

- сопроводительное письмо, в котором делается отметка об отсутствии опасности или наличии особых требований при транспортировании проб;

- акт приема-передачи проб в двух экземплярах, один из которых передается посреднику, а другой остается в лаборатории, приготовившей пробы;

- протокол(ы) приготовления проб;

- направления на пробы для каждого проверяемого учреждения в двух экземплярах по утвержденной Минздравом СССР форме А-1 (см. нормативную ссылку N 2.7). На втором экземпляре, возвращаемом посреднику, делается отметка исследовательской лаборатории о дате и времени приема проб. В прилож. 2 представлен образец направления на пробы NN 1-16 в лабораторию одного из центров госсанэпиднадзора. "Легенда" в направлении составлена в соответствии с протоколами 2 и 3 (прилож. 5 и 6).

------------------------------

*(1) В скобках в конце определения указан номер нормативной ссылки, в которой имеется определение.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации - Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко