Приложение 6. Проведение иммунофлюоресцентного исследования на выявление вирусных антигенов в отпечатках и мазках из органов и тканей

Приложение 6

Проведение иммунофлюоресцентного исследования на выявление вирусных антигенов в отпечатках и мазках из органов и тканей

1. Для приготовления отпечатков и мазков берут кусочки органов размером 1 х 1 см.

2. При приготовлении препаратов необходимо обратить внимание на следующее:

- кусочки органов должны быть тщательно отмыты в 0,9%-ном растворе натрия хлорида;

- поверхность среза органа или слизистой оболочки подсушивается впитывающим влагу материалом;

- препараты из трахеи и бронхов рекомендуется делать, используя соскобы со слизистой оболочки для получения большого числа клеточных элементов на стекле;

- препараты из миокарда и диафрагмы рекомендуется делать в виде клеточной суспензии. Для приготовления препаратов из миокарда берутся кусочки (размером приблизительно 0,5 х 0,5 см) левого желудочка и его сосочковых мышц. Взятые кусочки измельчаются в чашке Петри или на часовом стекле, затем пипеткой добавляется 2-4 капли дистиллированной воды, после чего полученная клеточная суспензия наносится на предметное стекло пипеткой и подсушивается на воздухе;

- препараты головного мозга при проведении исследования на наличие вируса бешенства рекомендуется готовить в виде криостатных срезов толщиной 5-7 мкм.

Приготовленные препараты:

1) подсушивают на воздухе в течение 5-10 мин;

2) отпечатки и мазки фиксируют в охлажденном 96% спирте в течение 10-15 мин из расчета 10-15 мл спирта на стекло;

3) криостатные срезы фиксируют в охлажденном спирте в течение 30-40 мин из расчета 25 мл спирта на стекло;

4) подсушивают на воздухе в течение 2-5 мин и окрашивают.

Окрашенные препараты могут храниться в холодильнике при 4°С в течение 2-3 месяцев. В случае необходимости фиксированные препараты до окраски их люминесцирующими сыворотками можно хранить в холодильнике 3-5 суток.

1. Прямой метод

а) нанести флюоресцирующий конъюгат на отпечаток. Экспозиция 30-45 мин при комнатной температуре;

б) тщательно отмыть в нескольких порциях (не менее 5) физиологического раствора и дистиллированной воды в течение 10-15 мин, а окрашенные криостатные срезы - в течение 30-40 мин.

в) подсушить на воздухе или под вентилятором.

2. Непрямой метод

а) нанести на препарат стандартную сыворотку, содержащую антитела к данному вирусному антигену, экспозиция 30-40 мин;

б) слить со стекла сыворотку и быстро промыть в 2-3 порциях физиологического раствора с РН 7,6 - 7,8 в течение 1-2 мин;

в) на влажный препарат нанести антивидовой флюоресцирующий конъюгат, экспозиция 30-40 мин;

Примечание: флюоресцирующий конъюгат содержит меченные ФИТЦем антитела к глобулинам животного, сыворотка которого содержит антитела к вирусному антигену.

г) тщательно отмыть в нескольких порциях (не менее 5) физиологического раствора и дистиллированной воды в течение 10-15 мин, а окрашенные криостатные срезы - в течение 30-40 мин;

д) подсушить на воздухе или под вентилятором.

Примечание: при необходимости приготовленные после вскрытия зафиксированные неокрашенные препараты можно доставить в течение 3-5 дней в ГИСК им. Л.А.Тарасевича для проведения иммунофлюоресцентного исследования.

Важно отметить, что при подготовке флюоресцирующих сывороток для окраски препаратов большое значение имеет "красящий титр", т.е. наибольшее разведение конъюгата, способное обеспечить яркую (+++, ++++) специфическую флюоресценцию гомологичных антигенов. Чем выше красящий титр, тем больше рабочее разведение конъюгата и тем меньше возможности для неспецифической окраски препарата. Рабочее разведение обычно указывается на этикетке ампул флюоресцирующих сывороток.

Оценка результатов люминесцентного исследования.

Оценка степени специфического свечения осуществляется по 4 бальной шкале. Достоверным считается свечение на 2 и более баллов.

Признаки специфического свечения:

1. Темный фон препарата;

2. Свечение большинства клеток в исследованных полях зрения (количество клеток должно быть не менее 10-20 клеток в 3-5 полях зрения);

3. Структурность свечения: диффузное, пылевидное, гранулярное, очаговое в цитоплазме, ядре или обоих отделах клетки.

Примечание: локализация антигена определяется биологическими свойствами вируса. Например, антигены вирусов респираторной группы обнаруживаются чаще в цитоплазме, но могут выявляться и в ядре (аденовирус); антигены энтеровирусов - в цитоплазме и саркоплазме кардиомиоцитов; антиген вируса герпеса - и в ядре и в цитоплазме.

Признаки неспецифического свечения:

1. Свечение фона

2. Однотонность окраски фона и клеток

3. Отсутствие структурности и четкой локализации свечения

4. Свечение макрофагов и сегментоядерных лейкоцитов (эти клетки могут обнаруживаться и при специфическом свечении других клеточных элементов, однако их свечение во внимание не принимается).