Приложение 6. Проведение иммунофлюоресцентного исследования на выявление вирусных антигенов в отпечатках и мазках из органов и тканей

Приложение 6

Проведение иммунофлюоресцентного исследования на выявление вирусных антигенов в отпечатках и мазках из органов и тканей

1. Для приготовления отпечатков и мазков берут кусочки органов размером 1 х 1 см.

2. При приготовлении препаратов необходимо обратить внимание на следующее:

- кусочки органов должны быть тщательно отмыты в 0,9%-ном растворе натрия хлорида;

- поверхность среза органа или слизистой оболочки подсушивается впитывающим влагу материалом;

- препараты из трахеи и бронхов рекомендуется делать, используя соскобы со слизистой оболочки для получения большого числа клеточных элементов на стекле;

- препараты из миокарда и диафрагмы рекомендуется делать в виде клеточной суспензии. Для приготовления препаратов из миокарда берутся кусочки (размером приблизительно 0,5 х 0,5 см) левого желудочка и его сосочковых мышц. Взятые кусочки измельчаются в чашке Петри или на часовом стекле, затем пипеткой добавляется 2-4 капли дистиллированной воды, после чего полученная клеточная суспензия наносится на предметное стекло пипеткой и подсушивается на воздухе;

- препараты головного мозга при проведении исследования на наличие вируса бешенства рекомендуется готовить в виде криостатных срезов толщиной 5-7 мкм.

Приготовленные препараты:

1) подсушивают на воздухе в течение 5-10 мин;

2) отпечатки и мазки фиксируют в охлажденном 96% спирте в течение 10-15 мин из расчета 10-15 мл спирта на стекло;

3) криостатные срезы фиксируют в охлажденном спирте в течение 30-40 мин из расчета 25 мл спирта на стекло;

4) подсушивают на воздухе в течение 2-5 мин и окрашивают.

Окрашенные препараты могут храниться в холодильнике при 4°С в течение 2-3 месяцев. В случае необходимости фиксированные препараты до окраски их люминесцирующими сыворотками можно хранить в холодильнике 3-5 суток.

1. Прямой метод

а) нанести флюоресцирующий конъюгат на отпечаток. Экспозиция 30-45 мин при комнатной температуре;

б) тщательно отмыть в нескольких порциях (не менее 5) физиологического раствора и дистиллированной воды в течение 10-15 мин, а окрашенные криостатные срезы - в течение 30-40 мин.

в) подсушить на воздухе или под вентилятором.

2. Непрямой метод

а) нанести на препарат стандартную сыворотку, содержащую антитела к данному вирусному антигену, экспозиция 30-40 мин;

б) слить со стекла сыворотку и быстро промыть в 2-3 порциях физиологического раствора с РН 7,6 - 7,8 в течение 1-2 мин;

в) на влажный препарат нанести антивидовой флюоресцирующий конъюгат, экспозиция 30-40 мин;

Примечание: флюоресцирующий конъюгат содержит меченные ФИТЦем антитела к глобулинам животного, сыворотка которого содержит антитела к вирусному антигену.

г) тщательно отмыть в нескольких порциях (не менее 5) физиологического раствора и дистиллированной воды в течение 10-15 мин, а окрашенные криостатные срезы - в течение 30-40 мин;

д) подсушить на воздухе или под вентилятором.

Примечание: при необходимости приготовленные после вскрытия зафиксированные неокрашенные препараты можно доставить в течение 3-5 дней в ГИСК им. Л.А.Тарасевича для проведения иммунофлюоресцентного исследования.

Важно отметить, что при подготовке флюоресцирующих сывороток для окраски препаратов большое значение имеет "красящий титр", т.е. наибольшее разведение конъюга