Приложение 7. Взятие материала на исследование

Приложение 7

Взятие материала на исследование

1. Взятие материала производят согласно инструктивно-методическим документам, регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя инфекций и в соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

2. С целью предотвращения повреждения ДНК-мишеней возможно использование транспортных сред различного состава в зависимости от вида исследуемого материала. При необходимости длительного хранения и транспортирования, при отсутствии низкотемпературных холодильников используют специальную транспортную среду ESP. Исследуемый материал может храниться в среде ESP при комнатной температуре (20-30°С) в темном месте в течение 10 дней

- транспортная среда N 1: NaCl 137 мМ, КCl 2,7 мМ, NaH2PO4 10 мМ, К2НРO4 2 мМ, сыворотка крупного рогатого скота 20%;

- транспортная среда N 2: сахароза 0,218 М, КН2РО4 0,0038 М, К2НРО4 0,0072 М, БСА 1%;

- транспортная среда ESP: саркозил 1%; ЭДТА 0,05 М; свободная от нуклеаз проназа Е 1 мг/мл.

3. Взятие биотического материала

3.1. Кровь. Использование плазмы крови допустимо для проведения качественных и количественных исследований, использование сыворотки крови - только для проведения качественных исследований методом ПЦР.

Взятие материала. Для получения плазмы забор крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа "Venoject" (с ЭДТА), "Vacuettr" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА). При взятиии в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или 3,8% раствор цитрата Na в соотношении 1:9). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом).

Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или в стеклянную пробирку типа Vacuetter без антикоагулянта. При взятии в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку.

Предварительная обработка проб. Плазму крови получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800-1600 g (3000 об/мин) в течение 20 мин. при комнатной температуре. Затем отбирают плазму в количестве не менее 1 мл отдельными наконечниками с аэрозольным барьером (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Для получения сыворотки пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка. После чего сгусток обводят пастеровской пипеткой и оставляют при комнатной температуре до образования сыворотки. По другому варианту кровь со сгустком центрифугируют при 800-1600 g (3000 об/мин) в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем сыворотку в количестве 1 мл переносят отдельными наконечниками с аэрозольным барьером (пастеровскими пипетками) в стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Условия хранения материала и предварительно обработанных проб. Образцы цельной крови:

- при температуре 2 - 25°С - в течение 6 часов с момента взятия материала для количественного определения нуклеиновых кислот; в течение 12 часов - для качественного определения нуклеиновых кислот;

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток для качественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов.

Недопустимо замораживание образцов цельной крови!

Образцы плазмы и сыворотки:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 5 суток;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала, поэтому образцы плазмы или сыворотки для длительного хранения желательно разлить небольшими (0,1-0,2 мл) порциями в отдельные стерильные пробирки объемом 1,5 мл.

Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб. Транспортирование клинического материала и предварительно обработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. Образцы крови:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов с момента взятия материала для количественного определения нуклеиновых кислот; в течение 12 часов - для качественного определения нуклеиновых кислот.

Образцы плазмы и сыворотки:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 3 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.2. Моча. Взятие материала. Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не меньше 20 - 40 мл в специальный сухой стерильный флакон или сухую стерильную пробирку.

Предварительная обработка проб. Взбалтывают флакон с мочой. Переносят 10 - 20 мл мочи в центрифужные пробирки объемом 20 - 40 мл с завинчивающейся крышкой и центрифугируют 10 минут при 10000 g (12000 об/мин). Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют супернатант, не захватывая осадок. К осадку добавляют транспортную среду N 2 (см. п. 2) до конечного объема 0,2 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе.

Условия хранения материала и предварительно обработанных проб.

Нативные и предварительно образцы мочи:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 20°С - в течение 2 месяцев;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб. Транспортирование клинического материала и предварительно обработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.3. Фекалии. Взятие материала. Используют пробы фекалий массой (объемом) примерно 1 - 3 г (1-3 мл). Исследование мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 грамма (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.

Предварительная обработка проб. При исследовании нативных фекалий без предшествующего замораживания готовят фекальную суспензию (при водянистой консистенции фекалий в виде прозрачной жидкости фекальную суспензию не готовят).

Приготовление фекальной суспензии:

В соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносят 0,9 мл фосфатного буфера (или стерильного изотонического раствора натрия хлорида). Состав фосфатного буфера: NaCl 137 мМ, КСl 2,7 мМ, NaH2PO4 10 мМ, К2НРО4 2 мМ; рН 7,5+0,2. В каждую пробирку отдельным наконечником с аэрозольным барьером (или одноразовыми лопатками) вносят 0,1 г (0,1 мл) фекалий и тщательно ресуспендируют на вортексе до образования гомогенной суспензии.

При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10 - 20%-й суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10 - 15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30 - 40 минут.

Приготовление бактериальной фракции фекалий для выявления бактериальных агентов. Для приготовления бактериальной фракции фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином. Пробирки с суспензией (водянистыми фекалиями) центрифугируют при 3000 g (5000 об/мин) в течение 5 минут. Отдельным наконечником с аэрозольным барьером из каждой пробирки отбирают надосадочную жидкость и переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем центрифугируют при 10000 g (12000 об/мин) в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 0,2 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида).

Приготовление осветленного экстракта фекалий для выявления вирусных агентов (ТОРС). Для приготовления осветленного экстракта фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином. Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе. Осветляют полученную суспензию путем центрифугирования при 10000 g (12000 об/мин) в течение 5 минут. Супернатант (0,1 мл) смешивают с отрицательным контрольным образцом (50% сыворотка крови крупного рогатого скота, разведенная фосфатно-солевым буфером, состав которого указан выше) (0,1 мл) в соотношении 1:1 и используют непосредственно для выделения РНК. При необходимости хранения супернатант отбирают в отдельную одноразовую пробирку.

Условия хранения материала и предварительно обработанных проб.

Образцы нативных фекалий:

при температуре 2- 8°С - в течение 1 суток.

Фекальная суспензия с глицерином, бактериальная фракция и осветленный фекальный экстракт:

- при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб. Транспортирование клинического материала и предобработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

Образцы нативных фекалий:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток.

Предварительно обработанные пробы:

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.4. Спинномозговая жидкость (ликвор). Взятие материала. Спинномозговую жидкость получают путем прокола поясничной, субокципитальной области или мозговых желудочков одноразовыми пункционными иглами. Взятие ликвора в количестве не менее 0,5-1 мл проводят в одноразовые пластиковые пробирки объемом 1,5 мл.

Предварительная обработка проб. Не требуется.

Условия хранения материала.

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.5. Биопсийный и аутопсийный материал. Взятие материала. Микробиоптат (пунктат)/микроаутоптат помещают в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1,5 мл с защелкой, содержащие 0,1 мл физиологического раствора или транспортной среды. Макробиоптат/макроаутоптат помещают в контейнер с физиологическим раствором или транспортной средой N 2 (см. п. 2).

Предварительная обработка проб. Микробиоптаты (пунктаты)/микроаутоптаты печени, селезенки и т.д., помещенные в микропробирки с закручивающимися крышками или пробирки объемом 1,5 мл с защелкой, содержащие 0,1 мл транспортной среды N 2 (см. п. 2), предварительной обработки не требуют. Далее выделение нуклеиновых кислот проводят согласно инструкции комплекта для выделения.

Макробиоптаты/макроаутоптаты.

При выявлении вирусных агентов кусочки ткани массой 0,1 - 1 г помещают в охлажденную фарфоровую ступку и добавляют охлажденнный изотонической раствор объемом 0,5-1 мл. Измельчают стерильными ножницами с последующим растиранием пестиком. Через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость (0,1-0,2 мл) стерильным наконечником с аэрозольным барьером в стерильные микропробирки.

При выявлении бактериальных агентов процесс подготовки макробиоптатов/макроаутоптатов аналогичен, только ступку и изотонический раствор не охлаждают.

По другому способу биоптат непосредственно перед выделением нуклеиновых кислот помещают в жидкий азот, затем аккуратно измельчают его пестиком в предварительно охлажденной жидким азотом фарфоровой ступке. Взвешивают 100 мг кусочков ткани и растирают их в ступке в жидком азоте до порошка. Затем для выделения РНК порошок переносят в гомогенизатор и следуют инструкции по выделению РНК. Для выделения ДНК к полученному порошку добавляют равный объем стерильного физиологического раствора (0,1 мл), тщательно перемешивают и отбирают необходимый объем материала, согласно инструкции для выделения ДНК.

Фарфоровая посуда, а также гомогенизаторы должны быть предварительно обработаны хромпиком и простерилизованы. При гомогенизации нескольких образцов необходимо после каждой пробы протирать поверхность стола 0,2% раствором ДП-2Т, затем водой и 70% этиловым спиртом и менять перед обработкой следующей пробы перчатки.

Условия хранения материала. Образцы биопсийного и аутопсийного материала, предназначенного для выделения РНК:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Образцы биопсийного и аутопсийного материала, предназначенного для выделения ДНК:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

- в замороженном виде - в течение 1 суток (только для материала, предназначенного для выделения ДНК).

3.6. Мокрота. Взятие материала. Взятие материала осуществляют в количестве не менее 0,5 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы (пробирки) с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл.

Предварительная обработка проб. Перед выделением нуклеиновых кислот необходимо провести разжижение мокроты, используя раствор "Муколизин" (Na2HPO4, 77,4 мМ, NaH2PO4, 22,6 мМ, бета-МЭ, 99,4 мМ, 5% азид натрия в конечной концентрации 0,05%). В емкость с мокротой добавляют "Муколизин" в соотношении 5:1 (5 частей "Муколизина" к 1 части мокроты), ориентируясь по градуировке емкости. В процессе разжижения мокроты (20-30 мин) емкость периодически встряхивают. Затем автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или в микроцентрифужную пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 8000 g (10000 об/мин) в течение 10 мин. В случае исследования на бактериальные агенты полностью удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой, осадок ресуспендируют в фосфатном буфере, доводя общий объем пробы до 0,1 мл. При исследовании на наличие вирусных агентов после центрифугирования отдельным наконечником с аэрозольным барьером отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Условия хранения материала и предварительно обработанных проб:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.7. Бронхо-альвеолярный лаваж или промывные воды бронхов.

Взятие материала. Взятие материала осуществляют в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки объемом 50 мл.

Предварительная обработка проб. Промывные воды бронхов или бронхо-альвеолярный лаваж перемешивают встряхиванием (вращением) пробирки. Автоматической пипеткой, используя наконечник с фильтром, отбирают 1 мл клинического материала, помещают в пробирку с завинчивающейся крышкой или пробирку с защелкой на 1,5 мл и центрифугируют при 7000 g (10000 об/мин) в течение 10 мин. Затем в случае исследования на бактериальные агенты аккуратно с помощью вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой отбирают супернатант, оставив 0,1 мл надосадочной жидкости. При исследовании на наличие вирусных агентов после центрифугирования отдельным наконечником с аэрозольным барьером отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Условия хранения материала и предварительно обработанных проб:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.8. Мазки из полости носа. Взятие материала. Мазки (слизь) берут сухими стерильными ватными тампонами. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой N 2 (см. п. 2). Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Предварительная обработка проб. Не требуется.

Условия хранения материала:

- при комнатной температуре - в течение 6 часов;

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала. Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.9. Мазки из ротоглотки. Взятие материала. Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой N 2 (см. п. 2). Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.

Предварительная обработка проб. Не требуется.

Условия хранения материала:

- при комнатной температуре - в течение 6 часов;

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.10. Смывы из полости носа. Взятие материала. Взятие материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью зонда или одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания паром под давлением.

Предварительная обработка проб. Не требуется.

Условия хранения материала:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала. Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.11. Смывы из ротоглотки. Взятие материала. Перед взятием смывов из ротоглотки проводят предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек) 8-10 мл изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания паром под давлением.

Предварительная обработка проб. Не требуется.

Условия хранения материала.

- при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

при температуре 2 - 8°С - в течение 6 часов;

- в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.12. Пунктат бубона. Взятие материала. Взятие материала производят стерильным шприцем. Если бубон имеет сохранившуюся кожу (невскрывшийся бубон), то ее протирают предварительно спиртом. Пункцию бубона производят как в его центре, так и на периферии. Из вскрывшегося бубона материал забирают в местах с сохраненной тканью, а также берут отделяемое бубона. Исследуемый материал в количестве 0,1-0,3 мл помещают в пробирку с транспортной средой N 2 или ESP (см. п. 2.).

Предварительная обработка проб. Не требуется.

Условия хранения материала.

при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: при температуре 2 - 8°С или в замороженном виде - в течение 1 суток.

3.13. Везикулы, пустулы. Взятие материала. Перед взятием материала кожные элементы очищают ватным тампоном, смоченным эфиром или спиртом, затем прокалывают их у основания стерильной иглой или тонким капилляром пастеровской пипетки. Для ускорения поступления материала элемент сверху надавливают пинцетом. Корку или верхнюю часть везикул отделяют от кожи иглой, скальпелем. Исследуемый материал помещают в пробирку с транспортной средой N 2 или ESP (см. п. 2).

Предварительная обработка материала, условия хранения и транспортирования - как в п. 3.12.

4. Пробы из объектов окружающей среды.

Пробы окружающей среды транспортируют в лабораторию в течение не более 2-3 ч при температуре не выше 20°С; если нет возможности транспортирования образцов, их хранят при температуре минус 20°С (в течение 6 мес).

4.1. Пищевые продукты. Взятие материала. Пробы отбирают с соблюдением правил асептики в стерильные широкогорлые банки с помощью стерильной ложки, пинцета или ножа. Края банок обжигают над пламенем спиртовки. После закладки проб банки закрывают стерильной бумагой и перевязывают.

Предварительная обработка проб. Твердые пищевые продукты в количестве 1-10 г помещают в стерильную ступку, добавляют 0,9% раствор натрия хлорида в соотношении 1:10 и растирают до гомогенного состояния. Отстаивают и через ватный тампон отбирают надосадочную жидкость, из которой проводят выделение ДНК. Жидкие пищевые продукты в объеме 0,2 мл переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для выделения ДНК.

Условия хранения материала:

- при температуре 2 - 8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70°С - длительно.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

Условия транспортирования материала. Транспортирование материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:

- при температуре 2 - 8°С или в замороженном виде - в течение 1 суток.

4.2. Клещи, комары и эктопаразиты (вши и блохи). Взяятие материала. После взятия и доставки материала в лабораторию комаров, клещей, блох и вшей усыпляют эфиром до обездвижения, нанося каплю эфира на ватно-марлевую пробку. После определения вида и пола материал может быть объединен в пулы в зависимости от вида, пола, места и даты сбора и помещен в сухие чистые пробирки объемом 1,5 мл.

Группировку проб осуществляют в соответствии с МУ 3.1.1027-01 "Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций". При исследовании на чуму в одну пробу включают по 20-30 (не более 50) блох или мелких клещей, вшей. Иксодовых клещей при исследовании на чуму и другие природно-очаговые инфекции исследуют отдельно по фазам развития и в одну пробу берут пивших самок не более трех, голодных - до 30; нифм пивших - до 15, голодных - до 50; личинок пивших - до 30. При исследовании на туляремию в одну пробу объединяют до 50 имаго иксодовых клещей, 50-100 нифм и 100-200 личинок. Блох, гамазовых клещей, вшей исследуют до 100 особей в пробе. Из кровососущих двукрылых группируют пробы, включая в одну до 100 комаров, до 250 мошек и 20-25 слепней. При исследовании на арбовирусные инфекции комаров объединяют в пулы по 50-100 экземпляров. При необходимости проводят исследования отдельных особей.

Предварительная обработка проб:

- клещей помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, куда вносят 1 мл 96% этанола, встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 3-5 сек при 2000 g (5000 об/мин) для удаления капель с крышки пробирки;

- с помощью вакуумного отсасывателя отдельными наконечниками для каждой пробы удаляют спирт из пробирки;

- вносят в пробирку 1 мл 0,15 М раствора хлорида натрия, встряхивают пробирку и осаждают капли с крышки пробирки на микроцентрифуге в течение 3-5 сек при 2000 g (5000 об/мин);

- с помощью вакуумного отсасывателя отдельными наконечниками для каждой пробы удаляют раствор хлорида натрия из пробирки;

- переносят клещей в стерильную фарфоровую чашку, добавляют 0,7 мл 0,15 М раствора хлорида натрия и гомогенизируют пробу;

- наконечником с аэрозольным барьером переносят пробу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 минуты для осветления пробы.

РНК и ДНК выделяют из 0,1 мл надосадочной жидкости.

При выделении РНК и ДНК из комаров, блох и вшей используют данную методику обработки проб за исключением этапов отмывки в 96% этаноле и 0,15 М растворе хлорида натрия. Насекомых и комаров сразу гомогенизируют в стерильной ступке в 0,15 М растворе хлорида натрия.

Условия хранения материала и предварительно обработанных проб. Материал после разбора и формирования проб:

- при температуре минус 20°С в течение 1 месяца;

- при температуре минус 70°С или в сосуде Дюара с жидким азотом длительно.

Обработанный материал (после гомогенизации и осветления) хранится длительно при температуре минус 70°С или в сосуде Дьюара с жидким азотом.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

4.3. Почва, трава, фураж, подстилка. Взятие проб. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения патогенными микроорганизмами (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут в количестве 20-30 г на глубине до 15 см, на территории скотомогильников - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров. При этом верхний слой почвы (2-3 см) снимают.

Пробы фуража берут из поверхностного слоя - не менее 400 г на 4 м2 поверхности при незатаренном типе хранения. Из брикетированного корма срезают верхний слой брикета. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. Пробы грубых кормов (сено, солома) берут из разных мест скирды при помощи ножниц и пинцета из расчета одна проба (40 г) на 4 м2 площади скирды. Отобранные навески сена и соломы измельчают при помощи ножниц и пинцета на листе бумаги, затем помещают в банки. Зеленую массу, срезанную ножницами и пинцетом, помещают в пробирку или в банку.

Предварительная обработка проб. К исследуемому материалу добавляют 0,9% раствор натрия хлорида 1:10, тщательно перемешивают в течение 15 мин, отстаивают в течение 10 мин для оседания крупных частиц. Надосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в течение 2-3 мин при 5000 об/мин, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 0,2-0,5 мл дистиллированной воды.

Условия хранения и транспортирования - как в п. 4.1.

4.4. Вода, стоки, смывы. Взятие проб. Водопроводную воду и воду из поверхностных водоемов для исследования берут в количестве 1 л на одну пробу в двух объемах по 500 мл в стерильную посуду с непромокаемой пробкой. Из водопроводных кранов отбор проб воды производят после предварительного обжигания их спиртовым факелом и спуска воды в течение 10 мин при полном открытии крана.

Хозяйственно-бытовые сточные воды отбирают для исследования двумя способами: в объеме 1 л в двух емкостях по 500 мл или тампонами, приготовленными из марлевых салфеток размером 10x15 см в 10-15 слоев. Последние закрепляют у места забора воды, через 1 сутки помещают в стерильную банку, содержащую физиологический раствор.

Смывы с поверхностей берут стерильными ватными тампонами или марлевыми салфетками. Перед взятием смывов тампоны или салфетки смачивают стерильным физиологическим раствором. После взятия смыва тампон (салфетку) погружают в емкость с физиологическим раствором.

Предварительная обработка проб. Из отобранных образцов переносят по 125 мл в 4 центрифужных стакана объемом 250 мл с завинчивающимися крышками и центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. После чего осадок в каждом стакане ресуспендируют в 0,2 мл физиологического раствора. Полученные суспензии переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 8000 g (12000 об/мин) в течение 1 мин. Надосадочную жидкость отбирают наконечником с аэрозольным барьером в микропробирку объемом 1,5 мл. Для выделения ДНК используют 0,1 - 0,2 мл надосадочной фракции.

Условия хранения и транспортирования - как в п. 4.1.