Приложение 4б. Наставление по применению систем индикаторных бумажных (СИБ или БИС) для ускоренного определения коли-титра воды

Приложение 4б

Наставление
по применению систем индикаторных бумажных (СИБ или БИС) для ускоренного определения коли-титра воды

Бумажные индикаторные системы представляют собой полоски или диски хроматографической бумаги, пропитанные соответствующими субстратами и индикаторами, покрытые для стабилизации пленкообразующим полимером - водным раствором поливинилового спирта.

Бумажная индикаторная система с глюкозой представляет собой диск диаметром 0,8-1,0 см БИС для определения оксидазы - в виде полосок размером 8 см х 1 см или дисков диаметром 3,5-4 см. Срок годности БИС указан на этикетках (не менее года).

Способы применения

Постановка оксидазного теста с помощью БИС-оксидазы при работе бродильным методом. По 2-3 изолированных колоний каждого типа, выросших на секторах чашки со средой Эндо снимают петлей и наносят на полоску БИС-оксидазы (полоску помещают в чашку Петри). При положительной реакции на месте нанесения культуры бумажка синеет в течение одной минуты. При отрицательной - цвет бумажной полоски не изменяется. В ряде случаев оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко, особенно при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет. В таких случаях нужно пересеять колонии со среды Эндо на сектор чашки с питательным агаром или на скошенный питательный агар и после при температуре 37 +-0,5°С в течение 3-5 ч пробу повторить.

Постановка оксидазного теста с помощью БИС-оксидазы при работе методом мембранных фильтров. Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят пинцетом, не переворачивая, на бумажный диск БИС-оксидазы диаметром 3,5-4 см (по наиболее принятому размеру фильтра), который предварительно рекомендуется смочить стерильной дистиллированной водой. Через 3-4 мин определяют результат. Все посиневшие колонии, а также колонии с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceae, их не учитывают. Мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее 5 мин) отсекают оксидазоотрицательные колонии, по 2-3 колонии каждого типа, для определения ферментации глюкозы.

Определение характера ферментации глюкозы

а) На плотной питательной среде (чашечный метод). В чашку Петри тонким слоем наливают 2%-ный щелочной агар рН 7,2-7,8, не ниже 7,2. Подозрительные на кишечную палочку колонии засевают петлей на сектор чашки по ее периферии. На одной чашке могут быть исследованы 6-8 культур. На место посева (площадка около 0,5 см2) накладывают диск с глюкозой. Для улавливания газообразования и фиксации диска последний заливают несколькими каплями расплавленного и остуженного до 40-45°С полужидкого агара (0,6-0,8%). Инкубируют при температуре 37 +-0,5°С. При разложении глюкозы до образования кислоты цвет диска меняется из красного в желтый. При наличии газообразования пузырьки газа скапливаются по краям диска и между диском и агаром. Результаты учитывают в течение 3-5 ч. Скорость реакции зависит от посевной дозы и ферментативной активности культуры. После 5-6 ч учитывать результаты реакции в ряде случаев затруднительно, так как спустя этот срок начинается подщелачивание среды за счет протеолиза белков, желтая зона вновь розовеет и приобретает первоначальный красный цвет.

В качестве контроля необходимо использовать диск без посева культуры. Красный цвет их не меняется. Различие в цвете контрольных и опытных дисков служит для сравнения при учете реакции.

б) В жидкой питательной среде (пробирочный метод). В пробирку с предварительно розлитым по 0,3-0,5 мл и подогревом до 37°С питательным бульоном (рН 7,4-7,8) вносят петлей колонию изучаемой культуры и погружают диск с глюкозой. Среда в пробирках в результате быстрой диффузии в нее индикатора, импрегнированного в бумаге, становится красной. При ферментации глюкозы через 3-5 ч инкубации в термостате при температуре 37 +-0,5°С среда приобретает желтый или оранжевый цвет, а у газообразующих культур на ее поверхности появляются пузырьки газа. Желтый или оранжевый цвет среды, как правило, сохраняется в течение 18-24 ч, пузырьки же газа к этому времени исчезают. В случае необходимости учета результатов на следующий день рекомендуется использовать погружение в среду небольшого клочка гигроскопической ваты или поплавок. Чем больше засеяно культуры, тем быстрее происходит ферментация глюкозы.

При определении индекса кишечных палочек выявление ферментации глюкозы является решающим, поэтому получение ответа через 4-5 ч вместо 18-24 ч имеет несомненное практическое значение.

Примечания.

1. Исследование проводят с чистой культурой.

2. Аппликацию дисков с глюкозой на чашки или погружение их в пробирки производят обожженным пинцетом.

3. Критерием правильности учета реакций должны быть четкие различия в окраске по сравнению с контролем.

4. Для определения активности оксидазы можно использовать тот же сектор чашки, на котором изучается ферментация глюкозы. Дополнительный посев культуры при этом рекомендуется проводить на участке сектора, расположенного ближе к центру чашки.

5. Основные дефекты при применении БИС с глюкозой зависят от несоблюдения режима рН при использовании посуды, обработанной различными порошками и недостаточно отмытой, несоответствия фактических данных рН физиологического раствора сухих сред с указанными на этикетках и т.п.

6. Для ускоренного получения результатов необходимо соблюдение стабильного температурного режима термостата (37 +-1°С).

Срок годности СИБ - 2 года.

Выписка из ТУ 42.14.123-78.