Приложение 1. Ошибки при окраске препаратов крови, способы их устранения и основные дифференциально-диагностические признаки возбудителей малярии

Приложение 1

Таблица 1

Дефекты методики окрашивания препаратов крови по Романовскому-Гимза и их устранение

Характер дефекта	Внешний вид препарата	Вид окрашенных элементов крови и паразитов при микроскопировании	Меры предупреждения и исправления дефектов
Кислая реакция краски	Препарат макроскопически розового цвета	"Тонкий мазок" - эритроциты ярко-розовые, специфическая зернистость не выявляется, паразиты плохо различимы, ядра лейкоцитов и паразитов окрашены слабо, цитоплазма паразитов имеет розовый оттенок.	Проверить рН буферного раствора.
			Препараты перекрасить после предварительного обесцвечивания.
			Для обесцвечивания:
			Свежеприготовленные препараты - погрузить в дистиллированную воду, при сильном перекрашивании в воду добавить 1%-ный раствор уксусной кислоты (1 - 2 капли на 50 мл воды). Ранее приготовленные препараты - смочить ватный тампон смесью Никифорова, 1 - 2 раза осторожно провести по препарату. Сразу после обработки результат проконтролировать под сухой системой микроскопа (окуляр х 7, объектив х 40), в случае необходимости обработку повторить. Необходимо иметь в виду, что улучшить качество окраски возможно преимущественно в случае "тонкого мазка". "Толстые капли" плохо поддаются переокраске. При повторной окраске время окрашивания должно быть сокращено
		"Толстая капля" - не достигается полный гемолиз эритроцитов. Интенсивно розовый фон. Ядра паразитов сливаются с цитоплазмой
Избыточно-щелочная реакция краски	Препарат макроскопически синего цвета без фиолетового оттенка	"Тонкий мазок" - эритроциты голубые или синие, зернистость пораженных эритроцитов выявляется с трудом. Ядра лейкоцитов и паразитов окрашены в синий цвет и с трудом отличимы от цитоплазмы.	Проверить рН буферного раствора или качество отмывки предметных стекол от щелочи; заведомо щелочные стекла (синего цвета) не использовать. В случае необходимости попытаться перекрасить препарат (см. меры предупреждения и исправления дефектов)
		"Толстая капля" - все элементы имеют синюю окраску. Ядро и цитоплазма паразита дифференцируется с трудом
Недостаток азура в краске Романовского	Препарат макроскопически синего цвета	Азурофильные элементы окрашены плохо; отсутствует характерный фиолетово-красный цвет ядер паразитов и лейкоцитов, а также специфической зернистости пораженных эритроцитов	В рабочий раствор добавить синьку Мансона. Препараты дополнительно докрасить (см. меры предупреждения и исправления дефектов)
Недокрашенные препараты	Препарат макроскопически бледный	Форменные элементы крови, их структуры и все структуры паразита бледные. Паразиты выявляются с трудом только по пигменту.	Докрасить "тонкий мазок" в течение 20 - 30 мин, толстую каплю в течение 10 - 15 мин
		В "тонком мазке" специфическая зернистость эритроцитов плохо прокрашена или не прокрашена
Перекрашенные препараты	Препарат макроскопически темно-фиолетовый	"Тонкий мазок" - ядра лейкоцитов чернильного цвета, бесструктурные, ядра паразитов часто неотличимы от темно окрашенной цитоплазмы.	В случае необходимости перекрасить препараты (см. меры предупреждения и исправления дефектов)
		"Толстая капля" - паразиты становятся похожи на обломки ядер лейкоцитов
Аутофиксированная "толстая капля"	Препарат макроскопически имеет металлический оттенок	Гемолиз в процессе окраски не достигается.	Этот дефект неустраним. Для предупреждения следует:
		Микроскопия таких препаратов практически невозможна. Плотный фон состоит из многослойно расположенных эритроцитов	1. Окрашивать свежеприготовленные "толстые капли";
			2. Исключить возможность аутофиксации "толстых капель" (см. п. 6.4.1)

Таблица 2

Plasmodium vivax в "тонком мазке" крови

Формы, обнаруживаемые в периферической крови	Морфологические особенности							Примечания
	Стадии развития бесполых форм (продолжительность эритроцитарной шизогонии - 48 часов)					Половые формы (гаметоциты)
	Юный трофозоит (кольцевидный)	Развивающийся трофозоит	Зрелый трофозоит	Развивающийся шизонт	Зрелый шизонт	Женский	Мужской
Все формы эритроцитарной шизогонии. Интенсивность паразитемии редко превышает 20 тыс. паразитов в 1 мкл крови. При нарастании паразитемии синхронность утрачивается, характерен полиморфизм - одновременное наличие разных стадий бесполых форм и гаметоцитов. Встречается поражение одного эритроцита несколькими паразитами, но реже и в меньшей степени, чем при P. falciparum	Занимает 1/6, более взрослый - 1/4 эритроцита, форма правильная или несколько вытянутая. Ядро округлое, реже несколько вытянутое, относительно плотное. Вакуоль хорошо выражена. Цитоплазма часто с утолщением в одном из участков. Пигмент - отдельные нежные зерна, темно-коричневого цвета в разных участках цитоплазмы	Молодые занимают 1/3 - 1/2 эритроцита, более зрелые - значительную его часть. Цитоплазма разнообразной формы с псевдоподиями, отражающими присущую этим стадиям амебовидную активность - т.н. амебовидные трофозоиты. Ядро округлое или овальное, крупнее и менее плотное в сравнении с кольцевидными трофозоитами, расположено периферически. Наиболее молодые имеют несколько длинных тонких псевдоподий, количественно увеличивающиеся по мере роста, придавая паразиту причудливую форму. Вакуоль относительно крупная, встречается т.н. добавочная вакуоль - слияние концов 2-х псевдоподий при приготовлении и последующей фиксации мазка крови. Пигмент темно-коричневого цвета, расположен чаще диффузно в цитоплазме, иногда концентрируется вокруг вакуоли или по периферии паразита. По мере роста паразита вакуоль постепенно уменьшается, псевдоподии сглаживаются	Занимает значительную часть эритроцита округлой или овальной формы без псевдоподий и вакуоли, с относительно правильным очертанием. Ядро относительно крупное, рыхлое, чаще несколько вытянутое, иногда дугообразное. Цитоплазма занимает основную часть клетки. Пигмент хорошо выражен, наряду с диффузным расположением, концентрируется по периферии паразита. Может начинать группироваться в отдельные скопления	Занимает значительную часть эритроцита. В неразделившейся цитоплазме от 2 до 18 - 20 (в среднем 14 - 16) ядер, уменьшающихся в размере. По мере деления ядер пигмент концентрируется в отдельные скопления	Занимает почти весь или весь эритроцит. 18 - 20 (в среднем 14 - 16) относительно мелких мерозоитов, расположенных асимметрично по отношению к пигменту, собранному в одно плотное скопление. Мерозоит округлой или овальной формы не свыше 2 ЦК в диаметре, ядро мелкое и плотное, расположено центрально или симметрично	Округлый или овальный, занимает весь пораженный эритроцит. Ядро относительно плотное, округлое или вытянутое, расположено асимметрично, реже в центре клетки. Цитоплазма окрашена в более интенсивный сине-голубой цвет в сравнении с бесполыми формами, вакуоли нет. Иногда вокруг ядра - зона просветления розоватого тона или даже почти бесцветная - менее интенсивное скопление хроматина по периферии ядра. Размер ядра варьирует. Пигмент - обильный, мелкие интенсивно окрашенные гранулы или грубые зерна, рассеянные по цитоплазме. Иногда трудно дифференцировать со взрослыми трофозоитами	Несколько уступает в размерах женскому гаметоциту. Ядро крупное, рыхлое с просветлениями, без четких границ, иногда различимо с трудом. Имеет более светлую и яркую окраску в сравнении с женским гаметоцитом. Цитоплазма бледно-голубого или серого цвета, иногда с розовым оттенком. Пигмент - мелкие обильные гранулы или грубые зерна яркой коричневой окраски, рассеяны по цитоплазме с тенденцией к концентрации вокруг ядра	Начиная со стадии развивающегося трофозоита и гаметоцита, паразит превышает размеры эритроцита. Изредка могут встречаться кольца с двойным ядром (см. таблицу "Р falciparum ") и напоминающие лентовидные формы (см.таблицу "P. malariae")

Таблица 3

Plasmodium falciparum в "тонком мазке" крови

Формы, обнаруживаемые в периферической крови	Морфологические особенности								Примечания
	Стадии развития бесполых форм (продолжительность эритроцитарной шизогонии - 48 ч)					Половые формы (гаметоциты)
	Юный трофозоит (кольцевидный)	Развивающийся трофозоит	Зрелый трофозоит	Развивающийся шизонт	Зрелый шизонт	Женский	Мужской
При неосложненном течении только кольцевидные трофозоиты и сформировавшиеся гамонты. Паразитемия может достигать 500 тыс. паразитов в мкл крови. При злокачественном течении и высокой паразитемии появляются также развивающиеся стадии: зрелые трофозоиты и шизонты, однако в меньшем количестве, чем кольцевидные трофозоиты и незрелые гамонты. Характерно множественное поражение эритроцитов от 2 до 6 - 8 паразитов. Встречаются лейкоциты со скоплениями пигмента в цитоплазме - "пигментофаги" при нарастании паразитемии и после окончания лечения	В основном меньшего размера, чем кольца других видов паразитов. Занимают 1/5 - 1/10 эритроцита. Молодые кольца очень мелкие, ядро четко выражено, представлено двумя отдельными скоплениями хроматина. Ядро и кариосома могут быть расположены рядом или на расстоянии друг от друга, тогда кольцо напоминает подкову. Цитоплазма очень нежная, в виде нитевидного ободка окружает вакуоль. Кольца могут располагаться по краю эритроцита, напоминая при этом тонкий серп с ядром в центре	Крупные кольца занимают до 1/3 эритроцита, обычно с асимметричным утолщением цитоплазмы. Истинная амебовидность не характерна, иногда встречаются кольца с нежными длинными нитевидными утолщениями. Пигмент нежный необильный в виде одного или нескольких зерен серо-черного цвета	Взрослый трофозоит занимает 3/4 пораженного эритроцита. Округлой формы, без вакуоли. Ядро округлое или вытянутое. Пигмент в основном в виде одного, реже двух плотных скоплений темно-коричневого, почти черного цвета	В неразделившейся цитоплазме 2 до 6 - 12 (в среднем 8) мелких ядер. Пигмент в виде плотного скопления	12 - 24 (в среднем 18) мелких мерозоитов, сходных с P. vivax, но более мелких и расположенных асимметрично по отношению к пигменту	Полулунной формы с несколько заостренными полюсами. Ядро компактное, расположено в центре клетки. Пигмент грубый, в виде отдельных темно-коричневых зерен и коротких палочек. Цитоплазма окрашена интенсивно в сине-голубой цвет. Пигмент преимущественно концентрируется в зоне ядра. Превышает размер нормального эритроцита. В перекрашенном мазке различима оболочка эритроцита в виде розовой нити, натянутой между полюсами гаметоцита	Полулунной формы с закругленными полюсами, вогнутость выражена в меньшей степени, чем у женских. Ядро расположено в центре, рыхлое, крупнее, чем у женского гаметоцита, иногда без четких границ. Цитоплазма бледно-голубая с розовым оттенком. Пигмент - грубые зерна и палочки, диффузный. Могут обнаруживаться остатки оболочки эритроцита, так же как и у женского гаметоцита	Паразитемия у неимунных нарастает очень интенсивно. В ответе необходимо указывать, наряду с численностью, наличие разных стадий эритроцитарной шизогонии, что имеет прогностическое значение

Таблица 4

Plasmodium ovale в "тонком мазке" крови

Формы, обнаруживаемые в периферической крови	Морфологические особенности							Примечания
	Стадии развития бесполых форм (продолжительность эритроцитарной шизогонии - 48 ч)					Половые формы (гаметоциты)
	Юный трофозоит (кольцевидный)	Развивающийся трофозоит	Зрелый трофозоит	Развивающийся шизонт	Зрелый шизонт	Женский	Мужской
Все формы эритроцитарной шизогонии. Выраженная синхронность, обусловливающая однообразие определенных стадий развития. Паразитемия менее интенсивная по сравнению с P. vivax и P. falciparum. 6 - 8 тыс. паразитов в 1 мкл крови	Кольцевидные трофозоиты сходны с P. vivax и в большей степени с Р. malariae Ядро более крупное, как у Р. malariae иногда "вдавлено" в вакуоль	Амебовидный трофозоит занимает 1/2 - 2/3 эритроцита. Долго сохраняет форму кольца. Псевдоподии выражены слабо. Ядро и цитоплазма сходны с P. malariae. Пигмент нежный, диффузный	Взрослый трофозоит занимает 2/3 пораженного эритроцита, форма округлая, чаще вытянутая. Край паразита неровный. Ядро и цитоплазма сходны с P. malariae. Пигмент нежный, обильный, начинает группироваться в отдельные скопления	Сходны с P. malariae. однако пигмент более нежный, его скопления в основном расположены асимметрично. При рецидиве может быть 10 - 14 ядер	Сходны с P. malariae. При рецидиве количество мерозоитов до 10 - 14	Сходны с P. vivax и P. malariae, однако меньшего размера, чем у P. vivax и несколько крупнее, чем у P. malariae	Сходны с P. vivax и P. malariae, однако меньшего размера, чем у P. vivax и несколько крупнее, чем у P. malariae	Заражение P. ovale может наступить только при пребывании в тропической Африке. Начиная со стадии развивающегося трофозоита. а также гаметоциты. меньшего размера, чем соответствующие формы P. vivax. занимают часть пораженного эритроцита

Таблица 5

Plasmodium malariae в "тонком мазке" крови

Формы, обнаруживаемые в периферической крови	Морфологические особенности							Примечания
	Стадии развития бесполых форм (продолжительность эритроцитарной шизогонии - 48 ч)					Половые формы (гаметоциты)
	Юный трофозоит (кольцевидный)	Развивающийся трофозоит	Зрелый трофозоит	Развивающийся шизонт	Зрелый шизонт	Женский	Мужской
Все формы эритроцитарной шизогонии. Выраженная синхронность, обусловливающая однообразие определенных стадий развития. При приготовлении "тонкого мазка" трофозоит может вытягиваться по отношению к диаметру эритроцита, так называемые "лентовидные формы", различающиеся по широте в зависимости от возраста трофозоита	Сходны по размеру с P. vivax. Чаще правильной кольцевидной формы без утолщения цитоплазмы. Могут быть вытянуты по диаметру эритроцита узкой лентой. Ядро при сохранении кольцевидной формы обычно расположено на периферии цитоплазмы, иногда "вдавлено" в вакуоль - форма, напоминающая "птичий глаз", образуется при приготовлении "тонкого мазка"	Амебовидная форма, характерная для P. vivax, нетипична. Иногда встречаются клетки с не резко выраженной широкой псевдоподией. Паразит относительно быстро принимает округлую форму, различающуюся по размеру, в зависимости от возраста. В сравнении с P. vivax ядро более рыхлое, большего размера, окрашено более ярко, цитоплазма окрашена в более интенсивный голубой цвет. Пигмент более интенсивный в виде относительно грубых зерен коричневого цвета, диффузно расположенных в цитоплазме. Лентовидные формы различны по ширине, в зависимости от возраста паразита	Отличается от предыдущей возрастной стадии более крупным размером, занимает почти весь эритроцит, более крупным и рыхлым ядром; пигмент частично концентрируется по периферии и начинает группироваться	В неразделившейся цитоплазме 2 до 6 - 12 (в среднем 8) ядер, более крупных, чем у P. vivax и чаще неправильной формы. Пигмент концентрируется в отдельные скопления	Занимает почти весь или весь эритроцит. 6 - 12 (в среднем 8 мерозоитов), расположенных симметрично по отношению к пигменту, собранному в одно плотное скопление, более крупное и имеющее более интенсивную окраску в сравнении с P. vivax. так называемая "розетка" или "маргаритка". Мерозоиты крупнее, чем у P. vivax, с более крупным ядром и более выраженной цитоплазмой	В сравнении с P. vivax - меньшего размера, занимает весь пораженный эритроцит, но такие же по форме, цитоплазма и ядро окрашены более интенсивно, пигмент более обильный и грубее	В сравнении с P. vivax - меньшего размера, но такие же по форме, занимает весь пораженный эритроцит	Паразитемия менее интенсивная в сравнении с P. vivax и P. falciparum. Все стадии не превышают размера эритроцита

Таблица 6

Основные дифференциально-диагностические признаки возбудителей малярии человека в "толстых каплях", окрашенных по Романовскому

Вид	Паразиты				Пораженные эритроциты
	Кольца	Трофозоиты разного возраста	Шизонты	Гаметоциты
P. falciparum	Мелкие, часто разорвана цитоплазма. Обычные формы: "восклицательный знак", "комета", "ласточка", подковообразные с двумя глыбками хроматина. Тенденция к большому числу мелких трофозоитов одного возраста. Крупные, часто с несимметричным утолщением цитоплазмы, в которой различимы единичные зерна пигмента	Мелкие, компактные, в цитоплазме ясно различима крупная кучка черного пигмента. Обнаруживаются в периферической крови только при злокачественном течении, сопровождающемся нарушением микроциркуляции и иногда у паразитоносителей	Мельче, чем у других видов, содержат в среднем 20 мерозоитов	Полулунной формы, вогнутость не всегда выражена. В центральной части цитоплазмы отчетливо выявляется венчикообразное скопление пигмента	Содержащие мелкие кольца не сохраняются. Содержащие крупные кольца и иногда сохраняются. При этом может быть заметна пятнистость Маурера. Около гаметоцитов, прилегая к ним, иногда лежит обрывок оболочки эритроцита в виде розово-красного "язычка'"
P. vivax	Цитоплазма обычно разорвана, иногда имеет форму восклицательного знака, занятой. Тенденция к меньшему числу и более крупному размеру, чем у P. falciparum	Разнообразной формы и размера. Цитоплазма обычно разорвана, в зависимости от возраста паразита около ядра концентрируются 2 и более фрагментов цитоплазмы. Иногда сохраняется большая вакуоль	Сохраняют особенности "тонкого мазка"	Округлые, компактные. Макрогаметоциты не всегда отличимы от трофозоитов, подготавливающихся к делению. Микрогамонты легко распознаются по крупному ядру	Могут сохраняться, в особенности на периферии капли, в виде розового диска. Иногда в них различима зернистость Шюффнера
P. malariae	То же. Обнаруживаются реже, чем другие стадии	Меньших размеров, чем P. vivax. Компактные, округлые, разного размера в зависимости от возраста	Часто сохраняют форму "розетки"	Мельче, чем P. vivax. Компактные, почти неотличимы от взрослых трофозоитов	Не сохраняются
P. ovale	Так же, как для P. vivax. Крупные ядра. Во время приступа преобладают в препарате	Очень сходные с P. malariae	Сохраняют особенности "тонкого мазка"	То же	Сохраняются чаще и мельче, чем пораженные P. vivax. Окрашены обычно в интенсивно розовый цвет, различима зернистость Джеймса

Таблица 7

Состояние эритроцитов, пораженных малярийными паразитами, в "тонком мазке" крови

Вид паразита	Размер эритроцита и интенсивность окраски	Форма эритроцита	Азурофильная зернистость
P. vivax	Резко увеличены, тем больше, чем старте паразит; по мере развития паразита, эритроцит обесцвечивается	Сферическая или неправильная	Мелкая, обильная, неравномерная, ярко-красная зернистость Шюффнера
P. malariae	Не увеличены, иногда даже сжаты и могут быть темнее окрашены	Такая же, как у непораженных эритроцитов	Выявляется при специальном приготовлении рабочего раствора краски (рН = 7,6 - 7,8), окрашивается в сине-фиолетовый цвет - зернистость Цимана. Диагностическое значение имеет только при отсутствии других дифференциальных признаков
P. ovale	Увеличены, но в меньшей степени, чем пораженные P. vivax: обесцвечивание - как при P. vivax	В тонких участках мазка часто вытянутые, овальные с бахромчатым краем. В толстых участках сферические или "звездчатые"	Крупная, равномерная, менее обильная, чем в эритроцитах, пораженных P. vivax - зернистость Джеймса
P. falciparum	Не увеличены	Не изменена; иногда краевая зона "зубчатая"	В эритроцитах, содержащих мелкие кольца - отсутствует. В эритроцитах, содержащих крупные кольца и последующих возрастных стадиях обнаруживаются отдельные включения, более крупные и более темной окраски в сравнении с наблюдаемым при заражении эритроцитов P. vivax и P. ovale пятнистость Маурера