Методические указания МУК 3.2.987-00 "Паразитологическая диагностика малярии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 19 октября 2000 г.) (не действует)

3.2. Профилактика паразитарных заболеваний

Методические указания МУК 3.2.987-00
"Паразитологическая диагностика малярии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 19 октября 2000 г.)

Дата введения 1 января 2001 г.

Введены впервые

ГАРАНТ:

Взамен настоящих методических указаний Роспотребнадзором, Главным государственным санитарным врачом РФ 22 сентября 2014 г. утверждены Методические указания МУК 4.2.3222-14 "Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов"

1. Область применения и нормативные ссылки

Паразитологическую лабораторную диагностику малярии проводят клинико-диагностические лаборатории лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) системы Минздрава, ведомственных учреждений, а также другие лаборатории, независимо от принадлежности и форм собственности (НИИ, вузов, Минобороны, УВД, частных клиник и т.д.), имеющие лицензию и аккредитованные в системе госстандарта и Госсанэпиднадзора в установленном порядке.

Органы и учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации организуют и проводят эпидемиологический надзор за малярией, частью которого является:

- контроль за уровнем лабораторной диагностики малярии в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и других ведомств (в т.ч. исследования: 1) контрольные - не менее 10% препаратов крови, от числа отрицательных; 2) обязательные - 100% сомнительных и положительных препаратов крови с целью подтверждения лабораторного диагноза малярии);

- обследование населения в очагах малярии, обследование населения по эпидпоказаниям и с консультативной целью.

- В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативно-методические и правовые документы.

- Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (30 марта 1999, N 52-ФЗ).

- "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" (22 июля 1993, N 5487-1).

- Санитарные правила и нормы 3.2.569-96 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации".

- Санитарные правила 3.1/3.2.558-96 "Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний".

- Санитарные правила 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами 3 - 4 групп патогенности и гельминтами".

2. Общие положения

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных и местных случаев заболевания требуют своевременной лабораторной диагностики, необходимой для адекватного лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.

Малярию человека вызывают 4 вида паразитических простейших рода Plasmodium: P. falciparum - возбудитель тропической малярии, P. vivax - трехдневной малярии, P. ovale - малярии типа трехдневной, P. malariae - четырехдневной малярии. Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера: географический анамнез (пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера: лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки и ряд других - обязывают врачей лечебно-профилактических учреждений заподозрить малярию.

Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

3. Характеристика развития малярийного паразита в эритроцитах

Проявления малярии обусловлены развитием паразита в эритроците - так называемой эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии образуются бесполые и половые формы паразита.

Бесполые формы за период времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития, строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные свойства) хорошо различимы в "тонком мазке" крови. Трофозоиты - одноядерные растущие стадии: кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые. Шизонты - делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые), с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые, представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с обособленными ядрами и цитоплазмой. В динамике эритроцитарная шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит, внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется - кольцевидный трофозоит. На этой стадии цитоплазма имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки. По мере роста паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся по форме и числу, псевдоподии - образуется амебовидный трофозоит. В дальнейшем у развивающегося трофозоита постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и количество цитоплазмы - образуется зрелый трофозоит. Зрелый трофозоит - округлая или несколько вытянутая клетка с относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита. Затем наступает стадия шизонта, начинается попарное деление ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь вокруг каждого из дочерних ядер - образуется зрелый шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для каждого вида плазмодиев (см. таблицы). При отсутствии или неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты, и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев продолжительностью развития одной генерации. У P. falciparum, P. vivax, P. ovale - 48 ч, P. malariae - 72 ч.

В процессе роста паразита в его цитоплазме появляется малярийный пигмент - продукт метаболизма гемоглобина, представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от золотисто-коричневого до черного цвета. Количество пигмента, размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются по мере его перехода в последовательные стадии развития.

У части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются в половые формы, гаметоциты - женские (макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты). Мужские и женские гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли, характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом. Округлая форма присуща гаметоцитам P. vivax, P. ovale и P. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) - P. falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем бесполых форм. При этом женских гаметоцитов в 3 - 5 раз больше, чем мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты P. vivax, P. ovale, P. malariae значительно отличаются от гаметоцитов P. falciparum по срокам созревания, появления в периферической крови и сохранения способности заражать переносчика (самок комара P. anopheles).

P. vivax, P. ovale и P. malariae развиваются в эритроцитах, циркулирующих в периферической крови. Развитие P. falciparum происходит в синусах селезенки и мелких капиллярах внутренних органов в связи с адгезией пораженных эритроцитов к стенкам таких капилляров. В периферической крови обнаруживаются, преимущественно при неосложненном течении, только самые молодые стадии - кольцевидные трофозоиты. Их число очень быстро нарастает, поэтому при однократном исследовании периферической крови в начале болезни можно получить неправильное представление об истинном числе паразитов. При осложненном течении в периферической крови могут быть обнаружены более зрелые возрастные стадии паразита и гаметоциты в связи с нарушением сосудистого тонуса.

При оценке результатов исследования препаратов крови, наряду с типичной морфологией возбудителя, необходимо учитывать ряд особенностей, характеризующих паразитологическое развитие инфекции собственно и привходящих воздействий (предшествовавшее применение противомалярийных препаратов, неправильное приготовление и окраска препаратов крови).

4. Принцип метода паразитологической диагностики малярии

Паразитологическая диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно только в период его развития в эритроците. Для обнаружения плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом "тонкого мазка" и "толстой капли", окрашенные по Романовскому-Гимза. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.

Основной метод - "толстая капля". Благодаря распределению относительно большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30 - 40 раз большее, чем в "тонком мазке", что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии. Начинать надо всегда с просмотра "толстой капли".

Чувствительность метода "толстой капли" такова, что при просмотре 100 - 150 полей зрения можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови. Концентрация исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы, "толстую каплю" окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации. Несмотря на определенную специфичность, такая деформация иногда может препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром "толстой капли" можно только, если вид паразита был первоначально установлен. "Толстая капля" относительно быстро позволяет выявить и других паразитов крови: трипаносом, микрофилярий, спирохет, бабезий и др. Отрицательный паразитологический результат изучения "толстой капли", но повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов позволяет предположить перенесенную недавно малярию (при отсутствии соответствующих анамнестических данных), обнаружение повышенного содержания лейкоцитов, их видовой состав, а также повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов, позволяют предположить иное заболевание, не связанное с малярией.

В "тонком мазке", фиксированном до окраски, сохраняются морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и присущие данному виду паразита. Большое значение для дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных эритроцитов. "Тонкий мазок" крови делают в дополнение к "толстой капле". В тех случаях когда вид возбудителя в очаге установлен, для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом "толстой капли".

5. Необходимые реактивы и оборудование

1. Этиловый спирт 96°.

2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска).

3. Метиленовый синий.

4. Этиловый эфир.

5. Глицерин.

6. Тетраборат натрия (бура).

7. Калий фосфат однозамещенный безводный - КН2Р04.

8. Натрий фосфат двузамещенный безводный - Na2HP04.

9. Смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в равных частях).

10. Дистиллированная вода.

11. Индикаторная бумага (диапазон рН 5,0 - 8,0).

12. Фильтровальная бумага.

13. Химическая посуда: мерные цилиндры или стаканы на 10, 50 и 100 мл; градуированные центрифужные пробирки; колбы и стаканы; стеклянные палочки.

14. Предметные стекла

15. Шлифованные стекла.

16. Фарфоровая ступка с пестиком.

17. Аптечные равноплечие или электронные весы.

18. Эмалированные кюветы.

19. Пинцеты.

20. Часы песочные или сигнальные.

21. Стеклянные мостики или специальные контейнеры для окрашивания препаратов крови.

22. Скарификаторы стерильные одноразовые.

23. Бинты стерильные, вата.

24. Перчатки резиновые.

25. Микроскоп с осветителем (объективом х 90 или х 100, окуляром х 7; х 10).

26. Термостат.

27. Холодильник.

6. Техника паразитологической диагностики

6.1. Подготовка предметных стекол

1. Предметные стекла новые замачивают в мыльном растворе, нагревают до 60 - 80°С, но не кипятят.

2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной воде в течение 2 - 3 ч, периодически перемешивая.

4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин.

5. Проверяется качество отмывки предметных стекол от щелочи: на предметное стекло наносят 1 каплю фенолфталеина - появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6. Стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло), где они могут храниться в течение длительного времени.

7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной стиранной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую (!) бумагу небольшими партиями и стерилизуют.

Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать не рекомендуется. При необходимости их использования, следует удалить следы иммерсионного масла простиранной ветошью, затем отмыть каждое стекло от окрашенных препаратов крови в теплом мыльном растворе (для этой цели удобно использовать зубную щетку с коротко срезанной щетиной). Дальнейшая обработка -такая же, как и новых стекол.

________________________________________________________________________

          Во время манипуляций с чистыми предметными стеклами

      их следует брать только за боковые поверхности или пинцетом.

________________________________________________________________________

6.2. Приготовление и хранение реактивов

6.2.1. Раствор краски Романовского-Гимза

Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленный или приготовленный из сухой субстанции) представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить длительное время в хорошо закупоренных бутылях из темного стекла в сухом защищенном от света прохладном месте (но не в холодильнике). Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимза необходимое количество маточного раствора краски, отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя, т. к. при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Краску следует набирать сухой пипеткой или отливать через горлышко. Для определения качества краски рабочим раствором каждой новой серии производят пробное окрашивание мазков крови.

Для приготовления маточного раствора из сухой краски Романовского-Гимза необходимы следующие реактивы:

- азур-эозин - 10 г.;

- глицерин - 100 мл.;

- спирт этиловый 96° - 900 мл.

Техника приготовления краски предусматривает следующие этапы:

1. Азур-эозин тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством спирта и глицерина до получения кашицеобразной массы и сливают в колбу или бутыль из темного стекла. Затем постепенно добавляют остальной спирт и глицерин.

2. Полученную взвесь тщательно встряхивают в течение 10 мин 2 - 3 раза.

3. Емкость с краской помещают в термостат при температуре 37° на 3 - 5 дней для созревания краски с ежедневным встряхиванием этой емкости вручную не менее 10 мин. При наличии магнитной мешалки встряхивание можно продолжать несколько часов. При наличии подогревателя в мешалке взвесь можно подогревать, при этом подогрев не должен превышать 40 - 50°, периодически подогреватель следует выключать с тем, чтобы температура не повышалась выше указанного уровня. Встряхивание и подогрев улучшают качество краски.

После каждого встряхивания раствор снова помещают в термостат.

4. Через 3 - 5 дней готовый раствор краски фильтруют через бумажный фильтр.

6.2.2. Буферный раствор

Необходимые реактивы:

1. Дистиллированная вода - 1 л.

2. Фосфат калия однозамещенный безводный - КН2РО4 - 0,27 г.

3. Фосфат натрия двузамещенный безводный - Na2HPО4 - 0,67 г.

Техника приготовления:

1. Соли растворить в дистиллированной воде (1/3 объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1000 мл и размешать.

2. Приготовленный раствор должен иметь рН 7,0 +- 0,2. Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если рН < 6,8, то следует добавить Na2HPО4, если рН > 7,2, то добавляется КН2РО4. Количество реактивов, необходимых для доведения рН, подбирается опытным путем.

Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Для приготовления краски используется буферный раствор комнатной температуры. Нельзя использовать буферный раствор с осадком, который после окраски затрудняет просмотр препарата и даже может привести к диагностическим ошибкам. Периодически следует проверять рН буферного раствора, особенно при искажении цвета окрашенных элементов крови.

6.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

1. Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых - обычно безымянного, у детей - из большого), у новорожденных детей - из большого пальца ноги (но не мочки уха).

2. Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений.

3. Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы.

4. В целях безопасности пациента взятие крови на малярию производят на стерильные предметные стекла, т.к. во время взятия крови возможно их касание к месту прокола.

5. Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70%-ном спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии.

6. Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы избежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу.

7. Последующие капли (выступающие самостоятельно или при надавливании на палец массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. При этом кровь забирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла. Если кровь набирают в капилляр, то можно использовать не стерильные стекла, но подготовленные так же, как описано в п. 6.1.

8. От одного пациента готовят не менее 2 - 3 стекол с "толстыми каплями" и 2 - 3 "тонких мазка" крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, с тем чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.

________________________________________________________________________

     При косвенных показаниях (анамнестических, эпидемиологических,

     клинических) о наличии малярии у обследуемого, но отрицательном

   первичном результате, кровь исследуют повторно через каждые 6 - 12

                       часов в течение 2-х суток.

________________________________________________________________________

6.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

6.4.1. Препарат "толстая капля"

1. Препарат "толстая капля" на предметном стекле без мазка (рис. 1):

- на предметное стекло наносят каплю крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют в равномерный диск или прямоугольник размером 1 - 1,5 см.

- на краю стекла делается мазок в виде полоски крови для маркировки препарата, при массовых обследованиях делаются две полоски, где наносят маркировку.

2. Препарат "толстая капля" на мазке (рис. 2):

- на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый для исследования на малярию;

- сразу после приготовления мазка, пока мазок не высох, его влажной поверхностью прикасаются к выступившей капле крови или наносят кровь из капилляра;

- кровь на влажном мазке распределится в равномерный диск при осторожных наклонах предметного стекла под небольшим углом в разные стороны; чем больше взятая капля крови, тем больше площадь, по которой она распределится.

Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло. Толщина "толстой капли" должна быть такой, чтобы через нее просматривался печатный текст. Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат непригоден для исследования.

Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в "толстой капле" является обнаружение в 1 поле зрения микроскопа в среднем 10 - 15 лейкоцитов (увеличение: объектив х 90 - 100, окуляр х 7).

3. Комбинированные препараты (рис. 3).

В целях экономии стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят "тонкий мазок" и "толстую каплю".

Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходима четкая последовательность их обработки. Необходимо, начинать с окраски "толстой капли" погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют "тонкий мазок" и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации "тонкого мазка", т.к. даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен "тонкий мазок", в "толстой капле" эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной.

Все препараты высушивают на воздухе. Для ускорения высыхания "толстых капель" можно использовать обычный комнатный вентилятор.

________________________________________________________________________

         Высушивание на солнце, огне или любом другом источнике

             тепла исключается, так как препарат становится

                     непригодным для исследования.

________________________________________________________________________

Особенно это относится к "толстой капле", которая под действием тепла подвергается аутофиксации и необходимый гемолиз при окраске не наступает. "Толстые капли" (особенно в процессе высыхания) и фиксированные "тонкие мазки" следует беречь от тараканов, мух и муравьев, съедающих кровь.

6.4.2. Препарат "тонкий мазок" (рис. 4)

1. На край предметного стекла, отступив 0,5 - 1 см, наносят небольшую каплю крови (объемом меньше в 5 - 10 раз, чем для препарата "толстая капля").

2. Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа*.

3. Двумя пальцами левой* руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе.

4. Край шлифованного стекла (фиксированного в правой* руке) ставится под углом 45° к предметному стеклу, прикасаясь к левому* краю капли крови.

5. После того как капля растекается по касательной линии в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево* к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить "тонкий мазок" бахромчатой частью, где наиболее четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить до конца и краев предметного стекла, заканчиваться бахромчатым краем (рис. 4).

Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это маскирует некоторых паразитов, а также приводит к их деформации); если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка. Качество "тонкого мазка" зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла.

На плохо вымытом жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла "тонкий мазок" получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис. 5.

6.4.3. Маркировка препаратов крови

1. Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания).

2. Маркировка включает фамилию и инициалы или номер истории болезни (можно номер страхового полиса), или порядковый номер по списку обследуемого и, обязательно, дату взятия крови.

3. Препарат "толстая капля", приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4. Препарат "толстая капля" на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.

5. "Тонкий мазок" маркируют в толстой части (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

6.4.4. Фиксация "тонких мазков"

1. Фиксацию мазков проводят: в этиловом спирте 96% - 10 мин или в смеси Никифорова - 20 мин.

2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.

Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

________________________________________________________________________

                 Препарат "толстая капля" не фиксируют!

________________________________________________________________________

При длительном хранении (особенно в жарком климате) неокрашенных "толстых капель" может произойти их аутофиксация. При необходимости хранения "толстых капель" для предотвращения аутофиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г Na2HPО4 + 1 г КН2РО4 + 300 мл дистиллированной воды). "Толстую каплю" после высыхания погружают в этот раствор на 1 секунду, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием окрашивают по Романовскому меньше, чем обычное время - в течение 6 - 10 минут.

6.5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови.

6.5.1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского-Гимза

Для окрашивания препаратов крови используется 5% или 10% водный рабочий раствор краски Романовского-Гимза.

1. Маточный раствор краски Романовского-Гимза (промышленного изготовления или приготовленный из сухой краски) перемешать и обязательно профильтровать.

2. Приготовить 5%-ный (10%-ный) рабочий раствор краски: к 95 (90) мл буферного раствора добавить 5 (10) мл маточного раствора краски, что соответствует 1 - 2 каплям краски на 1 мл раствора.

3. Готовый рабочий раствор перемешать.

4. При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20%-ный раствор, сократив время окраски до 15 - 20 мин.

________________________________________________________________________

              Рабочий раствор для окраски препаратов крови

                использовать только свежеприготовленный!

________________________________________________________________________

Качество каждой новой серии краски необходимо оценить. С этой целью производят пробную окраску препаратов "тонкого мазка" и "толстой капли" крови от здорового человека (если нет крови с малярийными паразитами). Концентрацию рабочего раствора и время окрашивания можно подобрать самостоятельно, т.к. они зависят от качества исходного раствора краски и от температуры окружающей среды.

Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроскопии:

- ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с различимой структурой;

- зернистость базофилов фиолетового цвета;

- зернистость эозинофилов красного цвета;

- у моноцитов на фоне серо-голубой цитоплазмы может быть розовая зернистость;

- зрелые эритроциты - розового цвета с сероватым оттенком;

- ретикулоциты - сиренево-голубые;

- тромбоциты - сиренево-розового цвета с различимой сетчатостью.

Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского недостаточно азура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов и лейкоцитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мансона, которую готовят впрок следующим образом: 1,5 г метиленового синего и 2,5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10 - 12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40 - 60 мин при 60 - 80°.

________________________________________________________________________

                          Раствор не кипятить!

________________________________________________________________________

Синька Мансона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мансона, добавляемое к рабочему раствору краски Романовского, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

6.5.2. Способы окрашивания и промывки "тонкого мазка" и "толстой капли" по Романовскому-Гимза

Окрашивание препаратов крови можно проводить двумя способами.

1. Препараты крови вертикально помещают в специальные ванночки или контейнеры, без соприкосновения друг с другом. Затем наливают рабочий раствор краски. Данный способ наиболее приемлем, когда есть необходимость окраски большого количества препаратов крови. В стандартном контейнере можно окрасить 20 препаратов при вместимости 90 мл краски. Повторно использовать краску не следует.

2. Препараты располагают горизонтально (мазками вверх) на стеклянных рельсах, лежащих на кюветах. Осторожно пипеткой, так чтобы краска полностью покрывала мазок или толстую каплю, наносят краску. Этот способ чаще применяют при окрашивании небольшого количества препаратов крови. Расход краски составляет примерно 4 мл на 1 препарат.

Данный способ окраски требует тщательной фильтрации маточного раствора краски, т.к. есть вероятность выпадения осадка на препарат крови, что приведет к трудности в диагностике кровепаразитов при микроскопии.

Время окрашивания зависит от температуры окружающей среды. При температуре 20 - 23° "тонкий мазок" окрашивают - 40 - 50 мин, "толстую каплю" - 20 - 25 мин. При более низкой температуре - время окрашивания увеличивают. При очень высокой температуре (около 30°) время окрашивания капель, но не мазков, может быть сокращено до 15 мин. "Толстые капли", предварительно обработанные забуференным раствором метиленового синего, окрашивают 6 - 10 мин.

________________________________________________________________________

      При подозрении на малярию препараты крови помечаются "CITO!"

                Окрашиваются и исследуются немедленно.

________________________________________________________________________

Ошибки при окраске препаратов крови и способы их устранения приведены в табл. 1 прилож. 1.

Способ промывки "тонких мазков", фиксированных до окраски, - под струей проточной воды, из пипетки или погружением в емкость, не имеет значения, важно только не обесцветить препарат.

При промывке "толстых капель", особенно свежеприготовленных, необходима осторожность, т. к. капли могут оторваться от стекла. Препарат медленным движением погружают в емкость с дистиллированной водой 1 - 2 раза.

6.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

Препараты крови исследуют под микроскопом с применением масляной иммерсии: объектив х 90 или х 100, окуляр х 7.

Сначала микроскопируют "толстую каплю", затем для уточнения вида возбудителя - "тонкий мазок".

________________________________________________________________________

       При низкой паразитемии исследование только "тонкого мазка"

               может привести к гиподиагностике малярии.

________________________________________________________________________

В "толстой капле" паразиты распределены неравномерно. Поэтому проводят перекрестный просмотр 200 - 300 полей зрения препарата. Целесообразно также обратить внимание на краевую зону, более тонкую часть "толстой капли", где эритроциты могут располагаться в 1 слой, и может выявляться не только относительно неизмененная морфология паразита, но и пораженного эритроцита. Если вероятность малярии у пациента велика, а паразиты не выявляются, рекомендуется не увеличивать время просмотра той же самой капли, а просмотреть вторую каплю.

Препарат считается отрицательным, если паразиты не обнаружены после просмотра 200 - 300 полей зрения "толстой капли".

После первого обнаружения паразитов исследование продолжают, чтобы:

- определить видовую принадлежность паразитов;

- не пропустить смешанную инфекцию;

- указать, какие стадии паразитов найдены;

- указать наличие или отсутствие гаметоцитов, что имеет важное прогностическое значение в случае тропической малярии;

- указать количество паразитов, руководствуясь одним из предлагаемых в п. 8 методов.

В "тонком мазке" для обнаружения малярийных паразитов исследуют участок, где эритроциты расположены в один слой - бахромчатую и прилегающую к ней зону - так называемый хвост препарата. Паразиты имеют тенденцию сосредоточиваться также на краях препарата.

При просмотре "тонкого мазка" используется метод "зубчатая стена": просмотр края мазка последовательными вертикально-горизонтальными передвижениями препарата.

________________________________________________________________________

     Отрицательный диагноз, поставленный только по "тонкому мазку",

                        считается недостоверным.

________________________________________________________________________

7. Критерии определения вида паразита

Определение вида основано на совокупности ряда признаков как самого паразита, так и пораженного эритроцита.

7.1. Классические морфологические признаки малярийных паразитов и пораженных эритроцитов

Для установления видовой принадлежности малярийных паразитов имеет значение следующее: наличие полиморфизма возрастных стадий или одной ведущей, их сочетание с гаметоцитами; морфология разных возрастных стадий, их размеры по отношению к пораженному эритроциту; характер, размер ядра и цитоплазмы; интенсивность пигмента, его форма, размеры зерен/гранул; количество мерозоитов в зрелых шизонтах, их размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента; склонность паразита к поражению эритроцитов определенного возраста (тропизм); склонность к множественному поражению отдельных эритроцитов несколькими особями паразитов и его интенсивность; размеры пораженных эритроцитов по отношению к непораженным, форма пораженных эритроцитов, наличие азурофильной зернистости в пораженных эритроцитах; форма гаметоцитов.

Основные дифференциально-диагностические признаки возбудителей малярии указаны в прилож. 1 (табл. 2 - 7) и прилож. 2 (рис. 1 - 4).

7.2. Непостоянство некоторых морфологических признаков

В периферической крови у паразитоносителей P. falciparum и при рецидивах этой инфекции, связанных с лекарственной устойчивостью, встречаются более крупные кольца, что обусловлено определенной степенью иммунитета.

У эритроцитов, пораженных P. ovale, может отсутствовать характерная форма. В то же время, при инфекции P. vivax часть эритроцитов может иногда принимать форму, характерную для P. ovale. В некоторых случаях зрелый шизонт P. ovale имеет сходство с соответствующей стадией P. malariae не только по характеру и количеству мерозоитов в зрелом шизонте, но и по их расположению по отношению к скоплению пигмента. Неполный гемолиз эритроцитов, пораженных P. ovale, в "толстой капле", часто описываемый как характерный признак, не является постоянным и встречается также в каплях с P. vivax.

7.3. Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов, возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови

При медленном высыхании препарата в условиях повышенной температуры и влажности гаметоциты P. falciparum могут принимать округлую форму и быть ошибочно идентифицированы как гаметоциты других видов плазмодиев, для которых характерна округлая форма. В "тонких мазках" крови, преимущественно у паразитоносителей, могут встречаться крупные кольца P. falciparum, напоминающие лентовидные формы соответствующих стадий P. malariae, что, по-видимому, связано с их изменением в процессе приготовления мазка. Несоблюдение правил приготовления рабочего раствора краски Романовского-Гимза, окрашивания препаратов крови, подготовки предметных стекол могут дать ряд отклонений от классической картины (см. табл. 1 прилож. 1). При приготовлении краски на воде кислой реакции в "тонком мазке" не выявляется зернистость Шюффнера, в "толстой капле" это препятствует полному гемолизу не только пораженных, но и непораженных эритроцитов.

7.4. Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием химиотерапевтических препаратов

Нередко больные обращаются за медицинской помощью не при первых проявлениях малярии, а после приема химиотерапевтических препаратов, обладающих в разной степени противомалярийным действием. К их числу относятся препараты, обычно применяемые при малярийной инфекции и зачастую используемые больными для самолечения, а также сульфаниламидные препараты, антибиотики тетрациклинового ряда, которые применяют для самолечения, предполагая ОРЗ или тому подобные болезни, либо по назначению врачей в связи с неправильно поставленным диагнозом. Применение химиотерапевтических препаратов приводит к специфическим изменениям морфологии паразита. Эти изменения на начальных этапах воздействия лекарственного препарата могут затруднить идентификацию вида возбудителя, на более поздних этапах ввиду морфологической деградации паразита вовсе препятствовать установлению паразитологического диагноза малярии. Возникающие разнотипные повреждения ядра, цитоплазмы и их тинкториальных свойств, изменения состояния пигмента и т.д. при воздействии разных препаратов выявляются при окраске по Романовскому-Гимза. Они хорошо различимы, в первую очередь у P. vivax, P. ovale и P. malariae.

При воздействии хлорохина (делагила) у бесполых форм начальные различимые изменения возникают спустя 1 - 2 ч после начала лечения, прогрессивно нарастая. В первую очередь меняется характер пигмента: зерна пигмента собираются в отдельные скопления и затем исчезают из цитоплазмы. Ядро на всех возрастных стадиях подвергается пикнозу (уплотнению), наиболее выраженному у кольцевидных (юных) трофозоитов. Цитоплазма кольцевидных трофозоитов уплотняется вокруг ядра, и затем постепенно исчезает, начиная с периферии. После исчезновения цитоплазмы у юного трофозоита исчезает его ядро. Цитоплазма у развивающихся и зрелых трофозоитов вакуолизируется, истончается, в ней появляются множественные просветления; так же, как у кольцевидных трофозоитов, цитоплазма постепенно исчезает с периферии паразита. Половые формы, в сравнении с бесполыми формами, сохраняются после воздействия делагила еще 24 - 72 ч (кроме P. falciparum), постепенно деградируя. Женские гаметоциты P. vivax, P. ovale и P. malariae трудно отличить от зрелых трофозоитов этих видов паразита, однако в процессе их деградации после приема делагила клетка женского гаметоцита, в отличие от зрелого трофозоита, в меньшей степени подвергается деформации. Пигмент собирается в крупные гранулы, ядро становится более диффузным и приобретает более светлую окраску. Первоначально из цитоплазмы гаметоцита исчезает пигмент, затем ядро; сохраняется лишь истонченная цитоплазма с множественными просветлениями; затем исчезает и цитоплазма. Обнаружение половых форм, подвергшихся еще неполной морфологической деградации, может привести к неправильному суждению о продолжающемся развитии паразита.

При воздействии сульфаниламидов, тиндурина (пириметамин) и их комбинаций (фансидар, метакельфин), а также тетрациклинов наблюдается противоположный тип изменений морфологии паразита. Возрастает количество видимых зерен пигмента. Ядро становится диффузным, приобретает более светлую окраску, распределяется на отдельные массы хроматина и в последующие сроки исчезает из клетки паразита. Затем исчезает цитоплазма. Пигмент, лежащий на бесцветном фоне, исчезает последним. После воздействия этих препаратов из-за первоначальных изменений состояния ядра, цитоплазмы, характера и интенсивности пигмента P. vivax или P. ovale могут быть ошибочно диагностированы как P. malariae (естественно, если не будет принят во внимание характер пораженного эритроцита и возможность изменения морфологии паразитов в результате предшествовавшего воздействия указанных препаратов).

Приведенные примеры не исчерпывают всех возможных отклонений морфологии плазмодиев от классических признаков. Они лишь свидетельствуют о том, что для правильной идентификации вида возбудителя малярии необходим анализ паразитологической картины в целом, включающий оценку морфологии всех форм развития паразита в эритроцитах, выявляемых в конкретном препарате крови, а также состояние пораженных эритроцитов. При этом следует принять во внимание географический анамнез.

7.5. Источники диагностических ошибок

Иногда за малярийных паразитов ошибочно могут быть приняты нормальные и патологические элементы крови, а также различные контаминанты.

Наиболее часто симулируют паразита тромбоцит, лежащий на эритроците в "тонком мазке" либо в "толстой капле" на остатке ретикулоцита. Эритробласты или эритроциты с остатками ядра - тельца Жолли или кольца Кэбота также могут быть приняты за пораженные эритроциты.

Клетки бактерий, грибов, а также частицы краски, выпавшие в осадок и лежащие на эритроците, могут приводить неопытного исследователя к ложной диагностике малярии.

Иногда за гаметоциты P. falciparum принимают царапины на стекле - так называемый "хребет селедки", растительные клетки, жгутиковых простейших, которые могут размножиться в старом буферном растворе, особенно в жаркое время года.

Некоторые образования, симулирующие малярийных паразитов, изображены на рис. 5 прилож. 2.

8. Оценка интенсивности паразитемии

При оценке интенсивности паразитемии учитывают суммарно бесполые и половые формы за исключением P. falciparum. Интенсивность паразитемии оценивают одним из следующих методов.

8.1. Оценка интенсивности паразитемии по "толстой капле"

8.1.1. Определение числа паразитов в 1 мкл крови

Подсчитывается количество паразитов по отношению к определенному количеству лейкоцитов. При обнаружении 10 и более паразитов на 200 лейкоцитов подсчет заканчивается. При обнаружении 9 и менее паразитов на 200 лейкоцитов подсчет продолжают для определения количества паразитов на 500 лейкоцитов. При обнаружении единичных паразитов в "толстой капле" крови подсчитывают их количество на 1000 лейкоцитов.

Определение количества паразитов в 1 мкл крови проводится по следующей формуле:

                                    В

                            X = А х - , где

                                    С

Х - количество паразитов в 1 мкл крови,

А - подсчитанное количество паразитов,

В - количество лейкоцитов в 1 мкл крови данного больного,

С - подсчитанное количество лейкоцитов.

В тех случаях, когда нет возможности определить количес