Методические указания МУ 3.3.1.2075-06 "Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 11 июля 2006 г.)

3.3.1. Вакцинопрофилактика

Методические указания МУ 3.3.1.2075-06
"Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 11 июля 2006 г.)

Дата введения: с момента утверждения
Введены взамен методических указаний
"Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона",
утв. Госкомсанэпиднадзором РФ от 17 октября 1994 г. N 01-19/48-11

1. Область применения

Методические указания "Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона" разработаны в помощь специалистам научно-исследовательских учреждений, осуществляющих разработку и контроль вакцинных штаммов.

2. Общие положения

Возбудитель холеры относится к особо опасным микроорганизмам II группы патогенности. По данным ВОЗ (2001) наиболее перспективным путем совершенствования специфической профилактики холеры является создание живых оральных холерных вакцин. Потенциально вакцинные штаммы холерных вибрионов должны соответствовать строгим требованиям безопасности и специфической активности. Основной задачей настоящих методических указаний является изложение обязательных требований к штаммам холерного вибриона - кандидатам для изготовления живых вакцин, критериев оценки и методов исследования, основанных на информативных, хорошо изученных и широко применяемых, официально утвержденных тестах, позволяющих отобрать для последующих клинических испытаний безопасные и высоко иммуногенные штаммы холерного вибриона.

Для изготовления живой вакцины используют штаммы холерного вибриона, стабильно утратившие способность вызывать заболевание, но проявляющие остаточную вирулентность и способность "приживаться" до 3 суток в кишечнике человека и животных (кроликов).

3. Порядок проведения работ с вакцинными штаммами холерного вибриона

3.1. Все исследования со штаммами холерного вибриона, перспективными для отбора кандидатов в вакцинные, должны проводиться в "заразной" зоне лабораторий (СП 1.3.1285ф-03, п. 3.6) в отдельном микробиологическом боксе, где не хранят и не работают с ПБА I - IV групп патогенности. Отобранные авторами штаммы, соответствующие настоящим методическим указаниям, согласно "Классификации патогенных для человека микроорганизмов" (СП 1.2.036-95, прилож. 5.4) переводят в III группу патогенности. Лиофилизацию штаммов - кандидатов в вакцинные для государственных испытаний проводят на изолированном оборудовании и в изолированном помещении, где не хранят и не работают с ПБА I - IV групп патогенности, с вакцинными штаммами или изготавливают живые вакцины.

3.2. Разработчики (учреждения-авторы) передают лиофилизированные в ампулах штаммы - кандидаты в вакцинные (не менее 50 ампул) с отчетом о доклинических испытаниях в Государственную коллекцию патогенных бактерий (ГКПБ) РосНИПЧИ "Микроб" для организации государственных испытаний. Штаммы-кандидаты в вакцинные до завершения всех испытаний (доклинических и клинических) хранят в отдельном холодильнике в помещении лаборатории ГКПБ, где не проводится работа с ПБА. С момента начала доклинических государственных испытаний штаммы должны быть опечатаны двумя печатями: председателя государственной комиссии (или заместителя председателя) и представителя Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (ответственного за хранение). После завершения доклинических и клинических испытаний и признания штамма вакцинным (приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации) оставшиеся опечатанные ампулы должны быть переданы в Государственную коллекцию ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

3.3. Работу с зашифрованными испытуемым и контрольным эталонным вакцинным (при наличии такого) штаммами проводят как с микроорганизмами III группы патогенности (СП 1.3.1285-03).

3.4. Испытуемый и контрольный вакцинный штамм должны быть зашифрованы перед испытаниями специалистами, не принимающими участия в проведении испытаний.

3.5. Концентрацию клеток в микробных взвесях культур определяют по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-86П 5 единиц, эквивалентных 1,1 х 10(9) вибрионов в 1 мл или ОСО 42-28-85П 10 единиц, эквивалентных 2,2 х 10(9) вибрионов в 1 мл.

3.6. Требования к качеству лабораторных животных приведены в прилож. 12.

4. Идентификация штамма по видовым признакам

Возбудителями холеры являются микроорганизмы рода Vibrio, вида cholerae, серогрупп О1 классического и эльтор биоваров и О139 (табл. 1). К ним относятся грамотрицательные аспорогенные полиморфные палочки прямые или слегка изогнутые с одним полярно расположенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, декарбоксилирующие лизин и орнитин, но не расщепляющие аргинин, относящиеся по Хейбергу к 1 ферментативной группе, V. cholerae О1, агглютинирующиеся сыворотками холерными О1 и Огава или Инаба до титра или 1/2 титра, V. cholerae О139 - сывороткой до титра.

Методики определяемых показателей биохимических свойств испытуемого штамма с помощью бумажных систем для индикации микроорганизмов (СИБ), микротест-систем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V), микротестсистемы для ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х); агглютинабельности сыворотками диагностическими холерными О1, Инаба и Огава, RO и О139; лизабельности бактериофагами диагностическими классическим и эльтор, бактериофагами диагностическими холерными эльтор ctx(+) и ctx(-) изложены в соответствующих Инструкциях по применению препаратов, других дифференциальных признаков - в МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры".

ГАРАНТ:

Взамен МУ 4.2.1097-02 с 1 августа 2007 г. введены Методические указания МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры", утвержденные Главным государственным санитарным врачом РФ 31 мая 2007 г.

Таблица 1

Дифференциальные признаки Vibrio cholerae

	Признаки	Биовары V. cholerae О1		V. cholerae О139 серогруппы
		классический	эльтор
1.	Лизабельность холерными фагами:
	классическим	+	-	-
	эльтор	-	+	-
2.	Агглютинация куриных эритроцитов	-	+	+
3.	Чувствительность к 50 ед. полимиксина	+	-	-
4.	Образование ацетилметилкарбинола	-	+	+
5.	Морфология	изогнутая палочка
6	Подвижность	+		+
7.	Окраска по Граму	-		-
8.	Рост на обычных питательных средах	+		+
9.	Индофенолоксидаза	+		+
10.	Образование кислоты из Д-глюкозы в условиях:
	аэробных	+		+
	анаэробных	+		+
11.	Образование газа из Д-глюкозы	-		-
12.	Лизиндекарбоксилаза	+		+
13.	Орнитиндекарбоксилаза	+		+
14.	Аргининдегидролаза	-		-
15.	Образование кислоты из маннита	+		+
16.	Образование кислоты из инозита	-		-
17.	Образование кислоты из арабинозы	-		-
18.	Образование кислоты из сахарозы	+		+
19.	Образование кислоты из маннозы	+		+
20.	Агглютинабельность сыворотками:
	холерной О1	+		-
	холерной Инаба или Огава	+		-
	холерной RO	-		-
	холерной О139	-		+

5. Характеристика потенциальной опасности и безвредности штамма

5.1. Определение отсутствия функционально полноценного гена, кодирующего синтез холерного токсина

Основной симптомокомплекс заболевания холерой определяет продуцируемый вибрионом холерный экзотоксин (XT). Холерный токсин состоит из двух субъединиц - А и В. Токсические свойства XT определяются субъединицей А, иммуногенные свойства - субъединицей В.

Вакцинный штамм холерного вибриона не должен синтезировать токсин, содержать функционально полноценного гена, кодирующего синтез субъединицы А холерного токсина.

Отсутствие или повреждение гена, кодирующего синтез субъединицы А, должно быть подтверждено с помощью тест-системы для выявления ДНК V. cholerae ctxA методом ПЦР (отрицательный результат в ПЦР). Методика определения приведена в прилож. 1.

5.2. Определение отсутствия функционально полноценного гена, кодирующего синтез токсинкорегулируемых пилей адгезии

Токсинкорегулируемые пили адгезии (ТКПА) участвуют в колонизации тонкого кишечника и являются основным фактором вирулентности возбудителя холеры.

Вакцинный штамм холерного вибриона не должен синтезировать токсинкорегулируемые пили адгезии, содержать функционально активного гена tcpA, кодирующего синтез основной субъединицы ТКПА, или этот ген должен быть поврежден (отрицательный результат в ПЦР).

Отсутствие или повреждение гена, кодирующего субъединицу ТПКА проверяют с помощью тест-системы для выявления ДНК V. cholerae ctxA tcpA методом ПЦР. Методика определения приведена в прилож. 2.

5.3. Определение "остаточной" вирулентности и токсигенности

Кроме холерного экзотоксина холерный вибрион может продуцировать и некоторые другие токсические субстанции, имеющие, по сравнению с холерным экзотоксином, несравненно меньшее значение в патогенезе инфекции, но способные вызывать в ряде случаев диарейный синдром. Вакцинный штамм должен быть проверен на "остаточную" вирулентность и токсигенность по комплексу тестов in vivo и in vitro. К числу таких тестов относятся:

in vivo:

- определение вирулентности на модели кроликов-сосунков;

- определение "остаточной" токсигенности (выявление фактора сосудистой проницаемости и дерматонекротического фактора) в кожной пробе;

- определение "остаточной" токсигенности в лигированных петлях тонкого кишечника взрослых кроликов;

- определение "остаточной" токсигенности, реактогенности и приживаемости штамма при внутрижелудочном заражении взрослых кроликов.

in vitro:

- определение вирулентности по лизису бактериофагами диагностическими холерными эльтор ctx+ и ctx" и гемолитической активности.

5.3.1. Определение "остаточной" вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков

Вакцинный штамм должен быть авирулентным при введении в петлю тонкого кишечника крольчат-сосунков в дозах 10(5) и 10(7) вибрионов в объеме 0,2 мл: не вызывать заболевания, гибели крольчат и макроскопических изменений в кишечнике. Вакцинные штаммы холерного вибриона не должны вызывать у крольчат развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией других факторов патогенности.

Определение вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков проводят по методике, изложенной в МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры" и в прилож. 3.

5.3.2. Определение лизиса холерных эльтор вибрионов бактериофагами диагностическими холерными эльтор ctx(+) и ctx(-) и гемолитической активности

Вакцинный штамм V. cholerae eltor по лизабельности бактериофагами диагностическими холерными эльтор ctx(+) и ctx(-) должен быть эпидемически неопасным (авирулентным): не должен лизироваться бактериофагом диагностическим холерным эльтор ctx(+), может лизироваться или не лизироваться бактериофагом ctx(-); может быть гемолизположительным или гемолизотрицательным.

Определение вирулентности холерных вибрионов эльтор по лизису бактериофагами ctx(+) и ctx(-) проводят в соответствии с Инструкцией по их применению, гемолитической активности - согласно МУ 4.2.1097-02 "Лабораторная диагностика холеры" (табл. 2).

Таблица 2

Схема оценки эпидемической значимости (вирулентности) холерных эльтор вибрионов по тесту с бактериофагами ctx(+) и ctx(-) и гемолитической активности в соответствии с инструкцией по применению бактериофагов

Группы	Варианты	Гемолиз по Грейгу	Чувствительность к фагам		Оценка эпидемиологической значимости
			ctx(+)	ctx(-)
I	1	-	+	-	эпидемически опасны
II	2	-	-	-	для оценки эпидемической значимости необходимы дополнительные исследования на наличие генов ctxAB, tcpA или токсигенности на крольчатах-сосунках
	3	-	+	+
	4	+	+	+
	5	+	+	-
III	6	+	-	+	эпидемически неопасны
	7	+	-	-
	8	-	-	+

5.3.3. Определение "остаточной" токсигенности в кожной пробе

Вакцинный штамм должен быть нетоксигенным в кожной пробе - не вызывать кожной реакции в виде папул размером более 6 мм и зоны некроза 2 мм и более при внутрикожном введении взрослым кроликам по 0,1 мл взвеси вибрионов, содержащей в 1 мл 5 х 10(8) и более вибрионов.

Методика определения "остаточной" токсигенности штаммов холерного вибриона по выявлению фактора сосудистой проницаемости и дерматонекротического фактора в кожной пробе на взрослых кроликах приведена в прилож. 4.

5.3.4. Определение безвредности и "остаточной" токсигенности исследуемого штамма холерного вибриона при внутрикишечном введении кроликам-сосункам

Штаммы холерного вибриона, кандидаты в вакцинные, при внутрикишечном пассировании на крольчатах в дозе 1 х 10(7) вибрионов в объеме 0,2 мл не должны вызывать гибели животных или заболевания с проявлением диареи и скоплением жидкости в просвете тонкого и толстого кишечника (холерогенный синдром).

Методика определения безвредности и "остаточной" токсигенности холерного вибриона при внутрикишечном заражении кроликов-сосунков приведена в прилож. 5.

5.3.5. Определение "остаточной" токсигенности испытуемого штамма в лигированных петлях тонкого кишечника взрослых кроликов

Вакцинный штамм холерного вибриона при введении в лигированную петлю тонкого кишечника взрослого кролика массой 2,5 - 3 кг в дозах 1 x 10(7) и 1 х 10(9) вибрионов в объеме 1 мл не должен вызывать макроскопических изменений в петле кишечника, отличных от изменений в петле, в которую вводили 0,9%-й раствор натрия хлорида. Объем жидкости в петлях с вакцинным штаммом не должен превышать объем в петлях с физиологическим раствором.

Методика определения "остаточной" токсигенности холерного вибриона в лигированных петлях взрослых кроликов приведена в прилож. 6.

5.3.6. Определение безвредности, "остаточной" токсигенности и приживаемости исследуемого штамма при внутрижелудочном введении взрослым кроликам

Вакцинный штамм холерного вибриона при внутрижелудочном введении взрослым кроликам в дозах 5 х 10(7), 5 х 10(9) и 5 х 10(10) вибрионов не должен вызывать гибели животных. В посевах органов животных может наблюдаться рост холерного вибриона только из содержимого желудка, кишечника, желчного пузыря не дольше 28 дней с момента введения.

У взрослых кроликов массой 2,5 - 3 кг не должна развиваться диарея. В просвете кишечника должно быть минимальное количество обычного по консистенции содержимого (прилож. 7).

5.3.7. Определение реактогенности штамма по прижизненным наблюдениям при внутрижелудочном введении взрослым кроликам

Вакцинный штамм холерного вибриона не должен вызывать значительных прижизненных реактивных изменений у кроликов. Дозы 5 х 10(7) и 5 х 10(9) вибрионов не должны вызывать повышения температуры и снижения массы тела животного в течение 10 суток. В ответ на введение дозы 5 х 10(10) м.к. вакцинного штамма холерного вибриона у кроликов в течение пяти дней допустимо снижение массы тела. К 6 - 7 суткам после введения испытуемой культуры снижение массы животных не должно превышать 1/5 его первоначальной величины. Повышение температуры не должно быть выше, чем на 1 - 1,5°С (прилож. 7).

5.3.8. Определение безвредности штамма по морфологическим показателям

5.3.8.1. Морфологические изменения у кроликов-сосунков при внутрикишечном введении им исследуемого штамма холерного вибриона

Допустимо небольшое полнокровие серозной оболочки тонкого кишечника в области введения испытуемого штамма холерного вибриона.

При гистологическом исследовании толстого и тонкого кишечника допускается незначительный отек стромы ворсинок и их полнокровие, незначительная вакуолизация покровного эпителия и небольшое увеличение размеров бокаловидных клеток. В паренхиматозных внутренних органах допустимо развитие умеренных компенсаторных дистрофических изменений (зернистая дистрофия) и умеренное полнокровие.

Недопустимы резкое полнокровие стенки толстого и тонкого кишечника, резкий отек слизистой и подслизистой оболочек, наличие кровоизлияний, массивные некрозы покровного эпителия и резко выраженные дистрофические изменения во внутренних органах. Недопустимы морфологические признаки развития генерализации инфекционного процесса, обусловленного испытуемым штаммом холерного вибриона и обострением скрытой инфекции (прилож. 5).

5.3.8.2. Морфологические изменения у взрослых кроликов при введении в лигированные петли тонкого кишечника

Недопустимо развитие более выраженного, чем в контроле отека слизистой и подслизистой оболочек, наличие кровоизлияний и некроза покровного эпителия ворсин. Расстройства кровообращения стенок тонкого кишечника не должны превышать подобные изменения в контроле.

Методика определения токсигенности холерного вибриона в лигированных петлях взрослых кроликов приведена в прилож. 6.

5.3.8.3. Морфологические изменения у взрослых кроликов при внутрижелудочном введении исследуемого штамма холерного вибриона

Макроскопическая картина. На серозной и в слизистой оболочках кишечника не должно быть кровоизлияний. Поверхность слизистой оболочки кишечника должна выглядеть бархатистой без признаков воспаления. Пейеровы бляшки не должны быть редуцированы. Во внутренних органах недопустимо развитие резких дистрофических изменений паренхиматозных элементов (доходящих до стадии некроза), недопустимы резкие расстройства кровообращения (значительный отек, кровоизлияния).

Допустимые гистологические изменения. Умеренное полнокровие внутренних органов, слизистой и подслизистой оболочек толстого и тонкого кишечника, небольшая инфильтрация стромы ворсинок мононуклеарами. Умеренное увеличение количества бокаловидных клеток в эпителиальном пласте слизистой оболочки тонкого кишечника. Умеренные гиперпластические процессы в лимфоидной ткани кишечника и вторичных лимфоидных органах. Умеренные дистрофические изменения паренхиматозных органов.

Недопустимые гистологические изменения. Выраженное полнокровие и стаз крови в расширенных сосудах миокарда, почек, печени, легких. Значительные дистрофические процессы в печени, вплоть до дискомплексации печеночных балок. В почках - зернистая дистрофия, доходящая до гибели эпителиальных клеток извитых канальцев. Резкое полнокровие, микроскопические кровоизлияния в корковом и мозговом слоях надпочечников с гибелью клеточных элементов. Резкий отек стромы ворсинок и подслизистого слоя в тонком кишечнике. Значительные полиморфно-клеточные инфильтраты (включающие нейтрофилы, эозинофилы и гистиоциты) в строме ворсинок и подслизистом слое. Резкая инфильтрация покровного эпителия кишечника лимфоидными элементами и полиморфно-ядерными лейкоцитами. Значительный отек под слизистой оболочки толстого кишечника с наличием выраженной вакуолизации покровного эпителия. Заметное обеднение лимфоидной ткани, связанной с кишечником (пейеровые бляшки, аппендикс, круглый мешочек), лимфоцитами. Резкая редукция лимфатических фолликулов селезенки.

Методика определения токсигенности, безвредности, реактогенности и приживаемости холерного вибриона при внутрижелудочном введении взрослым кроликам приведена в прилож. 7.

5.4. Определение влияния на иммунную систему

Цель проведения испытания заключается в выявлении возможных иммунологических нарушений в организме после введения исследуемого штамма. Иммунологические нарушения могут приводить к развитию вторичного иммунодефицита, быть причиной изменений иммунологической реактивности организма на другие неродственные антигены, лежать в основе неполноценного специфического ответа на сам испытуемый штамм.

Испытуемый штамм холерного вибриона при внутрижелудочном введении не должен приводить к нарушению иммунологического гомеостаза организма, т. е. испытуемый штамм не должен статистически достоверно снижать усредненные иммунологические показатели, по сравнению с исходным усредненным уровнем и (или) уровнем в контрольных группах до введения препарата.

Методы исследования влияния штамма на иммунную систему в соответствии с РД 42-28-10-90 и "Медицинскими лабораторными технологиями" (Справочник, 2002) приведены в прилож. 8. Взрослых кроликов для этих опытов используют тех же, что и для определения безвредности, "остаточной" токсигенности, реактогенности и приживаемости вакцинного штамма (прилож. 7) и протективной активности (прилож. 11).

5.4.1. Определение количества Т-лимфоцитов в крови кроликов

Вакцинный штамм не должен вызывать статистически достоверного уменьшения абсолютного и относительного содержания Т-лимфоцитов в крови кроликов, иммунизированных внутрижелудочно дозами 5 х 10(7) и 5 х 10(9) вибрионов. Увеличение количества Т-лимфоцитов свидетельствует об иммунологической активности испытуемого и контрольного штаммов холерного вибриона.

5.4.2. Определение количества В-лимфоцитов в крови кроликов

Вакцинный штамм холерного вибриона не должен вызывать в крови статистически достоверного снижения абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов у кроликов, привитых внутрижелудочно дозами 5 х 10(7) и 5 х 10(9) вибрионов. Увел