Приложение 2 (обязательное). Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ВГПА

Приложение 2
(обязательное)

Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ВГПА

1. Мазки из ротоглотки
1.1. Сбор материала	Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
1.2. Предобработка проб	Не требуется.
1.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
1.4. Условия хранения материала	При температуре от 2 до 8°С - в течение трех суток. При температуре минус 70°С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала. Температура хранения минус 200С не допускается.
1.5. Условия транспортирования материала	В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 0-4°С - не более трех суток; - при температуре минус 70°С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20°С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
2. Мазки из полости носа
2.2. Сбор материала	Мазки (слизь) берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. Зонд с ватным тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Для метода иммунофлюоресценции забор материала для этого метода исследования производят перед другими манипуляциями. После взятия материала тампон помещают в пробирку с 2-3 мл 0,1 моль/л фосфатно-солевого буферного раствора. Для получения суспензии клеток тампоны в пробирке тщательно отжимают о стенки пробирки. Тампон удаляют. Пробирку закрывают. Для ПЦР-анализа. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую микропробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствора фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
2.3. Предобработка проб	Для метода иммунофлюоресценции клетки осаждают центрифугированием в течение 5-6 мин при 3000 об/мин. Надосадачную жидкость осторожно удаляют, а клеточный осадок ресуспендируют в нескольких каплях ФСБ и наносят на предметные стекла (не менее 3 шт.) раздельными каплями. Препарат высушивают и фиксируют 10 мин в охлажденном до 2-8°С химически чистом ацетоне. Для ПЦР-анализа - не требуется.
2.4. Метод исследования	МФА, ОТ-ПЦР
2.5 Условия хранения материала	Для метода иммунофлюоресценции фиксированные неокрашенные мазки можно хранить при температуре от 2 до 8°С в течение 6-7 дней, при температуре минус 20°С - до 6 мес. Для ПЦР-анализа - см. п.п. 1.4.
2.6. Условия транспортирования материала	Для метода иммунофлюоресценции в термоконтейнере с охлаждающими элементами при температуре от 0 до 4°С. Для ПЦР-анализа - см. п.п. 1.5.
3. Смывы из полости носа
3.1.Сбор материала	Сбор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.
3.2. Предобработка проб	Не требуется.
3.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
3.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
3.5. Условия транспортирования материала	См.п. 1.5.
4. Смывы из ротоглотки
4.1. Сбор материала	Перед сбором материала необходимо предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек) 8-10 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.
4.2. Предобработка проб	Не требуется.
4.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
4.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
4.5. Условия транспортирования материала	См. п. 1.5.
5. Носоглоточное отделяемое
5.1. Сбор материала	Производится натощак после взятия мазков из полости носа. Осуществляется двумя способами: 1. Больной в три приема прополаскивает горло 10-15 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Смыв собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Ватными тампонами, зажатыми пинцетом, протирают заднюю стенку глотки и носовые ходы. Ватные тампоны опускают во флакон со смывом. 2. Сухим или слегка увлажненным 0,9% раствором натрия хлорида тампоном, который удерживают с помощью пинцета, протирают заднюю стенку глотки и опускают его в пробирку с 5 мл стабилизирующей среды (приложение 4). Процедуру повторяют 2-3 раза. Все тампоны от одного больного собирают в одну пробирку. После взятия материала с задней стенки глотки тщательно протирают носовые ходы небольшими ватными тампонами и опускают их в ту же пробирку. Пробирку закрывают.
5.1. Предобработка проб	Тампоны прополаскивают в стабилизирующей среде, в которой они содержались, отжимают о стенку сосуда и удаляют. Смыв отстаивают в холодильнике 40-60 мин. Центрифугирование и фильтрацию не проводят. Для выделения вируса используют среднюю часть отстоя, которую небольшими порциями переносят в 3 стерильные пробирки. Одну используют для выделения вируса, остальные замораживают при температуре мунус 70°С или в жидком азоте.
5.3. Метод исследования	Выделение вируса
5.4. Условия хранения материала	При температуре от 2 до 8°С - не более 3 дней. При температуре минус 70°С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала. Температура хранения минус 20°С не допускается.
5.5. Условия транспортирования материала	См. п.п. 1.5.
6. Фекалии
6.1.Сбор материала	Используют пробы фекалий массой (объемом) 1-3 г (1-3 мл). Исследование мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 грамма (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.
6.2. Предобработка проб	При исследовании нативных фекалий без предшествующего замораживания готовят фекальную суспензию (при водянистой консистенции фекалий в виде прозрачной жидкости фекальную суспензию не готовят). Приготовление фекальной суспензии: В соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносят 0,8 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида). В каждую пробирку отдельным наконечником с аэрозольным барьером (или одноразовыми лопатками) вносят 0,1 г (0,1 мл) фекалий и тщательно ресуспендируют на вортексе до образования гомогенной суспензии. При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10-20%-й суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10-15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30-40 минут. Приготовление осветленного экстракта фекалий: Для приготовления осветленного экстракта фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином. Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе. Осветляют полученную суспензию путем центрифугирования при 10 тыс. g (12 тыс об./мин. на центрифуге "MiniSpin", Eppendorf, Германия) в течение 5 минут. Супернатант (0,1 мл) смешивают с отрицательным контрольным образцом (ОКО) (0,1 мл) в соотношении 1:1 и используют непосредственно для выделения РНК. При необходимости хранения супернатант отбирают в отдельную одноразовую пробирку.
6.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
6.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
6.5. Условия транспортирования материала	См. п. 1.5.
6.# Секционный материал
7.1.Сбор материала	В качестве секционного материала используются ткани легких, трахеи, сегментарных бронхов, селезенки. Секционный материал собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл.
7.2. Предобработка проб	Кусочки органов гомогенизируют в стерильных фарфоровых ступках и готовят 10 % суспензию на стерильном 0,9% растворе натрия хлорида или фосфатном буфере. Суспензию переносят в микропробирку на 1,5 мл и центрифугируют при 10000 оборотах в течение 30 секунд. Супернатант используют для выделения РНК.
7.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
7.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
7.5. Условия транспортирования материала	См. п. 1.5.