Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 "Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 12 февраля 2007 г.)

3.3.1. Вакцинопрофилактика

Методические указания МУ 3.3.1.2161-07
"Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 12 февраля 2007 г.)

Дата введения: 1 апреля 2007 г.

Введены впервые

1. Область применения

Методические указания "Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба" являются руководящим документом для Государственных комиссий, проводящих доклинические Государственные приемочные испытания новых вакцинных штаммов туляремийного микроба и специалистов научно-исследовательских учреждений, осуществляющих разработку и контроль вакцинных штаммов.

2. Нормативные ссылки

2.1. Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

2.2. РД 42-28-10-90. "Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы".

2.3. РД 42-281-91 "Государственные приемочные испытания МИБП. Порядок проведения. Основные положения".

2.4. Приложение 1 к приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации N 125 от 14.04.99 "Об усилении мероприятий по профилактике туляремии".

2.5. СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

2.6. СП 3.3.2.561-96 "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".

2.7. СП 1.2.036-01 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности".

2.8. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)".

2.9. Медицинские лабораторные технологии. Справочник С.-Пб., 2000.

2.10. МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР".

2.11. МУ 3.1.2007-05 "Эпидемиологический надзор за туляремией".

3. Введение

Возбудитель туляремии по национальной классификации относится к микроорганизмам II группы патогенности. В России для специфической профилактики туляремии используют вакцину живую сухую, приготовленную из вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ. Потенциально-вакцинные штаммы туляремийного микроба должны соответствовать строгим требованиям безопасности и специфической активности. Основной задачей настоящих методических указаний является изложение обязательных требований к штаммам туляремийного микроба - кандидатам в вакцинные, критериев оценки и методов исследования, основанных на информативных, хорошо изученных и широко применяемых, официально утвержденных тестах, позволяющих отобрать для последующих клинических испытаний безопасные и высоко иммуногенные штаммы туляремийного микроба.

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации разрешает проведение на добровольцах клинических ограниченных, затем государственных испытаний вакцины из штамма - кандидата в вакцинные, на основании результатов государственных лабораторных (доклинических) испытаний о соответствии нового штамма F. tularensis требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам, изложенными в данных методических указаниях, а также одобренными Национальным органом контроля (ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП). Клинические испытания проводятся по программе, согласованной с ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитетом МИБП. После утверждения Министерством здравоохранения и социального развития испытуемого штамма в качестве нового вакцинного, дальнейшие этапы внедрения живой вакцины проводят в соответствии с СП 3.3.2.561-96 "Медицинские иммунобиологические препараты. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов".

Соблюдение настоящих методических указаний обязательно для всех учреждений, независимо от их ведомственной принадлежности.

4. Общие положения

4.1. Для изготовления живой туляремийной вакцины применяют штамм туляремийного микроба 15 НИИЭГ голарктического подвида, стабильно утратившего способность вызывать заболевание у людей и лабораторных животных, неспособного реверсировать в вирулентное состояние, но сохранившего остаточную вирулентность для белых мышей и морских свинок, обеспечивающую ему способность приживаться и вызывать иммунобиологическую перестройку в организме.

4.2. Все исследования со штаммами туляремийного микроба, перспективными для отбора в качестве кандидатов в вакцинные, должны проводиться в "заразной" зоне лабораторий (СП 1.3.1285-03, п. 2.3.6) в отдельном микробиологическом боксе, где в период испытаний не хранят и не работают с ПБА (патогенными биологическими агентами) I - IV групп патогенности. Отобранные авторами штаммы, соответствующие настоящим методическим указаниям, переводят в III группу патогенности согласно "Классификации патогенных для человека микроорганизмов" (СП 1.2.036-95, прилож. 5.4). Лиофилизацию культур штаммов, кандидатов в вакцинные для государственных испытаний, проводят в помещении и на оборудовании, предназначенных для лиофилизации только экспериментальных препаратов, изолированных от помещений, предназначенных для хранения вакцинных штаммов и изготовления живых вакцин.

4.3. Лиофилизированные в ампулах культуры штаммов, кандидатов в вакцинные (не менее 50 ампул), вместе с отчетом о доклинических испытаниях разработчики (учреждения - авторы) передают в Государственную коллекцию патогенных бактерий (ГКПБ) РосНИПЧИ "Микроб" для организации проведения государственных испытаний. Штаммы-кандидаты в вакцинные до завершения всех испытаний (доклинических и клинических) хранят в отдельном холодильнике в помещении лаборатории ГКПБ, где не работают с ПБА. С момента начала доклинических государственных испытаний штаммы должны быть опечатаны двумя печатями: председателя государственной комиссии (или заместителя председателя) и представителя ГКПБ "Микроб" (ответственного за хранение). После завершения доклинических и клинических испытаний и признания штамма вакцинным (приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации) оставшиеся опечатанные ампулы должны быть переданы в Государственную коллекцию ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

4.4. Работу с зашифрованными испытуемым и контрольным штаммом Francisella tularensis 15 НИИЭГ проводят как с микроорганизмами III группы патогенности (СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами").

4.5. Испытуемый и контрольный вакцинный штамм 15 НИИЭГ должны быть зашифрованы специалистами, не принимающими участия в проведении испытаний.

4.6. Концентрацию клеток в микробных взвесях культур определяют по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-85П) 10 единиц соответствующего года выпуска, эквивалентных 5 х 10(9) микробных клеток в 1 мл Francisella tularensis.

5. Идентификация испытуемого вакцинного штамма по видовым признакам

Идентификацию испытуемого вакцинного штамма осуществляют на основании следующих признаков: 1) морфология и окраска бактерий в мазках и специфическое свечение в РИФ (прямой реакции иммунофлуоресценции); 2) характер роста на питательной среде Мак-Коя; 3) отсутствие роста на простых питательных средах типа мясопептонного агара (МПА), агара Хоттингера; 4) биохимические свойства, характерные для представителя соответствующего подвида F. tularensis; 5) агглютинация диагностической туляремийной сывороткой для РА; 6) полимеразная цепная реакция (ПЦР) с праймерами, специфичными для вида F. tularensis, 7) ПЦР с праймерами, специфичными для потенциального вакцинного штамма.

5.1. Туляремийный микроб относится к роду Francisella, виду tularensis. Внутри вида F. tularensis различают три подвида - голарктический, неарктический и среднеазиатский. Туляремийные микробы - размером 0,2 - 0,7 мкм, неподвижные, грамотрицательные, с выраженным полиморфизмом (от кокковидных до палочковидных форм), жгутиков не имеют, образуют капсулу слизистой консистенции, при окраске мазков по Граму окрашиваются фуксином. В мазках с плотных питательных сред преобладают кокковидные формы, в мазках из органов животных преобладают коккобактерии. Слабо воспринимают красители и окрашиваются бледнее, чем прочие микроорганизмы.

5.2. F. tularensis - факультативный анаэроб, не растет на простых питательных средах типа мясопептонного агара или бульона; растет слабо или не растет на средах, необогащенных кровью, ее фракциями или желтком куриных яиц. Температурный оптимум для развития характерного S или SR - типа колоний - 36 - 37°С. На свернутой желточной среде Мак-Коя растет в виде извилистого, слегка блестящего, почти бесцветного налета, на питательном FT - агаре (ФСП 42-01811372-01) образует беловато-серые колонии диаметром не менее 1 мм, круглые, с ровными краями, выпуклые и блестящие. При разреженном посеве они достигают диаметра 2 мм и более, рост становится заметным через 2 - 3 сут. культивирования. В зависимости от используемой жидкой питательной среды туляремийный микроб может расти как на поверхности в виде пленки, так и вызывать диффузное помутнение бульона.

5.3. Туляремийный микроб расщепляет с образованием кислоты без газа глюкозу, левулезу, мальтозу, маннозу, образует сероводород, не выделяет индол. Штаммы неарктического и среднеазиатского подвидов ферментируют глицерин и цитруллин, обладают фосфатазной активностью, чувствительны к эритромицину. Неарктический подвид обладает пенициллиназной активностью, вирулентен для кроликов, среднеазиатский подвид - пенициллиназной активностью и вирулентностью для кроликов не обладает. Штаммы голарктического подвида не ферментируют глицерин (за исключением японского биовара) и цитруллин, обладают пенициллиназной активностью, не обладают - фосфатазной, по чувствительности к эритромицину разделяются на два биовара: Ery(s) (высокочувствительный) и Ery(r) (резистентный).

Таблица

Характеристика подвидов F. tularensis

Признак		Подвид
	голарктический	неарктический	среднеазиатский
Ферментация глюкозы	+	+	+
Ферментация мальтозы	+	+	+
Ферментация маннозы	+	+	+
Ферментация левулезы	+	+	+
Ферментация глицерина	-	+	+
Образование сероводорода	+	+	+
Образование индола	-	-	-
Ферментация цитруллина	-	+	+
Фосфатазная активность	-	+	-
Пенициллиназная активность	+	+	-
Чувствительность к эритромицину	+-	+	+
Вирулентность для кроликов	-	+	-

Примечание: (+) наличие, (-) отсутствие признака.

5.4. Штаммы туляремийного микроба, предлагаемые в качестве вакцинных, должны:

- обладать типичными культурально-морфологическими, биохимическими и антигенными свойствами, характерными для представителя соответствующего подвида F. tularensis;

- содержать не менее 80% иммуногенных (SR-тип) колоний;

- агглютинироваться до титра сыворотки с образованием крупнохлопчатого агглютината отраслевым стандартным образцом (ОСО 42-28-28-84П) сыворотки диагностической туляремийной агглютинирующей для РА сухой;

- выявляться в ПЦР при использовании специфических праймеров;

- обнаруживаться специфическое свечение при окрашивании культур иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими туляремийными сухими (ФСП-42-0181-5315-04).

Методики определения видовых признаков испытуемого и контрольного штаммов туляремийного микроба приведены в прилож. 1 к приказу Министерства здравоохранения РФ N 125 от 14.04.99 "Об усилении мероприятий по профилактике туляремии", прилож. 1 к настоящим методическим указаниям и МУ 3.1.2007-05 "Эпидемиологический надзор за туляремией".

6. Определение степени остаточной вирулентности испытуемого вакцинного штамма на белых мышах

LD_50 вакцинного штамма для белых мышей должна быть в пределах от 1 х 10(2) до 2 x 10(6) м.к. F. tularensis. Методика определения остаточной вирулентности испытуемого и контрольного штаммов на белых мышах приведена в прилож. 2.

7. Определение степени остаточной вирулентности и безвредности испытуемого вакцинного штамма на морских свинках

О безвредности культуры испытуемого штамма судят по реакции организма морских свинок на ее введение, по приживаемости и распространению бактерий в организме, по выявленным у подопытных морских свинок патоморфологическим изменениям, степени их выраженности и обратимости. В качестве контроля в этих экспериментах используют группу морских свинок, привитых культурой вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ и обследуемых аналогичным образом. Методики определения безвредности нового вакцинного штамма приведены в прилож. 3.

7.1. Испытание вакцинного штамма F. tularensis проводят на морских свинках массой 400 - 500 г. Наблюдение за животными проводят 30 сут. Испытуемый и вакцинный штаммы туляремийного микроба 15 НИИЭГ не должны вызывать гибель морских свинок, привитых дозами 5 х 10(3), 5 х 10(5), 5 х 10(7) и 5 х 10(9) м.к./мл.

7.2. Вакцинные штаммы туляремийного микроба должны обладать определенной степенью остаточной вирулентности, т.е. в течение некоторого времени размножаться, распространяться и задерживаться в организме привитых животных и вызывать доброкачественный вакцинальный процесс. Бактерии вакцинных высокоиммуногенных штаммов F. tularensis должны размножаться в организме привитых морских свинок в течение первых 3 - 15 сут., обусловливая тем самым иммунологическую перестройку организма. Через 30 сут. организм морских свинок, как правило, освобождается от микробов. Бактерии вакцинных штаммов F. tularensis должны приживаться в организме морских свинок и выявляться в высевах из мест введения и из регионарных лимфатических узлов в течение 20 - 30 сут., из селезенки и печени в течение первых 10 - 15 сут.

7.3. Для вакцинного штамма туляремийного микроба при подкожном методе введения допустимо выделение микробов при посеве отпечатками следующих органов и тканей на питательную среду:

- из места введения и регионарного лимфатического узла до 20 - 30 сут. при дозах 5 х 10(7) и 5 х 10(9) м.к. в виде сливного (4+) или обильного роста (3+), при дозе 5 x 10(5) м.к. - около 100 - 200 колоний (2+) и при дозе 5 x 10(3) м.к. - до 10 и иногда более колоний (1+);

- печени и селезенки при дозах 5 x 10(7) и 5 х 10(9) м.к.. может вырастать более 100 колоний, при дозе 5 х 10(5) м.к. - около 50 - 100 колоний, от морских свинок, привитых 5 x 10(3) м.к. вакцинный штамм туляремийного микроба обычно не выделяется;

- легких, крови и костного мозга, как правило, не должно быть роста туляремийных микробов. У отдельных животных в течение 3 - 5 сут. после введения дозы 5 x 10(9) м.к. исследуемой культуры в посевах из легких, крови или костного мозга могут вырастать единичные колонии F. tularensis.

8. Определение реактогенности испытуемого вакцинного штамма на морских свинках (прижизненные наблюдения)

8.1. Высокоиммуногенный вакцинный штамм туляремийного микроба при подкожной иммунизации морских свинок должен вызывать у них допустимые местную и общую реакции. Интенсивность и продолжительность реактивных изменений у морских свинок зависит от дозы введенных вакцинных микробов и степени остаточной вирулентности изучаемого штамма. Дозы 5 х 10(3) м.к. не вызывают или вызывают у морских свинок незначительное повышение температуры тела и снижение массы. В течение 7 - 10 сут. в месте введения могут пальпироваться ограниченные очаги уплотнения мягких тканей, регионарные лимфатические узлы могут быть не увеличены или увеличены, но должны быть подвижными, т.е. не спаянными с окружающими мягкими тканями.

8.2. При подкожном введении 5 x 10(9) м.к. у отдельных животных возможно повышение температуры тела на 1,5 - 2°С. Среднее повышение температуры тела для группы морских свинок (30 голов), которым было введено 5 х 10(3), 5 х 10(5), 5 х 10(7) и 5 x 10(9) м.к. исследуемого штамма, не должно превышать 1°С. К 7 - 12 сут. после введения вакцинного штамма температура тела морских свинок должна снизиться до исходных значений.

8.3. В ответ на введение вакцинного штамма туляремийного микроба в дозе 5 x 10(9) м.к. в первые 5 сут. может снижаться масса тела морских свинок. К 6 - 7-м сут. после введения испытуемой культуры снижение массы животных не должно превышать 1/5 ее первоначальной величины. У половины опытных животных допустимо развитие обширных отеков в месте введения культуры, у отдельных - увеличение, уплотнение лимфатических узлов и спаянность их с мягкими тканями.

Методика определения реактогенности вакцинного штамма для морских свинок приведена в прилож. 3.

9. Определение безвредности и остаточной вирулентности испытуемого вакцинного штамма на морских свинках по морфологическим показателям

Безвредность испытуемых штаммов туляремийного микроба по морфологическим показателям определяется в экспериментах на морских свинках при подкожном способе введения.

Степень остаточной вирулентности испытуемого штамма характеризуют специфические для вакцинального процесса морфологические (макроскопические и гистологические) изменения, возникающие у морских свинок в тканях места введения культуры, в регионарных, контрлатеральных и отдаленных лимфатических узлах, а также во внутренних органах (печень, селезенка, легкие, почки с надпочечниками, сердце). Методика вскрытия и исследования морских свинок приведена в прилож. 3.

9.1. Испытуемый штамм туляремийного микроба не может быть признан вакцинным, если он в соответствующих дозах при всех равных условиях чаще вызывает у морских свинок более выраженные изменения (см. ниже), чем контрольный вакцинный штамм 15 НИИЭГ.

9.1.1. Испытуемый штамм, введенный морским свинкам в дозах 5 x 10(7) и 5 x 10(9) м.к., вызывает максимальное развитие островоспалительных изменений примерно к 7-м сут., их стихание с преобладанием продуктивного компонента - к 14-м сут. и полную резорбцию или заживление без грубых рубцовых изменений - к концу 30-х сут.

9.1.2. При введении культуры в дозе 5 х 10(3) м.к. сроки нарастания островоспалительных изменений могут затягиваться до 14 сут., а их стихание до 21 - 28 сут.

9.2. При введении морским свинкам культуры безвредного вакцинного штамма допустимы перечисленные ниже изменения.

9.2.1. Место введения

Макроскопическая картина. При введении культуры вакцинного штамма в дозах 5 х 10(3), 5 х 10(5) и 5 х 10(7) м.к. допустимо: незначительное или умеренное диффузное или очаговое полнокровие сосудов тканей в остром периоде процесса. При введении культуры в дозе 5 х 10(9) м.к. преимущественно в остром периоде (5 - 10-е сут.) не более, чем в половине случаев, допустимы: участки воспалительного уплотнения (инфильтраты) размерами до 1,0 х 1,5 см, в единичных случаях более крупные; серозный отек мягких тканей бедра и паховой области в месте введения культуры, но без его распространения на прилежащие участки (брюшная и грудная стенка, контрлатеральная паховая область), гнойные очаги и кровоизлияния диаметром до 0,5 см в диаметре. В единичных случаях (не более 3 животных) допустимы: крупные кровоизлияния до 1,5 см в диаметре; очаги некроза до 0,5 - 0,7 см в диаметре; инкапсулированные абсцессы с гнойной полостью до 0,5 см в диаметре; язвы и свищи с гнойным отделяемым. К 14 - 21-м сут. воспалительные изменения стихают. К 30-м сут. у отдельных животных допустимы: незначительные остаточные явления в виде небольших рубцовых изменений.

При введении испытуемой культуры в дозах 5 x 10(5) и 5 х 10(7) м.к. не более, чем у 1 - 3 свинок допустимы: участки воспалительного уплотнения (инфильтраты) размерами не более 0,5 - 0,7 см; умеренный серозный отек тканей бедра и паховой области со стороны введения испытуемого штамма; мелкие (менее 0,3 см в диаметре) очаги гнойного воспаления; кровоизлияния до 0,5 см в диаметре.

При введении испытуемой культуры в дозе 5 x 10(3) м.к. допустимы изменения по частоте, которые наблюдаются при введении контрольного вакцинного штамма 15 НИИЭГ (п. 8.1).

Следует обращать внимание на возможность возникновения инкапсулированных абсцессов в тканях места введения в поздние сроки (до 45 сут.). Такие изменения характерны для недостаточно аттенуированных штаммов.

Гистологические изменения. Наблюдается воспаление собственно кожи, подкожной клетчатки с явлениями некробиоза, небольшими участками кровоизлияний и серозным пропитыванием прилежащих структур. При введении культуры исследуемого штамма во всех указанных дозах допустимы: в ранние сроки (3 - 5-е сут.) гнойное воспаление - инфильтраты из полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМН-лейкоцитов); с 7-х по 10-е сут. по периферии очага гнойного расплавления развивается продуктивная реакция - участки грануляционной ткани, которые к 14 - 21-м сут. постепенно замещают очаг воспаления соединительной тканью. В этот период возможно обнаружение преимущественно эпителиоидно-клеточных гранулем с наличием многоядерных гигантских клеток. В некоторых гранулемах могут быть небольшие очаги некроза в центре; к 28 - 45-м сут. происходит полное замещение очага воспаления соединительной тканью. При введении культуры исследуемого штамма в меньших дозах указанные изменения могут наблюдаться не более чем у 2 - 3 свинок.

9.2.2. Регионарные лимфатические узлы (паховые и подвздошные)

Макроскопическая картина. При введении культуры испытуемого штамма в максимальной дозе (5 х 10(9)м.к.) допустимо: умеренное увеличение регионарных лимфатических узлов к 3 сут. в 1,5 - 2,0 раза; отек окружающей клетчатки с единичными мелкопятнистыми кровоизлияниями. На 5-е сут. лимфатические узлы полнокровны, иногда с мелкими кровоизлияниями в капсулу и окружающую клетчатку. К 7 - 14-м сут. лимфатические узлы увеличиваются значительно (в 2,5 раза), окружающая их клетчатка полнокровна, отечна, с наличием кровоизлияний (0,3 - 0,5 см в диаметре). Увеличение лимфатических узлов продолжается до 28-х сут.

При введении культуры испытуемого штамма в меньших дозах допустимо: с 3-их по 14-е сут. незначительное или умеренное (до 0,5 см в диаметре) увеличение узлов, с гиперемией и уплотнением, без геморрагии, очагов нагноения и некрозов. Выраженность качественных и количественных изменений прямо пропорциональна величине дозы вводимого испытуемого штамма.

Гистологические изменения. При введении культуры исследуемого штамма в дозе 5 х 10(9) м.к. уже на 3-й сут. в корковом слое под капсулой образуются специфические гранулемы различной величины и формы. Они состоят из полиморфно расположенных эпителиоидных клеток, среди которых обнаруживаются и гигантские многоядерные клетки. Обычно в центре гранулем имеются скопления полиморфно-ядерных лейкоцитов, часть из которых с распадающимися ядрами. В мозговом слое отмечается выраженное полнокровие и катар синусов. В последующие сроки формирование гранулем продолжается. К этим изменениям на 7-е сут. присоединяются явления продуктивного периаденита; начинается постепенное замещение гранулем соединительной тканью, некоторые гранулемы в центре подвергаются некрозу. В последующие сроки (10 - 14-е сут.) воспалительные изменения могут распространяться и вызывать образование довольно обширных периаденитов. К 21-ым сут. отмечается формирование свежих гранулематозных образований; выявляются склеротические процессы, особенно в мозговом веществе; сохраняется продуктивный периаденит. Склеротические изменения наблюдаются и в более поздние сроки (до 45-х сут.). Введение испытуемого штамма в меньших дозах сопровождается, соответственно дозе, менее выраженными изменениями. При введении всех указанных доз у животных допустимы: острый серозный (негнойный) лимфаденит со слабо выраженным периаденитом без некротических изменений; подострый лимфаденит с участками грануляционной ткани, с продуктивными изменениями, частичным фиброзом, изредка с небольшими рассасывающимися гранулемами без очагов некроза и нагноения, в половине случаев при введении культуры в дозе 5 x 10(7) м.к. и у отдельных животных при введении испытуемого штамма в дозе 5 х 10(3)м.к.

9.2.3. Контрлатеральные и отдаленные лимфатические узлы

Макроскопическая картина. При введении культуры испытуемого штамма во всех указанных дозах допустимо: умеренное или незначительное (до 0,5 см) увеличение лимфатических узлов без признаков острых воспалительных изменений. Кроме того, при введении культуры в дозе 5 x 10(9) м.к. возможно в отдельных случаях уплотнение лимфатических узлов с проявлением умеренной гиперемии кожных покровов.

Гистологические изменения. При введении культуры во всех указанных дозах допустимы: гиперпластические изменения в лимфоидной ткани разной степени выраженности; умеренно или незначительно выраженный очаговый серозный лимфаденит, небольшие участки продуктивных изменений и фиброза стромы узлов.

9.2.4. Селезенка

Макроскопическая картина. При введении исследуемых культур в дозе 5 х 10(9) м.к. уже на 3-й сут. селезенка бывает увеличена, умеренно полнокровна; в последующие сроки могут наблюдаться очень мелкие очажки серовато-белого цвета, бесследно исчезающие к 10 - 14-м сут. Испытуемый штамм, вводимый в дозах 5 x 10(7) и 5 x 10(5) м.к., вызывает значительно меньшие макроскопические изменения.

Во всех указанных дозах допустимы: небольшое или умеренное (в 1,5 - 2 раза) увеличение размеров селезенки с умеренным полнокровием при отсутствии значительного соскоба на разрезе (чрезмерно сочные отпечатки при посевах). В половине случаев при введении культуры в дозе 5 х 10(9) м.к., у 30% животных при введении культуры в дозе 5 x 10(7) м.к., могут быть признаки гиперплазии фолликулов (выбухание под капсулой). При введении культуры в дозе 5 х 10(9) м.к. допустимы: у отдельных морских свинок (не более 6) развитие единичных или немногочисленных (не более 10 в органе), преимущественно субмиллиарных или отдельных миллиарных узелков серовато-белого, иногда розоватого цвета без признаков некротизации, без абсцедирования, без слияния в более крупные очаги, без инкапсуляции и грубого рубцевания, полностью разрешающихся к 45-м сут.; при введении исследуемой культуры в дозах 5 х 10(7) и 5 х 10(5) м.к. возможно у отдельных животных (1 - 2) развитие единичных узелков (1 - 3) без признаков некротизации, без абсцедирования, без слияния в более крупные очаги, без инкапсуляции и грубого рубцевания, полностью разрешающиеся к 45-м сут. При введении меньшей дозы таких изменений не должно быть.

Гистологические изменения. При введении испытуемого штамма во всех указанных дозах допустимы: гиперплазия клеток белой пульпы (фолликулов и периартериальных муфт), плазмоклеточная реакция разной степени выраженности; полнокровие синусов селезенки; острый серозный очаговый или диффузный спленит, стихающий в поздние сроки, наличие лимфогистиоцитарных инфильтратов в строме, небольших участков грануляционной ткани, небольших очагов фиброза в строме и капсуле органа при введении испытуемых культур в дозах 5 x 10(9) и 5 х 10(7) м.к. - у 50% животных, а в дозах 5 x 10(5) и 5 х 10(3) м.к. - у отдельных (3 - 5) животных. Кроме того, при введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10(9) м.к. допустимы: гранулемы единичные (1 - 2 в срезе), эпителиоидно-клеточные, без очагов некроза и явного абсцедирования, без грубого рубцевания по периферии, иногда с небольшим накоплением полиморфно-ядерных лейкоцитов (псевдоабсцесс) при процессах резорбции не более, чем у 5 - 6 опытных животных; при введении исследуемой культуры в дозе 5 x 10(7) м.к. допустимы у отдельных животных единичные, мелкие гранулемы (1 - 2 в срезе) продуктивного характера.

9.2.5. Печень

Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во всех указанных дозах допустимы: признаки умеренных диффузных дистрофических изменений органа (незначительное увеличение размеров, набухание, сероватый оттенок окраски); венозное полнокровие; у единичных (1 - 2 свинки) животных возможно развитие узелков (до 3 в органе), преимущественно точечных без признаков некроза, нагноения и грубого рубцевания; беловатых или сероватых точечных и штрихообразных очагов.

При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10(9) м.к. допустимы: у отдельных животных (не более 6) немногочисленные (до 10 в органе) преимущественно точечные и субмилиарные, редко милиарные узелки без признаков некротизации, без абсцедирования, инкапсуляции и грубых рубцовых изменений ткани печени в поздние сроки, иногда с небольшими втяжениями поверхности; при введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10(7) м.к. у единичных (1 - 3) животных возможно развитие точечных и субмилиарных узелков без признаков некротизации, без абсцедирования, без инкапсуляции и грубых рубцовых изменений ткани органа.

Гистологические изменения. При введении исследуемой культуры во всех указанных дозах у 50% животных допустимы: наличие умеренно выраженных признаков функционального напряжения гепатоцитов ("зернистая дистрофия"), умеренно выраженные очаговые вакуольная и (или) жировая дистрофии; мелкие единичные (2 - 3 в срезе) лимфогистиоцитарные инфильтраты в строме.

При введении испытуемой культуры в дозе 5 х 10(9) м.к. допустимы: гранулемы эпителиоидно-клеточные без фокусов некроза, абсцедирования, инкапсуляции выраженных склеротических очагов, с признаками резорбции, не более, чем у 6 животных; единичные (1 - 3 в срезе) очаги некроза и некробиоза в пределах 10 - 15 печеночных клеток при наличии хорошо выраженной продуктивной клеточной реакции без склонности к дальнейшей некротизации и к абсцедированию не более, чем у 1 - 2 свинок. При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10(7) м.к. возможно развитие единичных (1 - 2 в срезе) гранулем не более, чем у 1 - 2-х животных. При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10(5) м.к. и 5 х 10(3) м.к. допустимо развитие лишь единичных (1 - 2 в срезе) продуктивных гранулем у отдельных (1 - 2) животных.

9.2.6. Легкие

Макроскопическая картина. При введении исследуемой культуры во всех дозах допустимы: участки неравномерного полнокровия легких; участки пониженной воздушности серовато-синюшного цвета.

При введении исследуемой культуры в дозе 5 х 10(9) м.к. допустимы: милиарные и субмилиарные очаги уплотнения легочной ткани серовато-розоватого, иногда синюшно-красного цвета, немногочисленные (до 10 в обоих легких) в половине случаев при отсутствии бактериологического выделения возбудителя туляремии из ткани легких; при введении исследуемой культуры в дозах 5 х 10(7) и 5 х 10(5) м.к. возможно развитие единичных (1 - 3) милиарных и субмилиарных очагов уплотнения легочной ткани у отдельных (1 - 3) свинок при отсутствии позитивных бактериологических данных.

Гистологические изменения. При введении всех указанных доз допустимы: признаки умеренной очаговой интерстициальной инфильтрации перегородок между альвеолами лимфоидными и гистиоцитарными клеточными элементами при отсутствии сужения просветов альвеол, кровоизлияний, значительной примеси в инфильтрате ПМН-лейкоцитов, гиперплазии бронхопульмонарных лимфатических узелков, крупных лимфогистиоцитарных инфильтратов вокруг сосудов и бронхов. При введении испытуемой культуры в дозе 5 х 10(9) м.к. допустимы: вышеописанные изменения преимущественно гиперпластические - типа интерстициальной реакции распространенного или диффузного характера с участием бронхопульмональных лимфатических узелков, наличием лимфогистиоцитарных инфильтратов умеренных размеров вокруг сосудов и бронхов.

9.2.7. В других органах (сердце, почки, надпочечники) допустимы гиперпластические и умеренные дистрофические изменения в пределах, наблюдаемых при обычном вакцинном процессе после введения культуры вакцинного штамма туляремийного микроба 15 НИИЭГ.

9.3. Все вышеотмеченные изменения, допустимые при развитии вакцинальной реакции, могут колебаться в известных пределах у отдельных морских свинок по выраженности, срокам развития и полноте резорбции. Оценка изменений в месте введения культуры и в лимфатических узлах в смысле их допустимости как вакцинальных не представляет трудности. В противоположность этому дать правильную оценку изменениям во внутренних органах, укладывающимся в пределы вакцинальных реакций, очень сложно. Возникают затруднения даже при подсчете числа узелков в печени и селезенке. Иногда количество узелков может быть решающим в оценке испытуемых культур. Наличие 12 - 15 узелков в печени и селезенке у 1 - 2 морских свинок, которым испытуемая культура была введена в дозе 5 х 10(9) м.к. при отсутствии других недопустимых изменений не может быть абсолютным показателем для ее отклонения.

Отсутствие или слабая выраженность дистрофических процессов в паренхиматозных органах, отсутствие роста испытуемого штамма туляремийного микроба в посевах из этих органов наряду с другими позитивными характеристиками штамма указывают на безвредность последнего, несмотря на несколько большую узелковую реакцию. В то же время единичные узелки (2 - 5 в органе), заканчивающиеся формированием абсцессов и рубцов, приводящие к нарушению структуры органа, могут быть показателем высокой степени остаточной вирулентности изучаемой культуры, и на основании этого штамм может быть поставлен под сомнение как соответствующий вакцинному.

Наиболее важное значение имеет качество узелков: их характер, развитие и исходы. Узелки должны развиваться в острой, нестерильной фазе поствакцинальной реакции, иметь продуктивный характер. В период резорбции приобретать строение псевдоабсцессов и рассасываться к 30-м сут. наблюдения, когда наступает полное восстановление структуры органов.

Чаще формирование узелков в печени и селезенке сочетается с выраженными местными изменениями. Однако в ряде случаев узелки обнаруживаются у морских свинок, у которых в месте введения культуры и регионарных лимфатических узлах изменения минимальные. Испытуемые штаммы, вводимые в максимальной дозе, могут сохранять токсигенные свойства, проявляющиеся образованием очагов некробиоза печени.

9.4. Недопустимо развитие: при подкожном введении испытуемого штамма, даже в максимальной дозе (5 х 10(9) м.к.), в месте введения обширных кровоизлияний в подкожной клетчатке с выраженным отеком, гнойным расплавлением или некрозом тканей; в регионарных лимфатических узлах - диффузного гнойного аденита и периаденита с видимыми участками некроза; в легких - сливных очагов интерстициальной пневмонии или микроскопических очагов серозной, серозно-геморрагической и серозно-десквамативной пневмонии с выделением из легких испытуемой культуры; в печени и селезенке - множественных узелков и очагов некроза, абсцессов, обширных кровоизлияний, а в поздние сроки - рубцовых изменений.

10. Определение стабильности биологических свойств испытуемого вакцинного штамма на морских свинках

10.1. В результате 10-кратного подкожного пассирования исследуемой культуры через организм морских свинок у нее не должны:

- повыситься остаточная вирулентность;

- измениться культуральные, морфологические, биохимические свойства;

- измениться антигенный состав, снизиться антигенная активность.

10.2. Вакцинный штамм туляремийного микроба в организме морских свинок не должен реверсировать в вирулентную форму, способную в организме восприимчивого животного вызывать изменения, свойственные туляремийной инфекции.

Степень приживаемости микробов в организме может усилиться.

Методика проведения пассажей испытуемого вакцинного штамма на морских свинках приведена в прилож. 4.

11. Определение влияния испытуемого вакцинного штамма на иммунную систему морских свинок

Цель проведения испытания заключается в выявлении возможных иммунологических нарушений в организме после введения культуры исследуемого штамма. Нарушения иммунной системы могут приводить к развитию вторичного иммунодефицита, быть причиной изменений иммунной реактивности организма на другие неродственные антигены, лежать в основе неполноценного специфического ответа на сам штамм.

Введение испытуемого штамма туляремийного микроба не должно приводить к нарушению иммунологического гомеостаза организма, т.е. испытуемый штамм не должен статистически достоверно снижать усредненные иммунологические показатели, по сравнению с их величинами в контрольной группе.

Методы исследования влияния штамма на иммунную систему приведены в прилож. 5.

11.1. Определение относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов Испытуемый вакцинный штамм не должен вызывать статистически достоверного уменьшения абсолютного и относительного содержания Т-лимфоцитов в крови морских свинок, иммунизированных подкожно дозами 5 х 10(3) и 5 х 10(4) м.к. Увеличение абсолютного и относительного количества Т-лимфоцитов свидетельствует об иммунологической активности испытуемого и контрольного штаммов туляремийного микроба. Увеличение количества Т-лимфоцитов испытуемого штамма не должно быть меньше, чем вызываемое контрольным вакцинным штаммом.

11.2. Определение относительного и абсолютного количества В-лимфоцитов Испытуемый вакцинный штамм не должен вызывать статистически достоверного уменьшения абсолютного и относительного содержания В-лимфоцитов в крови морских свинок, иммунизированных подкожно дозами 5 х 10(3) и 5 х 10(4) м.к. Увеличение абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов свидетельствует об иммунологической активности испытуемого и контрольного штаммов туляремийного микроба. Увеличение количества В-лимфоцитов испытуемого штамма не должно быть меньше, чем вызываемое контрольным вакцинным штаммом.

11.3. Определение фагоцитарной активности макрофагов

Фагоцитарная активность определяется процентом фагоцитирующих клеток (ПФ) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется количеством микробных клеток на один фагоцит.

Вакцинный штамм туляремийного микроба не должен оказывать повреждающего действия на иммунную систему морских свинок, привитых подкожно дозами 5 х 10(3) и 5 х 10(4) м.к., должен стимулировать фагоцитирующие мононуклеары перитонеального экссудата - повышать процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное число. ПФ и ФЧ не должны статистически значимо отличаться от аналогичных показателей вакцинного штамма 15 НИИЭГ.

11.4. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) спонтанная и под влиянием Т- и В-клеточных митогенов

Реакцию бласттрансформации клеток выражают в виде индекса стимуляции клеток (ИСК), представляющего собой частное от деления среднеарифметического количества импульсов в 1 мин в культурах лимфоцитов, стимулированных митогенами, на среднеарифметическое количество импульсов в 1 мин в контрольных, не стимулированных митогенами, клетках (радиометрическая метка).

Вакцинный штамм туляремийного микроба не должен оказывать повреждающего действия на иммунную систему морских свинок, привитых подкожно дозами 5 x 10(3) и 5 х 10(4) м.к. - не должен снижать ИСК РБТЛ; должен стимулировать функциональную активность Т- и В-лимфоцитов - вызывать статистически значимое повышение ИСК РБТЛ. Повышение ИСК РБТЛ должно быть не меньше, чем вызываемое вакцинным штаммом 15 НИИЭГ.

11.5. Определение поликлональной активности В-лимфоцитов

Для получения этого показателя определяют число клеток, продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК), методом локального гемолиза в геле в разные сроки (3, 7, 14 и 28 сут.).

Вакцинный штамм туляремийного микроба у морских свинок, привитых дозами 5 х 10(3) и 5 х 10(4) м.к., может вызывать повышение поликлональной активности В-лимфоцитов.

11.6. Исследование иммунореактивности на гетерологичный антиген

Проводят определение АОК к эритроцитам барана (ЭБ).

Вакцинный штамм туляремийного микроба у морских свинок, привитых дозами 5 х 10(3) и 5 х 10(4) м.к., не должен вызывать вторичное иммунодефицитное состояние - не должен снижать иммунный ответ на гетерологичный антиген.

12. Прививаемость и иммуногенная активность испытуемого вакцинного штамма

12.1. Прививаемость. Вакцинный штамм туляремийного микроба должен прививаться при накожной аппликации морским свинкам в дозах 5 x 10(6) и 5 х 10(7) м.к./мл. У всех привитых животных на 2 - 5-е сут. вокруг насечек должен появиться инфильтрат и гиперемия размером 0,5 - 1,5 см. Методика определения прививаемости изучаемого вакцинного штамма приведена в прилож. 6.

12.2. Испытуемый вакцинный штамм должен обладать иммуногенной активностью в опытах по активной защите морских свинок, определяемой в ЕД_50. Величина ЕД_50 испытуемого и контрольного штаммов не должна превышать 5 x 10(3) м.к. Подкожная иммунизация морских свинок испытуемым и контрольным вакцинными штаммами дозами 5,5 х 10(1), 5 х 10(2), 5 х 10(3), и 5 х 10(4) м.к./мл должна предохранять их от гибели при подкожном инфицировании через 25 - 30 сут. дозой 1000 Dcl вирулентного штамма туляремийного микроба голарктического подвида, 1 Dcl которого не превышает 5 м.к.

По иммуногенности испытуемый штамм считают равноценным контрольному вакцинному штамму, если его минимальный показатель ЕД_50 не более максимального показателя туляремийного вакцинного штамма 15 НИИЭГ. Испытуемый штамм можно считать более иммуногенным, если его максимальный показатель ЕД_50 меньше минимального показателя ЕД_50 контрольного штамма. Методика определения иммуногенности штаммов приведена в прилож. 7.

12.3. Испытуемый вакцинный штамм при подкожной иммунизации морских свинок дозой 5 х 10(4) м.к., инфицированных на 7-е сут. культурой вирулентного штамма туляремийного микроба дозой 1000 Dcl, должен предохранять от гибели не менее 50% животных.

12.4. Напряженность иммунитета определяется по способности вакцинного штамма предохранять животных от гибели после заражения их вирулентным штаммом F. tularensis, а также индексом иммунитета. Напряженность иммунитета выражается количеством микробных клеток, при инфицировании которыми на 21-е сут. выживает более 50% морских свинок, иммунизированных 5 х 10(4) м.к. испытуемым и контрольным штаммами туляремийного микроба.

Индекс иммунитета - отношение величины LD_50, рассчитанной для вакцинированных животных, к аналогичному показателю не иммунизированных животных.

Напряженность и индекс иммунитета испытуемого штамма не должны быть ниже, чем аналогичные показатели у контрольного вакцинного штамма. При сравнении вышеуказанных показателей учитывается только статистически достоверная разница между испытуемым и контрольным штаммами.

12.5. Испытуемый штамм туляремийного микроба, введенный подкожно морским свинкам в дозе 5 x 10(4) м.к., должен вызывать иммунитет, по длительности не уступающий иммунитету, создаваемому у животных при иммунизации такой же дозой туляремийного вакцинного штамма 15 НИИЭГ.

Методика определения иммуногенности штамма для морских свинок по величине ЕД_50, напряженности, срокам формирования и длительности иммунитета приведена в прилож. 7.

13. Испытание стабильности испытуемого вакцинного штамма в производственных условиях

Испытуемый штамм, удовлетворяющий по результатам доклинических испытаний требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам туляремийного микроба, следует проверить на стабильность свойств перед изготовлением вакцины в производственных условиях. Технология изготовления живой туляремийной вакцины должна быть аналогична изложенной в регламенте производства на коммерческий препарат или, при наличии особенностей культивирования, должна быть описана авторами в экспериментально-производственном регламенте.

Испытуемый вакцинный штамм туляремийного микроба в производственных условиях при глубинном культивировании в полужидкой рыбно-дрожжевой среде в условиях аэрации должен давать максимальный выход биомассы, стабильно сохранять высокую жизнеспособность, культурально-морфологические, биохимические и иммуногенные свойства. Испытание штамма на стабильность данных свойств должно проводиться путем последовательного двукратного выращивания.

Контроль трех первых серий вакцины туляремийной живой сухой, приготовленной из нового штамма, должен проводиться в соответствии с действующей нормативной документацией на препарат вакцины и удовлетворять изложенным в ней требованиям.

14. Заключение

Испытуемый вакцинный штамм, удовлетворяющий настоящим методическим указаниям по всем свойствам, может быть допущен до следующего этапа внедрения - клинических испытаний на людях. На основании результатов государственных доклинических испытаний, заключений Национального органа контроля ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитета медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) о соответствии испытуемого штамма F. tularensis требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам данными методическими указаниями, Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации разрешает проведение на людях клинических ограниченных, а затем государственных испытаний вакцины, приготовленной на основе испытуемого штамма. Программа испытаний согласовывается с ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Комитетом МИБП и Комитетом по этике при Федеральном органе контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств.

Испытуемый штамм туляремийного микроба, удовлетворяющий всем перечисленным требованиям, прошедший с положительным заключением государственные испытания, может быть признан как вакцинный и утверждается Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко