Приложение 2 (обязательное). Определение остаточной вирулентности испытуемого вакцинного штамма на белых мышах

Приложение 2

(обязательное)

Определение остаточной вирулентности испытуемого вакцинного штамма на белых мышах

Определение остаточной вирулентности проводят параллельно для испытуемого и контрольного вакцинных штаммов. Для этого 140 белых мышей массой 18 - 20 г делят на 2 группы методом случайной выборки по 70 животных, 1 группа - для испытуемого штамма, 2 - для контрольного.

Используют двухсуточную агаровую культуру каждого штамма 2 пассажа, выращенную на питательной среде Мак-Коя или на FT-агарe. Готовят взвесь культуры концентрацией 1 х 10 м.к./мл. Затем последовательно десятикратно разводят в 0,9% растворе натрия хлорида с 10(-1) до 10(-8) , что соответствует от 1 х 10(8) до 10 м.к./мл и вводят животным подкожно в заднюю правую лапку по 0,5 мл приготовленных взвесей, что соответствует 5 х 10(6), 5 х 10(5), 5 х 10(4), 5 х 10(3), 5 х 10(2), 50 и 5 м.к. Каждую дозу каждого штамма вводят 10 животным. Для подсчета LD_50 и расчета вводимых доз производят высев культуры из разведения 10(-6) по 0,1 мл на 5 чашек, содержащих FT-агар. Гибель мышей учитывают в сроки до 21 сут. после введения культуры. Животных, павших на 5 - 10 сут., вскрывают, обращают внимание на патоморфологические изменения, производят посев селезенки методом отпечатка на питательную среду Мак-Коя или FT-агар (посевы инкубируют при температуре (37 +- 1)°С в течение 10 сут., ежедневно просматривая). Если в посевах обнаруживается рост культуры, ее идентифицируют в РИФ (реакции прямой иммунофлуоресценции) с иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими туляремийными (ФСП 42-0180-5315-04). Гибель мышей от испытуемого штамма устанавливают на основании патологоанатомических данных вскрытия (плотный инфильтрат на месте введения, гиперемия сосудов подкожной клетчатки и паховых лимфатических узлов, увеличение и уплотнение селезенки) и выделения из посевов туляремийного микроба.

Вакцинный штамм туляремийного микроба должен обладать остаточной вирулентностью для белых мышей, LD_50 его должна быть в пределах от 10(2) до 2 х 10(6) м.к.

Величину LD_50 вычисляют по формуле:

                  lgLD  = lgD - 1(Сумма L - 0,5), где

                      50                 i

    D       - максимальная из испытанных доз;

    L       - отношение числа животных, погибших   при  введении  данной

     i        дозы,  к общему числу  животных,  которым  эта  доза  была

              введена;

    Сумма L - сумма значений L_i, вычисленных для всех испытанных доз.

           i

Если величина LD_50 для контрольного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ окажется выше или ниже лимита, контроль повторяют по той же методике; если величина LD_50 для испытуемого штамма не удовлетворяет требованиям лимита, а контрольного штамма - удовлетворяет, испытуемый штамм не соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам по степени остаточной вирулентности.