Приложение 7 (обязательное). Определение иммуногенной активности испытуемого вакцинного штамма

Приложение 7

(обязательное)

Определение иммуногенной активности испытуемого вакцинного штамма

7.1. Определение иммуногенности при подкожном способе иммунизации морских свинок

Перед испытанием штамма на иммуногенность распределяют 66 морских свинок массой 300 - 400 г методом случайной выборки на три группы: 1 группа - 30 животных - для иммунизации контрольным вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ, 2 группа - 30 животных - для иммунизации испытуемым штаммом, 3 группа - 6 животных - контроль.

Для определения иммуногенности используют двухсуточные агаровые культуры испытуемого и контрольного вакцинных штаммов второй генерации, выращенные на питательной среде Мак-Коя или на FT-агаре. Готовят взвеси культур концентрацией 5 х 10(9) м.к./мл в 0,9% растворе натрия хлорида по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц соответствующего года выпуска. Затем делают последовательные десятикратные разведения этих взвесей до разведения 10(-9) (5 м.к./мл). Морских свинок иммунизируют подкожно в область верхней трети правого бедра испытуемым и контрольным вакцинными штаммами по 6 животных на каждую дозу: 5 x 10(4) м.к., 5 x 10(3) м.к., 5 х 10(2) м.к., 5 х 10(1) м.к. и 5 м.к. Культуру вводят одним шприцем в объеме 1 мл, начиная с меньшей дозы. Для подсчета ED_50 или расчета количества фактически введенных туляремийных бактерий производят высев из разведения 10(-7) по 0,1 мл на 5 чашек с FT-агаром.

Тест - заражающий штамм F. tularensis 503/840 (голарктического подвида) должен обладать типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. Должен быть высоковирулентным - 1 Dcl (Dosis certa letalis) для морских свинок при подкожном заражении не должна превышать 5 м.к./мл. Для заражения используют двухсуточную агаровую культуру заражающего тест-штамма 2 пассажа, выращенную на питательной среде Мак-Коя или на FT-агаре. Готовят взвесь культуры концентрацией 5 х 10(9) м.к./мл в 0,9% растворе натрия хлорида по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц, затем делают последовательные десятикратные разведения этой взвеси до разведения 10(-9) (5 м.к./мл), что соответствует 1 Dcl. Для подсчета ED_50 или расчета количества фактически введенных туляремийных бактерий производят высев из разведения 10(-7) по 0,1 мл на 5 чашек, содержащих питательную среду (кровяную, гемоглобиновую или FT-агар), по обычной методике.

Через 25 - 30 сут. после иммунизации морских свинок (30 иммунизированных контрольным штаммом и 30 испытуемым) заражают подкожно в область верхней трети левого бедра в дозе, соответствующей 1000 Dcl вирулентного штамма туляремийного микроба. Вирулентную культуру животным вводят в объеме 1 мл. Одновременно заражают по 3 контрольных морских свинки дозами 1 Dcl и 1000 Dcl. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 30 сут. Все контрольные морские свинки должны погибнуть в срок до 16 сут. Погибших животных регистрируют и вскрывают общепринятым методом, а органы и ткани (селезенку, печень, лимфатический узел из места введения, кровь) подвергают бактериологическому исследованию, высевая их методом отпечатков на питательную среду Мак-Коя или FT-агар.

Учет результатов посевов производят через 3 - 7 суток. Морских свинок с типичными для туляремии изменениями и выделением культуры туляремийного микроба считают погибшими от туляремии. Животных, погибших от неспецифических причин, исключают из числа взятых в опыт. В случае выживания контрольных свинок опыт следует повторить с использованием более вирулентного заражающего штамма.

Величину ЕД_50 испытуемого и контрольного вакцинных штаммов вычисляют по методу Кербера, описанному И.П. Ашмариным и А.А. Воробьевым (1962):

                   LgED  = lgD - 1(Сумма L - 0,5), где

                       50                 i

    D       - максимальная из испытанных доз,

    L       - отношение числа животных,  иммунизированных данной дозой и

     i        выживших после заражения, к общему числу животных, которых

              иммунизировали этой дозой,

    Сумма L - сумма значений L_i, найденных для всех испытанных доз.

           i

ED_50 вакцинного штамма для морских свинок должна составлять не более 1 000 м.к.

7.2. Определение сроков формирования специфического иммунитета у морских свинок, привитых испытуемым вакцинным штаммом

Для оценки иммуногенных свойств испытуемого вакцинного штамма важно определить сроки наступления иммунитета. Испытание проводят в сравнении с контрольным вакцинным штаммом туляремийного микроба 15 НИИЭГ. Культурой каждого штамма иммунизируют подкожно по 40 морских свинок дозой 5 х 10(4) м.к./мл. Заражение животных проводят двухсуточной культурой вирулентного штамма в дозе, соответствующей 1000 Dcl в объеме 1 мл на 3, 5, 7 и 14-е сут. после иммунизации (в каждый срок по 10 свинок). Одновременно с иммунизированными в каждый срок заражают по 3 контрольные (неиммунизированные) морские свинки в дозах, соответствующих 1 Dcl и 1000 Dcl. Наблюдение за зараженными животными проводят в течение 30 сут. Все контрольные морские свинки должны погибнуть в срок до 16 сут. Погибших животных вскрывают и исследуют бактериологически. Полученные данные обрабатывают, определяя сутки, на которые штамм защищает опытных животных.

7.3. Определение напряженности иммунитета у морских свинок

Для определения напряженности иммунитета морских свинок массой 300 - 400 г иммунизируют подкожно двухсуточными агаровыми культурами испытуемого и контрольного штаммов дозой 5 х 10(4) м.к./мл. Культурой каждого штамма иммунизируют по 40 свинок. На 30-е сут. после иммунизации животных заражают подкожно культурой вирулентного штамма туляремийного микроба дозами 100, 500, 2500 и 12 500 м.к./мл. На каждую заражающую дозу берут по 10 животных. Одновременно заражают 12 контрольных животных в дозах, соответствующих 1, 5, 25 и 125 м.к./мл (по 3 морские свинки на каждую дозу).

Наблюдения за зараженными животными проводят в течение 30 сут. Погибших животных вскрывают и исследуют бактериологическим методом. Результаты обрабатывают статистически - рассчитывают величину Dcl вирулентного штамма, полученную на иммунизированных и контрольных животных, определяют величину LD_50, от которой выжило 50% иммунизированных и контрольных животных.

Затем вычисляют индекс иммунитета для морских свинок, привитых испытуемым и контрольным вакцинным штаммом туляремийного микроба. Индекс иммунитета (ИИ) - это отношение величины LD_50 для вакцинированных животных к величине LD_50 для контрольных животных. LD_50 заражающего вирулентного штамма, при которой выжило 50% морских свинок, и величина индекса иммунитета для испытуемого штамма должны быть не меньше, чем таковые для контрольного вакцинного штамма.

7.4. Определение длительности иммунитета на морских свинках

Для определения сроков сохранения (длительности) иммунитета используют культуры испытуемого и контрольного вакцинных штаммов. По 40 морских свинок для испытуемого и контрольного штаммов иммунизируют подкожно дозой 5 x 10(4) м.к./мл. Заражение животных проводят 1000 Dcl вирулентного штамма туляремийного микроба через 3, 6 и 9 мес. после иммунизации (по 10 животных через 3 и 6 мес., а оставшихся живыми - через 9 мес.). Одновременно с введением вирулентной культуры иммунизированным животным в каждый срок заражают по 6 контрольных морских свинок (3 - 1 Dcl и 3 - 1000 Dcl). О длительности иммунитета судят по количеству животных, выживших в каждый срок заражения.

Длительность иммунитета, обеспечиваемого испытуемым штаммом, не должна быть меньше, чем для контрольного вакцинного штамма туляремийного микроба 15 НИИЭГ.