Приложение 4 (обязательное). Определение стабильности биологических свойств испытуемого вакцинного штамма на морских свинках

Приложение 4

(обязательное)

Определение
стабильности биологических свойств испытуемого вакцинного штамма на морских свинках

Стабильность биологических свойств культуры испытуемого вакцинного штамма туляремийного микроба определяют после 10-кратных пассажей ее на морских свинках массой 400 - 450 г при подкожном способе введения.

Для первого пассажа используют двухсуточную агаровую культуру испытуемого штамма второй генерации, выращенную на среде Мак-Коя или на FT-агарe. Готовят взвесь культуры концентрацией 1 х 10(9) м.к./мл (как описано в прилож. 1) и шприцем объемом 5 мл вводят по 1 мл в правую паховую область 2 морским свинкам. Через 4 сут. животных умерщвляют хлороформом и вскрывают. Для последующего пассажа у умерщвленных животных забирают регионарные (паховые) лимфатические узлы и селезенку (400 - 500 мг), помещают их в фарфоровую ступку с 1 - 2 г стерильного мелкого речного песка и растирают пестиком до гомогенного состояния.

Затем в ступку вносят 5 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия и суспендируют гомогенат; дают осесть крупным кусочкам тканей и песку на дно ступки, надосадочную жидкость забирают шприцем и вводят подкожно в правую паховую область по 0,5 мл 2 морским свинкам (второй пассаж). Параллельно делают посев суспензии на скошенную питательную среду в пробирках Мак-Коя или FT-агар для подтверждения наличия культуры испытуемого штамма F. tularensis. Посевы помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 +- 1)°С в течение 2 сут. Аналогично второму пассажу проводят пассажи с третьего по десятый, каждый раз на двух свинках и с параллельным высевом на питательную среду. Если в каком-либо из пассажей культура не выделяется, в дальнейшем используют культуру, полученную на питательной среде от предыдущего пассажа.

Субкультуру, выделенную после десятого пассажа, а также все субкультуры, выделенные от погибших животных и умерщвленных с явлениями генерализации, параллельно с культурой контрольного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ изучают: по культурально-морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам, безвредности (по методике, описанной в прилож. 1).

Безвредность определяют по укороченной схеме для морских свинок (дозы - 5 x 10(5) и 5 х 10(9) м.к.) и по полной схеме для белых мышей; вскрытие и исследование животных проводят на 7, 14 и 21-е сут. после введения. Методика исследования в соответствии с прилож. 3. Культура испытуемого вакцинного штамма F. tularensis после 10 пассажа должна быть стабильной и типичной по вышеперечисленным признакам в соответствии с прилож. 1 и 2.