Приложение 3 (обязательное). Определение остаточной вирулентности и безвредности испытуемого вакцинного штамма на морских свинках

Приложение 3

(обязательное)

Определение
остаточной вирулентности и безвредности испытуемого вакцинного штамма на морских свинках

Оценку безвредности вакцинного штамма туляремийного микроба проводят на здоровом поголовье морских свинок массой 400 - 500 г.

3.1. Перед началом опыта состояние здоровья животных оценивают совместно ветеринарный врач и член комиссии по изучению нового вакцинного штамма туляремийного микроба.

Поступивших животных выдерживают под наблюдением в течение 10 сут. обсервации. Оценку здоровья поголовья морских свинок начинают проводить с клинического осмотра, взвешивания, измерения ректальной температуры (не должна превышать 38°С). Повторное обследование животных (взвешивание, термометрирование, клинический осмотр) проводят накануне эксперимента (за сутки). Перед подкожным введением культур изучаемого и контрольного штаммов туляремийного микроба животных с учетом показателей массы тела распределяют на равнозначные группы для каждого штамма и каждой группы. На каждый штамм берут по 150 морских свинок - 4 равнозначных групп по 30 животных в каждой, и 30 - для контроля. В оценку состояния здоровья морских свинок входят данные патологоанатомического и гистологического исследований. Для этого из каждой группы по 10 животных вскрывают и исследуют в 3 этапа: в начале обсервации, в день начала опыта и через 30 сут. после постановки опыта.

3.2. Распространенность, приживаемость, безвредность и реактогенность культуры испытуемого вакцинного штамма F. tularensis, а также вызываемые им морфологические изменения в органах и тканях животных (морские свинки).

Данные характеристики исследуемого штамма определяют в одном опыте на одной и той же группе животных в сравнении с контрольным штаммом.

В опыте используют двухсуточные агаровые культуры 2 пассажа с питательной среды Мак-Коя или FT-агара испытуемого и контрольного штаммов. Каждую дозу 5 x 10(3), 5 x 10(5), 5 x 10(7) и 5 x 10(9) м.к. (дозы определяют по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П соответствующего года выпуска) вводят подкожно в правую паховую область 30 морским свинкам в объеме 1 мл. Для подсчета LD_50 и расчета вводимых доз производят высев культуры из разведения 10(-7) по 0,1 мл на 5 чашек, содержащих FT-агар.

3.3. Для определения распространенности, приживаемости микробов в органах и тканях, характера патоморфологических изменений, возникающих после введения культур, животных по 3 на каждую дозу поочередно умерщвляют хлороформом на 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28 сутки, оставшихся в живых животных умерщвляют на 45-е сут. после введения испытуемых культур. Сразу после умерщвления животных проводят их вскрытие и описание видимых патологоанатомических изменений и бактериологическое исследование внутренних органов, а также забирают органы для патогистологического исследования.

3.4. Вскрытие животных производят общепринятым методом. Для каждого животного берут отдельную банку емкостью 300 - 500 мл с притертой или резиновой пробкой, на 2/3 заполненную 10%-м раствором нейтрального формалина. В банку помещают бумажную этикетку, на которой графитовым карандашом четко и крупно написаны с обеих сторон: номер животного, шифр испытуемой культуры, дата взятия материала и день наблюдения. На бумажных этикетках пишут названия органов, которые после вскрытия помещают на них. Затем в банку для каждого животного помещают лимфатические узлы, кусочки органов и тканей вскрытого животного. Результаты патологоанатомического исследования записывают в протокол вскрытия (см. в конце приложения).

При вскрытии морских свинок отмечают состояние кожи, подкожной клетчатки, подлежащих мышц в месте введения микробной культуры, характер и распространенность отмечаемых в них изменений. Особое внимание обращают на степень инъекции сосудов подкожной клетчатки, величину отека, на развитие геморрагических, гнойных и некротических изменений. Указывают размеры (в мм) регионарных к месту введения культуры паховых лимфатических узлов, их цвет, плотность, спаянность с окружающими тканями и состояние отдаленных (контрлатеральных) подмышечных узлов. После высева методом отпечатков на плотную питательную среду кусочки ткани с места введения погружают в раствор формалина, а лимфатические узлы помещают на отдельную этикетку (см. выше) и опускают в фиксатор. Затем вскрывают брюшную и грудную полости. Отмечают полнокровие внутренних органов, состояние плевральных полостей, сальника, висцеральной брюшины, кишечника. Из всех внутренних органов (печень, селезенка, легкие, сердце) методом отпечатков производят посевы на поверхность питательного агара. При описании внутренних органов обращают внимание на наличие в легких мелких серовато-розовых очажков или тяжей, расположенных по ходу сосудов и бронхов, в печени и селезенке узелков и очагов некроза, отмечая их количество, размеры и внешний вид. Увеличение селезенки лучше регистрировать указанием ее размеров (длины, ширины, толщины). Кусочки органов берут обязательно на границе с измененными участками (если они обнаружены) и помещают в банку с фиксатором. После исследования легких, сердца, селезенки, печени и взятия из них кусочков размером 1 x 1 x 1 см, тонкий кишечник отодвигают в правую сторону (по отношению к свинке), пинцетом берут почку, надрезая ее, кроме этого для исследования берут надпочечник и подвздошные лимфатические узлы. Отмечают размеры, консистенцию, цвет, а также состояние окружающей клетчатки. Наконец, выделяют мезентериальные лимфатические узлы, расположенные ближе к корню брыжейки и характеризуют их по схеме, приведенной выше. В последнюю очередь берут костный мозг вместе с кусочком диафиза бедренной кости. При этом кость надо расщепить, т.к. она может препятствовать проникновению фиксатора. Собранный материал помещают в формалин на 14 сут. при температуре 18 - 25°С. После чего проводят его контроль на специфическую стерильность, затем подвергают дальнейшему гистологическому исследованию.

3.5. Во время вскрытия проводят высевы из органов, тканей и лимфатических узлов на агаровые пластины в чашках Петри с питательными средами FT-агаром, агаром с 1%-й кровью и агаром Эндо. На агар для выделения туляремийного микроба делают высев из места введения культуры, правого подвздошного лимфатического узла, костного мозга (первая чашка), из лимфатических узлов - правого пахового (регионарного) и левого пахового, правого и левого подмышечного (вторая чашка), из печени и селезенки (третья чашка), из легких и сердца (четвертая чашка). На агар с 1 - 2%-й кровью делают высев из легких и крови, на агар Эндо - из печени и селезенки. Высевы из органов проводят методом множественных отпечатков, костный мозг берут и сеют бактериологической петлей из бедренной кости, посев крови производят мазком-отпечатком отсеченной верхушкой сердца. Все посевы помещают в термостат при температуре (37 +- 1)°С на 5 - 7 сут. Погибших в ходе опыта животных исследуют так же, как и умерщвленных. Кроме того, при вскрытии погибших морских свинок дополнительно делают посевы на агар Эндо из тонкого, толстого кишечника и мезентериальных лимфатических узлов. Все посевы просматривают ежедневно начиная со 2 до 7 сут. инкубирования. В зависимости от результатов бактериологического исследования могут быть приняты следующие решения по дальнейшему ведению испытаний:

1) Культура туляремийного микроба выделена из всех внутренних органов. Штамм не может быть признан безвредным. Дальнейшие испытания вакцинного штамма следует прекратить.

2) Выделяемая из органов подопытных животных культура испытуемого штамма туляремийного микроба контаминирована посторонней микрофлорой. В этом случае вопрос может быть решен следующим образом:

а) если контаминированная посторонней микрофлорой культура испытуемого вакцинного штамма выделена из органов только нескольких (от 1 - 2 морских свинок из всей группы), то этих животных не учитывают при анализе результатов испытаний и опыт продолжают;

б) если контаминированная посторонней микрофлорой культура испытуемого вакцинного штамма выделена от большого числа опытных морских свинок, то следует считать, что опыт поставлен на неполноценных животных, и его необходимо повторить с использованием здоровых морских свинок.

3) Культуру испытуемого штамма из органов подопытных животных выделить не удалось, но на агаровых средах выявлен рост посторонней микрофлоры. Если такой результат получен в высевах из нескольких подопытных животных (1 - 2 морских свинок), то этих животных не учитывают. В том случае, когда посторонняя микрофлора выделена от большого числа животных, опыт повторяют на новой партии здоровых животных.

4) Если штамм удовлетворяет перечисленным требованиям, то он признается вакцинным.

3.6. Методика определения реактогенности вакцинного штамма для морских свинок. Реактогенность испытуемого и контрольного штаммов для морских свинок определяют по характеру прижизненных изменений в месте введения 5 х 10(3), 5 х 10(5), 5 х 10(7) и 5 х 10(9) м.к. и в регионарном лимфатическом узле, по изменению температуры и массы тела свинок. Наблюдения проводят за животными из опыта по изучению безвредности, которые согласно плану должны умерщвляться на 30-е сут. после введения культур. Животных осматривают через 1 - 2; 3 - 4; 7 - 8 и 10 - 11 сут. после введения им испытуемого штамма. Реакцию на месте введения определяют путем пальпации и измерения участков уплотнения, инфильтратов, путем определения размеров лимфатических узлов, их подвижности, болезненности.

Измерение температуры тела проводят ректально или орально с помощью медицинского термометра или другого, подобного ему по технической характеристике. Массу тела животного определяют с точностью до одного грамма.

3.7. Морфологические изменения у морских свинок изучают макроскопически и гистологически в динамике после однократного подкожного введения в правую паховую область культуры испытуемого штамма в малой (5 х 10(3) м.к.), средних (5 х 10(5) и 5 x 10(7) м.к.) и максимальной (5 х 10(9) м.к.) дозах двухсуточной агаровой культуры.

                           Протокол вскрытия

                           от ___________ г.

N животного ____________ вид ___________ пол __________ масса __________

температура тела _______ доза __________ Название    культуры __________

срок наблюдения _____________ Метод и место введения ___________________

Дата: введения ______________ гибели _______________ умерщвления _______

Результаты вскрытия

Упитанность ____________________________________________________________

Состояние подкожных сосудов ____________________________________________

Место введения _________________________________________________________

Лимфатические узлы:

Правый паховый _________________________________________________________

Левый паховый __________________________________________________________

Правый подмыш. _________________________________________________________

Левый подмыш. __________________________________________________________

Подвздошные ____________________________________________________________

Паратрахеальные ________________________________________________________

Бифуркационные _________________________________________________________

Легкие _________________________________________________________________

Селезенка ______________________________________________________________

Печень _________________________________________________________________

Почки __________________________________________________________________

Надпочечники ___________________________________________________________

Другие органы __________________________________________________________

________________________________________________________________________

Костный мозг ___________________________________________________________

Подпись                          Дата

Статистический анализ всех полученных результатов осуществляют с определением средних величин показателей и их доверительных интервалов для уровня вероятности 95% (И.П. Ашмарин и А.А. Воробьев, 1962).