Приложение 1 (обязательное). Идентификация испытуемого вакцинного штамма по видовым признакам

Приложение 1

(обязательное)

Идентификация испытуемого вакцинного штамма по видовым признакам

1.1. Подготовка к исследованию испытуемого и контрольного вакцинных штаммов туляремийного микроба

Ампулы с сухой культурой испытуемого и контрольного вакцинных штаммов туляремийного микроба вскрывают с соблюдением правил асептики и растворяют содержимое каждой ампулы в 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. Затем засевают полученной микробной взвесью ряд пробирок со скошенной питательной средой Мак-Коя* или FT-агаром (ФСП 42-0181-1372-01) и выращивают в течение 48 ч при температуре (37 +- 1)°С - получают культуру 1 пассажа, которую пересевают аналогично, получая культуру 2 пассажа. Часть пробирок исходной культуры 1 пассажа запаивают и хранят при температуре (4 +- 1)°С на случай повторения посевов и изучения свойств. Двухсуточную культуру 2 пассажа изучают по основным культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам.

1.2. Определение культурально-морфологических свойств испытуемого штамма туляремийного микроба

Культуры испытуемого и контрольного штаммов F. tularensis на питательной среде Мак-Коя растут в виде извилистого, слегка блестящего, почти бесцветного налета; на FT-агарe - в виде единичных беловато-серых блестящих круглых колоний не менее 1 мм диаметром. В мазках, окрашенных по Граму, микробы имеют вид грамотрицательных полиморфных мелких кокков или овоидных палочек. Для определения степени диссоциации изучаемого штамма из двухсуточной культуры 2 пассажа готовят взвесь концентрацией 5 х 10(9) м.к./мл туляремийного микроба в 0,9%-м растворе натрия хлорида по стандартному образцу мутности 10 единиц (ОСО 42-28-85П), разводят ее 0,9%-м раствором натрия хлорида в 5 раз до концентрации 1 х 10(9) м.к./мл, затем последовательно десятикратно разводят до концентрации 1 х 10(3) м.к./мл. Из этого разведения делают высев культуры по 0,1 мл на 5 чашек Петри, содержащих FT-агар, и инкубируют при температуре (37 +- 1)°С в течение 2 - 5 сут. После появления колоний чашки ставят в холодильник на 1 сут. при температуре (4 +- 1)°С, после чего подсчитывают не менее 100 колоний на каждой чашке. Не менее 80% из подсчитанных колоний должны быть иммуногенными (SR-типа) белого цвета.

1.3. Определение биохимических свойств испытуемого вакцинного штамма туляремийного микроба

1.3.1. Для определения биохимической активности испытуемого и контрольного вакцинных штаммов используют культуры со скошенного агара 2 пассажа. Определение ферментации углеводов (сахара, спирта) проводят в специальной жидкой среде** или среде Dawns***.

В случае ферментации углевода цвет среды становится желтым, при отрицательной реакции цвет среды остается без изменений.

1.3.2. Пробы на образование сероводорода и отсутствие выделения индола ставят в соответствии с инструкцией по применению систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов (СИБ) - ФСП 42-0100-3827-03.

Учет результатов: испытуемый вакцинный штамм образует сероводород и не выделяет индол.

1.3.3. Определение фосфатазной активности. В 1 мл 0,5%-го водного раствора додецилсульфата натрия готовят микробную взвесь испытуемого штамма туляремийного микроба и добавляют 1 мг фенолфталеиндифосфата. Смесь инкубируют при температуре 37°С в течение 30 мин и добавляют 1 каплю 1 N натрия гидроксида.

Учет результатов: испытуемый вакцинный штамм не изменяет цвет реакционной смеси.

1.3.4. Определение пенициллиназной активности. Фильтровальную бумагу, смоченную растворами бензилпенициллина (50 000 ед./мл) и крезолового красного (1мг/мл), помещают на дно чашки Петри. На поверхность бумаги наносят каплю микробной взвеси испытуемого штамма туляремийного микроба и 30 мин инкубируют при температуре 20°С.

Учет результатов: испытуемый вакцинный штамм окрашивает пробы в желтый цвет.

1.3.5. Определение чувствительности к эритромицину. Осуществляют методом дисков по методике, изложенной в "Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков" (МЗ СССР, Москва, 1983).

1.4. Определение серологических свойств испытуемого вакцинного штамма туляремийного микроба

Серологические свойства определяют с помощью пробирочной реакции агглютинации. Реакцию агглютинации испытуемого штамма ставят в соответствии с инструкцией по применению сыворотки диагностической туляремийной агглютинирующей по ФС 42-3492-98.

Характеристика основных свойств вакцинного штамма туляремийного микроба 15 НИИЭГ

Признак	Наличие признака
Морфология - мелкие кокки	+
Подвижность	-
Окраска по Граму - грамнегативные	+
Рост на питательной среде с 5 - 10% крови белых в SR-форме колоний (% к числу выросших)	Не менее 80
Агглютинабельность сывороткой диагностической туляремийной	До титра
Ферментация глюкозы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация мальтозы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация маннозы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация левулезы с образованием кислоты без газа	+
Ферментация глицерина	-
Образование сероводорода	+
Выделение индола	-
Чувствительность к эритромицину	-

______________________________

* Приготовление питательной среды Мак-Коя. Свежие куриные яйца моют щеткой с мылом в теплой воде, затем кладут в 5%-й раствор соды на 20 мин, после чего промывают теплой водой и помещают на 20 мин в 5%-й раствор карболовой кислоты, вновь промывают водой и кладут на 20 мин в 70° этиловый спирт. Из обработанных таким образом яиц стерильно извлекают желток, тщательно отделяя его от белка, желтки сливают в стерильный градуированный сосуд и смешивают со стерильным 0,9%-м раствором натрия хлорида рН 7,1 +- 0,1 в пропорции 60 частей желтка и 40 частей 0,9%-го раствора натрия хлорида. Желточную среду разливают в стерильные пробирки по 5 - 6 мл в каждую и помещают в аппарат для свертывания и инактивации сыворотки (МРТУ 42-2473-65) при температуре 80°С на 1 ч. Готовую среду ставят на сутки в термостат при температуре (37 +- 1)°С для проверки ее стерильности. Правильно приготовленная среда должна иметь на дне пробирки конденсационную жидкость. Среду хранят при температуре 4 - 6°С в течение одного месяца.

** Состав и приготовление жидкой среды для определения ферментации углеводов F. tularensis: пептон - 1 г; натрий хлорид (NaCl) - 5 г; калий гидрофосфат (К2НРО4) - 0,3 г; L-цистеин гидрохлорид - 0,1 г; феноловый красный - 0,02 г; сахар - 10 г (или глицерин - 10 мл) на 1 л дистиллированной воды. Смесь подогревают до полного растворения, остужают, устанавливают рН 7,2, разливают во флаконы по 100 мл. Стерилизуют автоклавированием при 115°С в течение 20 мин и разливают по 2 мл в пробирки. Пробирки должны быть химически чистыми и простерилизованными. Цвет среды - оранжево-красный. Культуру засевают по 1 полной бактериологической петле и инкубируют при температуре 37°С до 5 - 6 сут.

*** Среду Dawns готовят согласно "Руководству по лабораторной диагностике туляремии" (Иркутск, 1986): мясопептонный агар - 100 мл, цистеин - 0,05 г, индикатор бромтимоловый синий - 0,4 мл спиртового раствора, глицерин - 1 мл или по 1 г углеводов (глюкоза, мальтоза, манноза, левулеза). Приготовленную среду стерилизуют при 112 - 115°С в течение 20 мин, затем охлаждают до 40 - 50°С и добавляют 5% (от общего объема) нормальной лошадиной сыворотки, обязательно устанавливают рН 7,0 +- 0,1 (подкисляют соляной кислотой в разведении 1:1 или подщелачивают 20%-м раствором натрия гидроксида). Цвет среды должен быть зеленым. После чего готовят скошенные столбики среды в пробирках. Культуру высевают по 2 - 3 полные бактериологические петли на пробирки со скошенной средой Dawns с глюкозой, мальтозой, маннозой, левулезой и глицерином. При положительной реакции цвет среды изменяется на лимонный.