Приложение 5 (обязательное). Определение влияния испытуемого вакцинного штамма на иммунную систему морских свинок

Приложение 5

(обязательное)

Определение влияния испытуемого вакцинного штамма на иммунную систему морских свинок

Методика подготовки испытуемого штамма для данных определений аналогична описанной в прилож. 1.

Влияние испытуемого штамма на иммунную систему определяют на морских свинках массой 300 - 400 г. Экспериментальных животных иммунизируют однократно подкожно согласно прилож. 3 дозами 5 x 10(3) м.к. и 5 х 10(4) м.к. односуточной агаровой культурой испытуемого и контрольного вакцинных штаммов туляремийного микроба 15 НИИЭГ. Для проведения исследований по нижеперечисленным тестам каждую дозу испытуемого и контрольного штаммов вводят 10 животным.

Одновременно 10 морским свинкам вводят плацебо - 0,9%-й раствор натрия хлорида.

Группы животных формируются методом случайной выборки равнозначных по полу и массе. Иммунологические исследования проводят через 1, 3, 7, 14 и 28 сут. после введения испытуемого штамма. При обнаружении изменений в показателях необходимо срок наблюдения продлить до восстановления изучаемых показателей до исходного уровня и (или) уровня в контрольных группах.

Проводят следующие виды исследований в соответствии с РД 42-28-10-90 и "Медицинскими лабораторными технологиями" (Справочник, 2002). Животных для данных опытов используют тех же, что и для определения безвредности, реактогенности и приживаемости штамма (прилож. 3).

5.1. Определение количества лейкоцитов в крови

Готовят 3%-й раствор уксусной кислоты, подкрашенный для окраски ядер лейкоцитов несколькими каплями раствора метиленового синего. Раствор имеет голубой цвет, длительно хранится. В пробирку с 1,9 мл раствора уксусной кислоты вносят 0,1 мл крови (можно использовать стабилизированную антикоагулянтами венозную кровь) и перемешивают. Каплю содержимого пробирки помещают в счетную камеру Горяева. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин для оседания лейкоцитов. Затем помещают ее на столик микроскопа и при малом увеличении (окуляр 10х, объектив 8х) подсчитывают лейкоциты в 100 больших квадратах. Расчет лейкоцитов проводят по формуле:

                         а х 250 х 20

                     X = ------------ = а х 50, где

                             100

    Х   - число лейкоцитов в 1 мкл крови;

    а   - число лейкоцитов в 100 больших квадратах;

    20  - разведение крови;

    100 - число больших квадратов;

    250 - коэффициент  пересчета на 1 мкл, т.к.  объем  одного  большого

          квадрата  равен  1/250 мкл  (сторона квадрата - 1/5 мм, высота

          - 1/10 мм).

Практически для расчета количества лейкоцитов в 1 мкл крови их число в 100 больших квадратах умножают на 50, а в 1 л - полученную величину умножают еще на 10(6).

5.2. Определение лейкоцитарной формулы

Лейкоцитарной формулой называется процентное соотношение различных видов лейкоцитов, определяемое при подсчете их в мазке крови.

Для приготовления мазка на чистое, сухое, обезжиренное предметное стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места прокола) небольшую каплю крови, оставляя стекло в горизонтальном положении каплей вверх. Влево от капли прикладывают плотно ребром шлифованное стекло под углом 45° и соединяют его с каплей. Ждут несколько секунд, пока капля не расплывется полностью вдоль ребра шлифованного стекла. После этого быстрым, равномерным движением, не сильно надавливая, проводят по стеклу полосу в сторону, противоположную от капли. Мазки высушивают на воздухе. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, занимать почти всю длину стекла и заканчиваться неровными зигзагами в виде "метелочки". Фиксацию проводят в этиловом (10 мин) или метиловом (4 мин) спирте, окрашивают по Романовскому-Гимзе. В качестве красителя используют готовый раствор Романовского-Гимзы, который перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл нейтральной (рН 7,0) дистиллированной воды. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой партии красителя (25 - 40 мин).

Мазки просматривают в световом микроскопе (иммерсионная система, объектив 90х, окуляр 7х или 10х). На каждом стекле суммарно просчитывают не менее 200 клеток, учитывая отдельные виды лейкоцитов. Исходя из полученных результатов, вычисляют процентное содержание нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и других клеток белой крови. Чтобы определить содержание отдельных видов лейкоцитов в 1 мкл крови в абсолютных числах, необходимо сначала подсчитать общее количество лейкоцитов в 1 мкл крови и, отбросив две последние цифры, умножить на процент содержания отдельного вида. Например: количество лейкоцитов в 1 мкл крови равно 5 000, процент лимфоцитов равен 30. Следовательно, абсолютное количество лимфоцитов в 1 мкл крови будет 50 х 30 = 1 500.

5.3. Выделение лимфоцитов из крови морских свинок

Кровь у морских свинок берут из сердца в объеме 2 мл в пробирку со средой 199 или раствором Хенкса с (25 +- 0,5) ед/мл гепарина в соотношении 1 часть крови и 3 части среды. После перемешивания разведенную кровь наслаивают в пробирке на водный раствор верографина плотностью (1,077 +- 0,002) г/мл, не допуская смешивания слоев. Соотношение объемов 2:1. Затем центрифугируют (15 +- 1) мин при (450 +- 25) g. Пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром собирают образовавшееся над слоем верографина беловатое кольцо лимфоцитов. Полученная взвесь содержит примесь градиента плотности и тромбоцитов, которые удаляют путем 2-кратного отмывания клеток в охлажденном растворе Хенкса без ионов магния и кальция. Режим центрифугирования - (10 +- 1) мин при (280 +- 20) g. По завершении процесса отмывания клеток осадок ресуспендируют в среде 199 или среде Игла. Необходимая для дальнейших исследований концентрация клеток должна составлять 2 х 10(6) клеток в 1 мл.

5.4. Определение количества лимфоцитов во взвеси

Из полученного 1 мл клеточной взвеси после ресуспендирования отбирают 0,02 мл и переносят в пробирку с 0,38 мл 3%-го раствора уксусной кислоты, подсиненной раствором метиленового синего, затем перемешивают. Каплю содержимого пробирки помещают в счетную камеру Горяева. Клетки считают под микроскопом при малом увеличении (окуляр 10х, объектив 8х) в 100 больших квадратах и умножают полученное число на 5,0 х 10(4) (коэффициент пересчета количества клеток, подсчитанных в камере Горяева, в количество клеток, содержащихся в 1 мл взвеси). Необходимая для дальнейших исследований рабочая концентрация клеток должна составлять 2,0 х 10 клеток в 1 мл.

5.5. Определение жизнеспособности лимфоцитов

К 0,1 мл взвеси лимфоцитов в рабочей концентрации добавляют 1 каплю 0,2%-го раствора трипанового синего (или 0,1 мл 0,2%-го эозина БА в 0,9%-м растворе натрия хлорида, рН 7,2). Суспензию оставляют на 30 с при температуре (20 +- 2)°С, а затем под микроскопом в камере Горяева учитывают результат. Живые лимфоциты остаются бесцветными, а погибшие клетки окрашиваются. При правильном выделении лимфоцитов живых клеток должно быть не менее 98%.

5.6. Определение количества Т-лимфоцитов цитотоксическим тестом

Цитотоксический тест - это иммунологическая реакция, позволяющая выявить антигены, расположенные на поверхности жизнеспособных лимфоцитов. Основной принцип метода заключается в том, что антитела, направленные против различных лимфоцитарных антигенов, фиксируются специфически на клетках, содержащих эти антигены, и в присутствии комплемента нарушают целостность клеточной мембраны. Образование "отверстия" в мембране лимфоцитов позволяет прибавленному к взвеси красителю (трипановый синий) проникать внутрь клетки и окрашивать ее. Жизнеспособные с интактной мембраной клетки этим красителем не окрашиваются.

Коммерческую поликлональную сыворотку против Т-лимфоцитов разводят средой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке. В центрифужной пробирке или в лунке панели смешать 60 мкл сыворотки, 20 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл) и 20 мкл комплемента морской свинки в разведении 1:3. В контрольные пробирки или лунки вносят 20 мкл взвеси лимфоцитов (концентрация 10(7) кл/мл), 20 мкл взвеси комплемента и 60 мкл среды 199. Смеси перемешивают и инкубируют в термостате при температуре (37 +- 2)°С в течение 25 - 30 мин. В каждую пробирку или лунку добавляют по 1 200 мкл 0,5% раствора трипанового синего (500 мг красителя растворяют в 100 мл горячего 80 - 90°С 0,9%-го раствора хлорида натрия; перемешивают 10 мин на магнитной мешалке и фильтруют через фильтровальную бумагу). Через 30 - 60 с взвесь из лунки помещают в счетную камеру. Определяют число погибших клеток, вычисляют их процент от общего количества клеток в препарате, подсчитывают цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

                 % убитых клеток в опыте - % убитых клеток в контроле

     ЦТИ = 100 х ----------------------------------------------------

                         100 - % убитых клеток в контроле

ЦТИ указывает, какой процент клеток среди исследуемой взвеси несет соответствующий антигенный маркер и, следовательно, принадлежит к данной популяции.

5.7. Определение количества В-лимфоцитов цитотоксическим тестом.

Общее количество В-лимфоцитов определяют в цитотоксическом тесте с поликлональной специфической сывороткой против В-лимфоцитов. Постановка теста аналогична постановке цитотоксического теста с анти-Т-сывороткой.

5.8. Определение количества В-лимфоцитов иммунофлюоресцентным методом Принцип метода основан на том, что В-лимфоциты несут поверхностные иммуноглобулины, которые выявляются в реакции иммунофлюоресценции с помощью антииммуноглобулиновых антител, меченных флюорохромом.

В пробирки, помещенные на ледяную баню, вносят 0,1 - 0,25 мл суспензии лимфоцитов (5 х 10(6) лимф./мл) в растворе Хенкса с 1 - 5% раствором бычьего сывороточного альбумина. Затем добавляют равный объем иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих антивидовых против иммуноглобулинов морской свинки в рабочем разведении (раствор антител готовят в забуференном 0,9% растворе натрия хлорида). Смесь инкубируют и помешивают в течение 30 мин при (4+-0,5)°С в присутствии 0,25% раствора азида натрия, после чего суспензию клеток 3 раза отмывают, добавляя к осадку раствор Хенкса и центрифугируя (10 +- 1) мин при (450 +- 20) g. Последнее (третье) отмывание проводят охлажденным до 4°С забуференным 0,9% раствором натрия хлорида, так как раствор Хенкса и среда 199 обладают оптической активностью и могут искажать результаты микроскопии. Осадок ресуспендируют в 0,05 мл забуференного 0,9% раствора натрия хлорида и наносят на тщательно вымытое и обезжиренное предметное стекло (из нефлуоресцирующего стекла), с проведенными парафиновым стеклографом окружностями, ограничивающими исследуемый материал. Накрывают покровным стеклом, окантовывают вазелином и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа, используя светофильтры, рекомендованные инструкцией для ФИТЦ, и масляную иммерсионную систему. При микроскопии учитывают клетки, имеющие кольцевое или точечное (гранулярное) свечение. Диффузно окрашенные клетки не учитываются. Параллельно с помощью фазово-контрастного устройства проводят подсчет количества клеток в каждом поле зрения. Относительное процентное содержание В-лимфоцитов определяют после подсчета 200 - 300 клеток в препарате по формуле:

                          Х = В х 100/А, где:

    А - общее количество клеток;

    В - количество клеток со специфическим свечением.

Для подсчета абсолютного содержания В-лимфоцитов используют следующую формулу:

                       Д = А х Б х В/10 000, где:

    Д - абсолютное содержание В-лимфоцитов в 1 л крови;

    А - количество лейкоцитов в 1 л крови;

    Б - процентное содержание лимфоцитов в пуле лейкоцитов крови;

    В - процент В-лимфоцитов в пуле лимфоцитов крови.

Результаты исследований отражают в таблице:

Сутки исследования	Абсолютное содержание		Относительное содержание (%)
	В-лимфоциты	р с К	В-лимфоциты	р с К
Контроль (К)
1
3
7
14
28

5.9. Определение фагоцитарной активности макрофагов

Фагоцитарная активность (ФА) определяется процентом фагоцитирующих клеток и количеством захваченных частиц на один фагоцит (фагоцитарное число - ФЧ).

Клетки перитонеального экссудата (КПЭ) выделяют асептически от морских свинок опытной и контрольной групп. Делают разрез по срединной линии передней брюшной стенки и осторожно отсепаровывают кожный лоскут, не нарушая целостности брюшины. Через прокол иглой, соединенной со шприцом, в брюшную полость вводят 20 мл среды 199, содержащую 5 ME гепарина в 1 мл. Осторожно массируют переднюю брюшную стенку. Через 3 - 5 мин через надрез в брюшине пастеровской пипеткой, соединенной с резиновой грушей, собирают содержимое и сливают через нейлоновый фильтр в пробирки, стоящие на льду. Не используют экссудаты, содержащие примесь эритроцитов. Затем клетки осаждают центрифугированием (280 +- 20) g при температуре (4 +- 0,5)°С в течение (10 +- 1) мин, ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед/мл) до конечной концентрации 2 x 10(6) кл/мл. Полученную суспензию клеток разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм, которые инкубируют при температуре (37 +- 0,5)°С в атмосфере с 5% СО2. Через 60 мин смывают не прилипшие# клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл свежей среды 199 и инкубируют в течение следующих 18 ч при температуре (37 +- 0,5)°С в атмосфере с 5% СО2.

Клетки для исследования фагоцитоза можно получить также на половинках покровных стекол, помещенных в пробирки с 1,5 - 2 мл КПЭ.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, дрожжеподобные грибы Candida albicans или лабораторный штамм Staphilococcus (9198) или любые другие микробные клетки. Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре 90°С микроорганизмов отмывают не менее 3 раз 0,9%-м раствором натрия хлорида, ресуспендируют в нем и определяют концентрацию суспензии по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П 10 единиц. Взвесь разводят средой 199 до концентрации, соответствующей соотношению 1,0 - 2,0 х 10(9) м.к./мл.

Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывают 0,9%-м раствором натрия хлорида рН 7,2, осаждая центрифугированием при (400 +- 20) g в течение 5 мин. Готовят 0,5%-ю взвесь ЭБ на среде 199.

В чашки Петри, содержащие КПЭ, наливают 1 мл свежей среды 199 и вносят по 1 мл 0,5%-й взвеси ЭБ или соответствующих микроорганизмов и инкубируют при температуре (37 +- 0,5)°С в атмосфере с 5% СО2. Через 30 - 60 мин чашки споласкивают холодным раствором Хенкса, высушивают при комнатной температуре, фиксируют в метаноле (или в смеси Никифорова) или парами 10%-го раствора формалина (5 - 10 мин), окрашивают по Романовскому-Гимзе.

При микроскопии препаратов учитывают не менее 200 клеток, подсчитывая фагоцитирующие клетки и количество содержащихся в них ЭБ или микробов.

Результаты выражают процентом фагоцитирующих клеток (ФА) и фагоцитарным числом (ФЧ), которое определяется средним числом поглощенных ЭБ или микробов на один фагоцит.

Процент фагоцитирующих клеток (ФА) рассчитывается по формуле:

                          ФА = В х 100/А, где:

    А - общее количество клеток;

    В - количество   фагоцитирующих   клеток   с   поглощенными  ЭБ  или

        микробами.

Результаты исследований представляют для каждой дозы в таблице:

Сутки исследования	ФА	р с контролем	ФЧ	р с контролем
Контроль
1
3
7
14
28

5.10. Получение взвеси клеток селезенки

Животных умерщвляют и извлекают селезенку. Селезенку освобождают от прилежащих тканей, капсулы, измельчают в охлажденном растворе Хенкса без ионов кальция и магния и продавливают через стальное сито с диаметром пор 1 мм (или селезенку взвешивают на торсионных весах и осторожным раздавливанием в стеклянном гомогенезаторе готовят взвесь клеток из расчета 1 мл среды 199 на 50 мг ткани селезенки). Полученную суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр. Содержание ядросодержащих клеток селезенки определяют с использованием раствора трипанового синего. На основании полученной цифры и веса селезенки можно рассчитать абсолютное количество ядросодержащих клеток в селезенке. 0,5 мл взвеси спленоцитов отмывают 5 мл среды 199 путем центрифугирования в течение 10 мин при 150 g, надосадок удаляют, осадок разводят средой 199 с 10%-ми сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (100 ед/мл) до исходной концентрации.

5.11. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) спонтанная и под влиянием Т- и В-клеточных митогенов

Для спонтанной РБТЛ суспензию спленоцитов (5 x 10(6) кл/мл) на "среде культивирования" (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5 х 10(-5) М 2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) разливают в 96-луночную пластиковую панель по 200 мкл в лунку (по три лунки на каждый образец) и инкубируют в СО2-инкубаторе (5% СО2) при температуре 37°С в течение 72 ч. Затем добавляют (3)Н-тимидин в объеме 25 - 50 мкл в среде RPMI-1640 на лунку и инкубируют в тех же условиях еще 16 - 24 ч. По окончании инкубации клетки переносят на фильтры с помощью прибора "Cell Harwestr", фильтры после сушки в термостате при температуре 37°С помещают во флаконы, содержащие по 3 мл стинтилляционной жидкости (на 1 л толуола 0,2 г РОРОР и 5 г РРО).

Реакция бласттрансформации лимфоцитов под влиянием Т- и В-клеточных митогенов служит для оценки функциональной активности лимфоцитов. Специфическое распознавание митогена индуцирует в клетках пролиферацию, т.е. деление клеток. Некоторые митогены селективно стимулируют различные субпопуляции лимфоцитов. Например, КонА стимулирует тимоциты, зрелые и незрелые Т-клетки, ФГА стимулирует пролиферацию только зрелых Т-клеток. Такие митогены, как липополисахарид и бактериальный липопротеин стимулируют пролиферацию В-клеток. Благодаря этой селективности митогены могут использоваться для характеристики функционального состояния различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток.

Постановку РБТЛ под влиянием митогенов осуществляют так же, как спонтанную, только в опытные лунки добавляют Т- или В-клеточные митогены (не менее 3 лунок на каждый митоген) в оптимальной стимулирующей дозе (КонА 1 - 15 мкг/мл, ФГА 10 - 15 мкг/мл, ЛПС 15 - 100 мкг/мл). Контролем служат лунки с взвесью лимфоцитов без добавления митогенов.

Учет результатов.

Радиоактивность (имп/мин) образцов измерить с помощью бета-счетчика. Учет реакции можно проводить визуально, определяя процент бластных форм лимфоцитов. Результаты представляют в виде индексов стимуляции клеток (ИСК), которые подсчитывают по формуле:

                       имп/мин в культуре с митогеном

                 ИСК = -------------------------------

                       имп/мин в культуре без митогена

Результаты определений отражают в таблице:

Сутки	N животного	Стимуляция Т-системы				Стимуляция В-системы
		ФГА	р с К	Con A	р с К	ЛПС	р с К
7
14
28
Контроль (К)

5.12. Определение поликлональной активности В-лимфоцитов

Для получения этого показателя определяют число клеток, продуцирующих антитела к эритроцитам барана (АОК). Необходимо подчеркнуть, что иммунизация морских свинок эритроцитами барана в этих опытах не проводится, а определяют количество спонтанных "фоновых" АОК в селезенке. Увеличение их количества после введения вакцины является показателем поликлональной активации В-лимфоцитов. Число АОК в селезенке определяют методом локального гемолиза в геле.

Выявление антителообразующих клеток методом локального гемолиза в геле производят следующим образом.

Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывают 0,9%-м раствором натрия хлорида рН 7,2, осаждая центрифугированием при (400 +- 20) g в течение 7 мин, добавляют к 0,9%-му раствору агарозы* из расчета 2 - 3 х 10(7) эритроцитов в 1 мл. Полученную рабочую смесь разливают по 2,5 мл в пробирки, помещенные в водяную баню при температуре 43 - 44°С. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток селезенки (концентрация 10 кл/мл), перемешивают и выливают на чашку Петри, равномерно распределяя по дну. Через 5 мин чашки помещают в термостат при температуре (37 +- 0,5)°С на 1 ч. Затем в каждую чашку вносят путем наслаивания по 2,5 мл разведенного в 5 раз средой 199 комплемента морской свинки, сухого или разведенного в 10 раз свежезамороженного комплемента. После 30 мин инкубации при температуре (37 +- 0,5)°С, подсчитывают число зон гемолиза на каждой чашке. Рассчитывают число АОК на 1 х 10(6) ядросодержащих клеток селезенки. Рассчитывают индекс поликлональной стимуляции (ИПС) по формуле:

             число АОК на 1 х 10(6) ядросодержащих клеток в опыте

       ИПС = ----------------------------------------------------

              число АОК на 10(6) ядросодержащих клеток в контроле

Результаты исследований для морских свинок, иммунизированных дозами 5 х 10(3) и 5 х 10(4) м.к., отражают в табл.:

Сутки	Число АОК на 10(6)	Р с К	Индекс поликлональной стимуляции
Контроль (К)
3
7
14
28

5.13. Исследование иммунореактивности на гетерологичный антиген

Исследуют влияние испытуемого штамма на развитие иммунного ответа морских свинок на гетерологичный антиген (эритроциты барана) по формированию АОК к эритроцитам барана (ЭБ).

Для проведения этих экспериментов морских свинок разделяют на 2 группы по 8 штук в каждой. Морских свинок первой группы иммунизируют изучаемым штаммом, морские свинки второй группы - интактные (контрольные). Морским свинкам обеих групп вводят внутривенно по 1 мл 50% взвеси отмытых эритроцитов барана. Иммунный ответ на гетерологичный антиген оценивают по количеству АОК (5.10) через 4 сут после введения эритроцитов. Рассчитывают индекс поликлональной стимуляции (ИПС) по формуле:

           число АОК на 10(6) ядросодержащих клеток селезенки в опыте

    ИПС = -------------------------------------------------------------

          число АОК на 10(6) ядросодержащих клеток селезенки в контроле

Результаты исследований отражают в таблице:

Группа свинок	АОК к ЭБ	Индекс стимуляции	р с интактными
Иммунизированные
Интактные

______________________________

* Приготовление 0,9%-го раствора агарозы: навеску сухой агарозы (см. табл.) смешивают с дистиллированной водой, смесь кипятят на водяной бане до полного растворения агарозы; емкость с раствором переносят в водяную баню с температурой 43 - 44°С, добавляют 10-кратный раствор Хенкса, рН раствора доводят до 7,2 1%-м раствором КН2РО4 или NaOH (по цвету индикатора, присутствующего в растворе Хенкса и имеющего при значениях рН 6,8 - 7,0 - желтовато-оранжевый цвет, 7,2 - 7,4 розовато-красного цвета, при значениях рН выше 7,4 - малиновый цвет).

Количество чашек	Масса агарозы	Объем дистиллированной воды	Объем концентрата раствора Хенкса (10-кратный)
10	225 мг	22,5 мл	2,5 мл