Методические указания МУК 4.1.772-99 "Газохроматографическое определение концентраций метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в крови" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Методические указания МУК 4.1.772-99
"Газохроматографическое определение концентраций метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в крови"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 июля 1999 г.)

Дата введения: 6 сентября 1999 г.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений", ГОСТа Р1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение Метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в крови в следующих диапазонах:

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 1.5-2012 "Стандартизация в Российской Федерации. Стандарты национальные. Правила построения, изложения, оформления и обозначения", утвержденный приказом Росстандарта от 23 ноября 2012 г. N 1147-ст

метанол	0,016-2,0 мкг/см3,
этанол	0,010-2,0 мкг/см3,
изопропанол	0,005-2,0 мкг/см3,
пропанол	0,005-2,0 мкг/см3,
изобутанол	0,003-1,0 мкг/см3,
бутанол	0,003-1,0 мкг/см3.

МЕТИЛОВЫЙ СПИРТ

СН3ОН                                                  Мол. масса - 32,04

Метиловый спирт (метанол, древесный спирт) - бесцветная жидкость с характерным запахом. Ткип - 64,51°С, Тплавл - минус 97,88°С. Растворим в воде, этиловом спирте, эфире, ацетоне, бензоле. Сильный, преимущественно нервный и сосудистый яд с резко выраженным кумулятивным эффектом. Типичны поражения зрительного нерва и сетчатки глаза. Пары метилового спирта сильно раздражают оболочки глаз и дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.

ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ

СН3СН2ОН                                               Мол. масса - 46,07

Этиловый спирт (этанол, винный спирт) - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т_кип - 78,39°С, Т_плавл - минус 114,15°С. Смешивается в любых отношениях с водой, спиртами, эфиром, глицерином и другими растворителями. Оказывает наркотическое действие, класс опасности - 4.

ИЗОПРОПИЛОВЫЙ СПИРТ

(СН3)2СНОН                                             Мол. масса - 60,09

Изопропиловый спирт (2-пропанол) - бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом. Т_вспышки - 22,50°С, Т_плавл - минус 89,5°С. Смешивается в любых отношениях с водой, этиловым спиртом, эфиром; растворим в ацетоне; хорошо растворим в бензоле. Раздражает слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Пары могут повредить сетчатку глаза и зрительный нерв. Относится к 4 классу опасности.

ПРОПИЛОВЫЙ СПИРТ.

СН3СН2СН2ОН                                            Мол. масса - 60,09

Пропиловый спирт (пропанол) - бесцветная жидкость с характерным спиртовым запахом. Т_кип - 97,2°С, Т_плавл -минус 126,2°С. Смешивается в любых отношениях с водой, этиловым спиртом, эфиром; растворим в ацетоне; хорошо растворим в бензоле. Пары раздражают слизистые глаз и верхних дыхательных путей. Пропиловый спирт относится к 4 классу опасности.

БУТИЛОВЫЙ СПИРТ

СН3(СН2)2СН2ОН                                         Мол. масса - 74,12

Бутиловый спирт (1-бутанол) - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т_кип - 117,4°С, Т_плавл - минус 89,53°С. Смешивается в любых отношениях с этиловым спиртом, эфиром; хорошо растворим в ацетоне. Наркотик с раздражающим действием паров на слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.

ИЗОБУТИЛОВЫЙ СПИРТ

(СН3)2СНСН2ОН                                           Мол. масса -74,12

Изобутиловый спирт - бесцветная жидкость с характерным запахом. Т_воспл - 29°С, коэффициент распределения масло/вода - 0,44. Смешивается в любых отношениях с этиловым спиртом, эфиром; хорошо растворим в ацетоне. Наркотик с раздражающим действием паров на слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей. Относится ко 2 классу опасности.

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений при доверительной вероятности 0,95:

метанол	23,6%,
этанол	13,4%,
изопропанол	24,2%,
пропанол	22,2%,
изобутанол	24,0%,
бутанол	20,4%.

Сущность метода

Методика основана на предварительном выделении спиртов из биологического материала путем нагревания объекта в герметичном объеме и последующего газохроматографического анализа равновесной паровой фазы над жидкой пробой.

Измерение концентрации метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.

Нижний предел измерения в объеме пробы:

метанол	0,016 мкг,
этанол	0,010 мкг,
изопропанол	0,005 мкг,
пропанол	0,005 мкг,
изобутанол	0,003 мкг,
бутанол	0,003 мкг.

Определению не мешают ароматические углеводороды, спирты, альдегиды, карбоновые кислоты и другие органические соединения.

Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 40 мин.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Средства измерений

Газовый хроматограф серии "Цвет-500" с детектором ионизации в пламени (ПИД) или другие с аналогичными или лучшими характеристиками
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические		ГОСТ 24104-80Е

ГАРАНТ:

См. ГОСТ Р 53228-2008 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания", утвержденный приказом Ростехрегулирования от 25 декабря 2008 г. N 739-ст

Разновесы Г_2-210		ГОСТ 73208-82
Термометр лабораторный ТЛ-2, пределы 0 - 100°С, цена деления - 1°С		ТУ 25-2021- 003-88
Секундомер "Агат"		ГОСТ 5072-79
Шприц медицинский стеклянный вместимостью 5 см3		ТУ 64-1-378-83
Микрошприцы вместимостью 10 мм3 и 100 мм3		ТУ 2.833.104
Лупа измерительная		ГОСТ 25706-83
Линейка металлическая измерительная, цена деления 1 мм		ГОСТ 17435-72
Колба мерная вместимостью 1000 см3		ГОСТ 1770-74
Стеклянный сосуд вместимостью 30 - 40 см3 с герметично закрывающейся крышкой

Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стеклянная длиной 200 см и внутренним диаметром 2 мм
Дистиллятор		ТУ 61-1-721-79
Водяная баня
Редуктор кислородный		ТУ 26-05-235-70

Материалы

Гелий в баллоне		ТУ 51-940-88
Водород технический		ГОСТ 3022-80

Реактивы

Метанол для хроматографии, х. ч.		ТУ 6-09-1709-77
Этанол для хроматографии, ректификат		ТУ 6-09-1710-77
Пропанол-1 для хроматографии, х. ч.		ТУ 6-09-783-76
Изопропиловый спирт для хроматографии, х. ч.		ТУ 6-09-4522-77
Бутанол-1 для хроматографии, х. ч.		ТУ 6-09-4522-77
Изобутиловый спирт, очищенный для хроматографии, чистота 99%
Полисорб-1, носитель для газовой хроматографии, фракции 0,125 - 0,150 мм, обработанный 5% неподвижной жидкой фазы полиэтиленгликоль 3000 (ПЭГ 3000)
Вода дистиллированная		ГОСТ 6709-72

Требования к безопасности

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 12.1.004-85 постановлением Госстандарта СССР от 14 июня 1991 г. N 875 с 1 июля 1992 г. введен в действие ГОСТ 12.1.004-91

При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Требования к квалификации оператора

К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.

Условия измерений

При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +- 10)°С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С.

Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 30 см3/мин при температуре 150°С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Приготовление стандартных смесей

Исходный стандартный раствор для градуировки. В колбу вместимостью 1000 см3 вводят микрошприцем по 10 мм3 метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов и доводят водой до метки. Содержание спиртов в исходной стандартной смеси составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества):

метанол	7,97 мкг/см3;
этанол	7,89 мкг/см3;
изопропанол	7,85 мкг/см3;
пропанол	8,04 мкг/см3;
изобутанол	8,03 мкг/см3;
бутанол	8,10 мкг/см3.

Срок хранения исходного стандартного раствора в холодном месте - не более 2 суток.

Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки на градуировочных смесях спиртов. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (мм2) от концентрации соответствующего спирта в крови (мкг/см3) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из 5 рабочих стандартных растворов, готовят в герметично закрывающихся стеклянных сосудах (прилож. Б). Для этого в каждый сосуд вносят 2 см3 цельной крови, не содержащей спирты, и добавляют исходный раствор в соответствии с таблицей. Срок хранения растворов - 8 ч.

Таблица

Стандартные смеси для установления градуировочной характеристики при определении концентрации метанола, этанола, изопронанола, пропанола, изобутанола и бутанола в крови (фрагмент шкалы)

Номер смеси для градуировки	1	2	3	4	5
Объем исходного стандартного раствора, см3	5	25	50	200	400
Содержание метанола, мкг/см3	0,02	0,099	0,198	0,790	1,585
Содержание этанола, мкг/см3	0,019	0,098	0,197	0,790	1,578
Содержание изопропанола, мкг/см3	0,019	0,098	0,196	0,785	1,570
Содержание пропанола, мкг/см3	0,020	0,100	0,201	0,804	1,608
Содержание изобутанола, мкг/см3	0,020	0,100	0,200	0,803	1,605
Содержание бутанола, мкг/см3	0,020	0,101	0,202	0,810	1,619

Сосуд закрывают навинчивающейся крышкой с инертной прокладкой и нагревают на водяной бане при температуре 95 - 96°С в течение 10 мин. 5 см3 равновесной паровой фазы вводят в колонку хроматографа и анализируют при следующем режиме работы прибора:

начальная температура термостата колонок	60°С,
время термостатирования	250 сек;
скорость нагрева термостата колонок до конечной температуры	6°/мин;
конечная температура термостата колонок	110°С,
время термостатирования	300 сек;
температура детектора	130°С;
температура испарителя	120°С;
скорость подачи газов: газа-носителя (гелия)	30 см3/мин,
водорода	30 см3/мин,
воздуха	300 см3/мин;
скорость протяжки ленты самописца	0,3 мм/мин;
шкала измерителя тока	4 х 10(-10) А;
время удерживания: метанола	3 мин 05 сек,
этанола	5 мин 20 сек,
изопропанола	7 мин 20 сек,
пропанола	9 мин 00 сек,
изобутанола	10 мин 30 сек,
бутанола	11 мин 35 сек.

На полученной хроматограмме определяют площади пиков соответствующих спиртов и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.

Отбор проб

Для отбора проб используют чистую посуду с плотно закрывающейся крышкой. Отобранную для анализа пробу венозной крови в количестве 2 см3 сразу анализируют или хранят в холодильнике не более 24 ч при температуре не выше 4°С.

Выполнение измерений

2 см3 анализируемой крови переносят в сосуд, закрывают его инертной прокладкой и навинчивающейся крышкой с отверстием в центре и нагревают на водяной бане при температуре 95 - 96°С в течение 10 мин. Затем отбирают подогретым стеклянным шприцем 5 см3 равновесной паровой фазы и вводят в колонку хроматографа при вышеуказанном режиме работы прибора.

Вычисление результатов измерений

Расчитывают площадь пика соответствующего спирта по формуле:

                    S = h х L, мм2 , где

     h - высота пика, мм;

     L - ширина пика на половине высоты, мм.

По градуировочному графику определяют концентрацию соответствующего спирта в крови (мкг/см3).

Внутренний оперативный контроль

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

ГАРАНТ:

Взамен МИ 2335-95 Госстандартом России введена в действие с 1 октября 2003 г. рекомендация МИ 2335-2003

Оперативный контроль сходимости

Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений.

Результат контроля признается положительным при выполнении условия:

            S    - S

             max    min

           ------------- x 100 <= 22%, где

                -

                S

     S - площадь пика, мм2;

     -

     S - среднее арифметическое  значение  площади  пиков   при   вводе 3

параллельных проб градуировочного раствора.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 - 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой Х'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                  |Х' - Х - С| < К , где

                                  д

     С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией, мкг/см3;

     К  - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см3.

      д

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают

                                     2           2

                К  = кв.корень Дельта х' + Дельта х, где

                 д

           2           2

     Дельта х' и Дельта х - характеристики   погрешностей   для  исходной

пробы и пробы с добавкой, мкг/см3.

            Дельта х' = 0,165 х Х' и Дельта х  = 0,165 х X

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что

                   К'  = 0,84 х К

                    д            д

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.