Методические указания МУК 4.1.2112-06 Определение массовой концентрации хлороформа, 1,2-дихлорэтана, тетрахлорметана, хлорбензола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко от 9 августа 2006 г.)

Хлороформ (трихлорметан) CHCl3

Молекулярная масса 119,38

Хлороформ - бесцветная жидкость с характерным сладковатым запахом. Температура кипения 61,15°C, температура плавления (-63,5°C). Хлороформ растворим в органических растворителях и малорастворим в воде, наркотик [1].

Тетрахлорметан CCl4

Молекулярная масса 153,82

Тетрахлорметан - бесцветная жидкость. Температура кипения 76,75°C, температура плавления (-22,87°C). Тетрахлорметан растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. Тетрахлорметан - сильнейший наркотик [1].

1,2-Дихлорэтан C2H4Cl2

Молекулярная масса 98,97

1,2-Дихлорэтан - бесцветная жидкость. Температура кипения 83,5°C, температура плавления (-35,3°C). Растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. 1,2-Дихлорэтан является токсичным соединением [1].

Хлорбензол C6H5Cl

Молекулярная масса 112,56

Хлорбензол - бесцветная жидкость. Температура кипения 132°C, температура плавления (-45,6°C). Хлорбензол хорошо растворим в органических растворителях и малорастворим в воде. Хлорбензол - наркотик, действующий на систему крови подобно бензолу, но значительно слабее [1].

2. Сущность метода

Методика основана на предварительном концентрировании алифатических хлорированных соединений (хлороформ, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан) и ароматических (хлорбензол) при рН 8-10 из биологического материала (кровь) экстракцией диэтиловым эфиром и последующем газохроматографическом анализе экстрактов.

Выполнение измерений массовой концентрации алифатических хлорированных углеводородов проводят методом газовой хроматографии с детектором электронного захвата. Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды, алифатические спирты, трихлорэтилен при содержании каждого из указанных веществ не более 0,5 .

Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 30 мин.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

3.1. Средства измерений

Хроматограф газовый с детектором электронного захвата
Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические	ГОСТ 24104-01
Разновесы Г_2-210	ГОСТ 7328-01
Секундомер "Агат"	ТУ 25-1894.003-90
Микрошприцы МШ-10	ТУ 2.833.106-00
Линейка измерительная	ГОСТ 427-75
Лупа измерительная	ГОСТ 25706-83
Колбы мерные, вместимостью 25, 50, 100 и 1 000 см3	ГОСТ 1770-74
Пробирки мерные со шлифом 10 см3	ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные 5,10 см	ГОСТ 29227-91
Хлороформ фарм. Массовая доля основного вещества, % не менее 99,7	ГСО 7288-96
Тетрахлорметан. Массовая доля основного вещества, % не менее 99,9	ГСО 7211-95
1,2-Дихлорэтан, хч. Массовая доля основного вещества, % не менее 99,6	ГСО 7332-96
Хлорбензол, хч. Массовая доля основного вещества, % не менее 99,6	ГСО 7142-95

3.2. Вспомогательные устройства

Хроматографическая колонка стальная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм
Бидистиллятор стеклянный БС	ТУ 25-11.1592-81
Редуктор кислородный	ТУ 26-05-236-73
Центрифуга СМ-4, 3000 об./мин
Бюксы стеклянные	ГОСТ 25336-82
Воронка делительная	ГОСТ 23932-90

3.3. Материалы

Азот газообразный

ГОСТ 9293-74

3.4. Реактивы

Apiezon L на хроматоне N-cynep фракции 0,16-0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки
Диэтиловый эфир медицинский	ОСТ 84-2006-88
Щавелевая кислота, хч	ГОСТ 22180-76
Натрия гидроксид, чда	ГОСТ 4328-77
Серная кислота, осч	ГОСТ 14262-78
Калия дихромат, чда	ГОСТ 4220-75
Натрия хлорид, хч	ГОСТ 4233-77
Ацетон, осч	ТУ 2633-039-44493179-00

3.5. Растворы

Раствор калия дихромата, 3%-й

Раствор гидроксида натрия, 10%-й

Раствор щавелевой кислоты, 10%-й

4. Требования к безопасности

4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.

4.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (Утверждены МЗ СССР 20.12.82) и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (Утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87).

4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6. Условия измерений

6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха ()°C;

- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 при температуре 25°C.

6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.

7.1. Подготовка посуды

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть бидистиллированной водой и просушить при температуре 120°C.

7.2. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 30 при температуре 200°C в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

7.3. Приготовление аттестованных смесей

Для построения градуировочного графика собирают кровь, не содержащую определяемых соединений, и готовят серию рабочих аттестованных растворов.

Исходный аттестованный раствор 1 для градуировки. В мерную колбу объемом 1000 , содержащую бидистиллированную воду в объеме 500 , вводят микрошприцем 7 хлороформа ГСО 7288-96, 10 раствора тетрахлорметана концентрацией 48,93 . (Для приготовления раствора концентрацией 48,93 3 тетрахлорметана ГСО 7211-95 вводят в мерную колбу объемом 100 , содержащую бидистиллированную воду, и заполняют колбу до метки водой.) Весовое содержание определяемых веществ в исходной аттестованной смеси составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества): хлороформ: - 10,416 , тетрахлорметан - 0,4893 . Срок хранения раствора - 12 ч.

Исходный аттестованный раствор 2 для градуировки. В мерную колбу объемом 1000 , содержащую бидистиллированную воду в объеме 500 , вводят микрошприцем 5 1,2-дихлорэтана ГСО 7288-96 и заполняют колбу до метки водой. Весовое содержание определяемого вещества в исходной аттестованной смеси составляет (с учетом плотности) - 6,29 . Срок хранения - 12 ч.

Исходный аттестованный раствор 3 для градуировки. В мерную колбу объемом 100 , содержащую бидистиллированную воду в объеме 50 , вводят микрошприцем 1 хлорбензола и заполняют колбу до метки водой. Весовое содержание определяемого вещества в исходной аттестованной смеси составляет (с учетом плотности) - 11,066 . Срок хранения - 3 ч.

Раствор щелочи. В небольшом количестве бидистиллированной воды растворяют 30 г гидроксида натрия, количественно переносят в мерную колбу объемом 100 и заполняют колбу до метки водой.

7.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме () от массы хлорорганических соединений (мкг) и строится по 5 сериям рабочих аттестованных растворов. Каждую серию, состоящую из 5 аттестованных растворов, готовят в мерных колбах объемом 50 . Для этого в каждую колбу вносят по 2 крови и заполняют 30 бидистиллированной воды. Затем добавляют аттестованные растворы хлороформа, тетрахлорметана, 1,2-дихлорэтана и хлорбензола в соответствии с табл. 1 и доводят до метки.

Таблица 1

Рабочие аттестованные растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации хлорорганических соединений

Номер смеси	1	2	3	4	5	6
Хлороформ, объем исходного аттестованного раствора (10,416 мкг/см3), см3	0,01	0,05	0,10	0,50	1,00	2,00
Концентрация хлороформа, мкг/см3	0,002	0,0104	0,021	0,1	0,215	0,42
Тетрахлорметан, объем исходного аттестованного раствора (0,4893 мкг/см3), см3	0,01	0,05	0,10	0,15	0,20	0,25
Концентрация тетрахлорметана, мкг/см3	0,0001	0,0005	0,0010	0,0015	0,0020	0,0025
1,2-Дихлорэтан, объем исходного аттестованного раствора (6,29 мкг/см3), см3	0,2	0,5	1,0	2,0	5,0	10,0
Концентрация 1,2-дихлорэтана, мкг/см3	0,025	0,063	0,126	0,25	0,63	1,26
Хлорбензол, объем исходного аттестованного раствора (11,066 мкг/см3), см3	0,05	0,10	0,15	0,20	0,50	1,00
Концентрация хлорбензола, мкг/см3	0,011	0,022	0,033	0,044	0,110	0,220

Приготовленный аттестованный раствор помещают в делительную воронку объемом 250 , добавляют 30 г высаливателя - хлорида натрия, подщелачивают 30%-м раствором гидроксида натрия до достижения рН 8-10 и экстрагируют 10 диэтилового эфира. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин, после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку. Далее пробу центрифугируют при 7000 об./мин в течение 10 мин для денатурации белка. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 экстракта каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок - 90°С;

температура испарителя - 170°C;

температура детектора - 250°C;

расход газа-носителя (азот) - 30 ;

скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч;

время удерживания хлороформа - 3 мин 05 с;

тетрахлорметана - 4 мин 20 с;

1,2-дихлорэтана - 6 мин;

хлорбензола - 15 мин.

На полученной хроматограмме определяют площади пиков определяемых компонентов и по средним результатам из 6 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

7.5. Отбор проб

Отбор проб венозной крови в объеме не менее 10 производится в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно добавлено 0,1 раствора гепарина. Анализ крови проводить сразу или хранить в морозильной камере не более 5 дней.

8. Выполнение измерений

Пробу крови в объеме 2 доводят до 50 бидистиллированной водой, помещают в делительную воронку объемом 250 , добавляют 30 г высаливателя - хлорида натрия, подщелачивают 30%-м раствором гидроксида натрия до достижения рН 8-10 и экстрагируют 10 диэтиловго эфира. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин, после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку. Далее пробу центрифугируют при 7 000 об./мин в течение 10 мин для денатурации белка. После отстаивания эфирный экстракт сливают в другую пробирку. Полученный центрифугат в объеме 10 хроматографируют и проводят количественное определение анализируемых соединений в подготовленной пробе по калибровочному графику. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 7.4).

9. Вычисление результатов измерений

На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют концентрацию алифатических хлорированных углеводородов и хлорбензола в крови. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений , , расхождение между которыми не должно превышать значения предела повторяемости (табл. 3). Концентрации хлорированных углеводородов рассчитывают по формуле:

, где

А - количество компонента, найденное по калибровочному графику, мкг;

- объем экстрагента, ;

- объем экстрагируемой крови, ;

- объем хроматографируемой пробы, .

Результат измерений представляют в виде , где

- средний результат анализа, мкг/,

при условии: , где

- максимальный результат из 2-х параллельных измерений;

- минимальный результат из 2-х параллельных измерений;

- значение предела повторяемости, %;

- характеристика погрешности, при Р = 0,95 равная:

, где - относительное значение характеристики погрешности, %.

10. Внутренний контроль качества

Внутренний контроль качества (ВКК) измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа". Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, воспроизводимости

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, 3 мкг/см	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратиче- ское отклонение повторяемости), сигма , % r	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратиче- ское отклонение воспроизводимости) сигма R , % - Xl	Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности P = 0,95), +-дельта, %
Хлороформ, от 0,002 до 0,420 вкл.	8,4	10,5	34,8
Тетрахлорметан, от 0,0001 до 0,0030 вкл.	15,7	18,0	19,1
1,2-Дихлорэтан, 0,025 до 1,300 вкл.	3,7	12,1	16,0
Хлорбензол, от 0,011 до 0,200 вкл.	4,4	12,5	15,4

Таблица 3

Значения пределов повторяемости и воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 0,95

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/см3	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r_n, %	Предел внутрилабораторной воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории, но в разных условиях), R , % - Xl
Хлороформ, от 0,002 до 0,420 вкл.	13,3	29,0
Тетрахлорметан, от 0,0001 до 0,0030 вкл.	13,5	22,3
1,2-дихлорэтан, от 0,025 до 1,300 вкл.	10,2	15,8
Хлорбензол, от 0,011 до 0,200 вкл.	12,2	16,9

10.1. Контроль стабильности градуировочного графика

Контроль стабильности градуировочного графика проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемых соединений в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

10.2. Контроль повторяемости

Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы, с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать значения предела повторяемости (табл. 3).

Повторяемость результатов параллельных измерений признают удовлетворительной, если

, где

- значение предела повторяемости, %;

- максимальный результат из 2-х параллельных измерений;

- минимальный результат из 2-х параллельных измерений.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

10.3. Контроль воспроизводимости

Внутренний контроль воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т. д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

, где

- средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных измерений, ;

- средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных измерений, полученный в других условиях, ;

- значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % (табл. 3).

Расхождение между результатами измерений и , полученных в разных условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости при доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в табл. 3.

10.4. Контроль точности

Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом контрольного измерения содержания хлорированных соединений (хлороформ, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан, хлорбензол) в пробе с известной добавкой () в рабочей пробе без добавки () и величиной добавки (добавка должна составлять не менее 40% от содержания компонента в рабочей пробе) с нормативом точности К.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

, где

- средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, ;

- средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, ;

- величина добавки к пробе, .

Качество контрольной процедуры признают удовлетворительной при выполнении условия: .

При превышении норматива контроля К эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Периодичность контроля исполнения процедуры ВКК регламентируют согласно руководству по качеству лаборатории.

Литература

1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов: Справ. изд. /Под ред. В.А. Филова и др. Л.: "Химия", 1990.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас

Получить бесплатный доступ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.