Приложение 12. Сбор, подготовка, транспортирование и хранение клинических образцов для диагностики краснухи и СВК методом ИФА, ОТ-ПЦР, изоляции вируса на культуре клеток

Приложение 12

Сбор, подготовка, транспортирование и хранение клинических образцов для диагностики краснухи и СВК методом ИФА, ОТ-ПЦР, изоляции вируса на культуре клеток

I. Общая информация

Для выявления специфических краснушных IgM и IgG забор крови для получения сыворотки должен осуществляться в строго регламентированные сроки. Несоблюдение сроков сбора образцов сыворотки может быть причиной неправильной интерпретации результатов исследования.

В качестве клинических образцов для изоляции вируса краснухи на культуре клеток и экстракции РНК вируса с последующим проведением ПЦР и генотипирования при подозрении на краснуху беременной и СВК используются носоглоточные соскобы и смывы. При постнатальной краснухе нецелесообразно использовать для ОТ-ПЦР и изоляции вируса образцы крови в связи с коротким периодом вирусемии.

Информация по биологической безопасности

Клинические образцы потенциально могут содержать широкое разнообразие возбудителей инфекционных заболеваний, в связи с чем все манипуляции необходимо проводить с соблюдением правил работы с инфицированными материалами. Всегда следует надевать перчатки, при работе вне бокса - использовать защитные очки.

Материалы и оборудование

Набор для забора носоглоточных соскобов (стерильный зонд - тампон в пробирке)

Вакутейнеры 5 мл для забора крови на сыворотку

Градуированные центрифужные пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой 15 мл

Пробирки типа "Эппендорф"

Пластиковые пробирки с завинчивающейся крышкой 2 мл для замораживания образцов

Антибиотики: бензилпенициллина натриевая (калиевая) соль;

стрептомицина сульфат

Рефрижераторная центрифуга

Особые указания

Все процедуры следует проводить в условиях максимально возможной стерильности. Работать необходимо с охлажденными до 2...8°С образцами, не допуская их нагревания и воздействия прямого солнечного света.

На каждый образец обязательно заполнение направления на лабораторное исследование (прилож. 3, 4).

При выявлении специфических IgM в образцах сывороток, собранных от пациентов с постнатальной краснухой в первые три дня с момента появления сыпи, можно получить ложноотрицательные результаты (до 50% образцов). В то же время, вероятность выделения вируса наиболее высока при исследовании образцов, полученных в первые трое суток с момента появления сыпи. Таким образом, с одной стороны, не следует задерживать сбор образцов для вирусологических исследований, с другой - собирать сыворотку ранее 4-го дня с момента появления сыпи.

В связи с длительной циркуляцией краснушных IgM и персистенцией вируса краснухи у пациентов с СВК специфические IgM выявляются в ИФА, вирус может быть изолирован на культуре клеток и вирусная РНК детектирована в ОТ ПЦР с высокой вероятностью положительного результата теста в течение первых 3 месяцев жизни ребенка. В дальнейшем частота положительных находок снижается, однако у некоторых пациентов специфические IgM и вирус выявляются до года после рождения.

II. Сбор, подготовка, транспортирование и хранение клинических образцов

Сбор сывороток для серологических исследований

Для выявления специфических краснушных IgM y больных краснухой, в т.ч. беременных, оптимальными сроками забора крови являются 4-28 сутки с момента появления сыпи. Для выявления специфических краснушных IgG необходимо забирать два образца крови: первый - в первые дни заболевания, второй - через 10-14 дней. При обследовании беременной в очаге краснухи (контакт) кровь необходимо забрать в максимально ранние сроки и повторно - в зависимости от результатов исследования первой сыворотки.

При СВК наблюдается длительная циркуляция (до года после рождения) IgM в высоком титре, поэтому сроки забора крови не имеют большого значения, однако целесообразно обследовать новорожденных в первые дни жизни, при этом возможен забор и тестирование проб пуповинной крови.

Манипуляции

1. Заберите 5 мл (у детей до 5 лет - 1 мл) венозной крови в вакутейнер для получения сыворотки крови.

2. Центрифугируйте при 3000 об./мин в течение 15 мин для отделения сыворотки.

3. Осторожно, избегая повреждения эритроцитов, отберите сыворотку в стерильную пластиковую пробирку типа "Эппендорф".

4. Укажите на этикетке имя или идентификационный номер пациента, дату забора и тип образца.

5. Храните и транспортируйте сыворотку при 2...8°С, если есть возможность доставить ее в лабораторию для исследования в течение 72 ч с момента забора или при -20°С при необходимости более длительного хранения и транспортирования.

Не допускайте повторного замораживания - оттаивания сыворотки, так как это может оказать разрушающее воздействие на IgM антитела.

6. Доставьте образцы в лабораторию как можно скорее.

Взятие носоглоточных соскобов и смывов

Для изоляции вируса краснухи и экстракции РНК вируса могут быть использованы носоглоточный смыв или соскоб, собранные не позже 5-го дня с момента появления сыпи при постнатальной краснухе и в течение 1-го года жизни ребенка при СВК.

Манипуляции

Носоглоточный смыв

1. Предложите пациенту прополоскать горло 3-5 мл физиологического раствора.

2. Соберите промывные воды в стерильную пробирку.

3. Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при 4°С 1500 об./мин в течение 5 мин.

4. Удалите надосадочную жидкость.

5. Растворите осадок в 1 мл транспортной среды.

6. Образцы необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2...8°С в течение 48 ч.

7. В случае отсутствия возможности для доставки образцов в указанные сроки, заморозьте их и храните при температуре не выше -70°С.

Носоглоточный соскоб

1. Стерильным ватным тампоном с усилием (чтобы собрать достаточное количество клеток) протрите слизистую оболочку носоглотки пациента.

2. Тампон поместите в стерильную 15 мл пробирку с завинчивающейся крышкой, содержащую 3 мл транспортной среды.

3. Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2...8°С в течение 48 ч.

4. В случае отсутствия возможности доставки образца в указанные сроки, пробирку с тампоном энергично встряхните, чтобы смыть клетки, и извлеките тампон.

5. Осадите клеточную фракцию путем центрифугирования при 4°С 1500 об./мин в течение 5 мин.

6. Удалите надосадочную жидкость.

7. Растворите осадок в 1 мл транспортной среды.

8. Заморозьте и храните образцы при температуре не выше -70°С.

Носоглоточный соскоб может быть забран с использованием наборов для сбора образцов для вирусологических исследований. В этом случае образец забирается в соответствии с рекомендациями производителя набора. В качестве примера приведена процедура забора носоглоточного соскоба с использованием набора "VIROCULT".

1. Стерильным ватным тампоном с усилием (чтобы собрать достаточное количество клеток) протрите слизистую оболочку носоглотки пациента.

2. Поместите тампон в пробирку, сожмите дно пробирки, чтобы выделившаяся транспортная среда смочила тампон.

3. Образец необходимо доставить в лабораторию для исследования при 2...8°С в течение 48 ч.

4. В случае отсутствия возможности для доставки образца в указанные сроки, добавьте в пробирку 2 мл транспортной среды для выделения вирусов, пробирку с тампоном энергично встряхните, чтобы смыть клетки, и извлеките тампон, предварительно отжав его о стенку пробирки.

5. Перенесите жидкость в отдельную стерильную пробирку типа "Эппендорф" или пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой для замораживания образцов.

6. Заморозьте и храните образцы при температуре не выше -70°С.

Примечание: не используйте наборы для сбора образцов для бактериологических исследований и наборы с истекшим сроком годности.

III. Транспортирование образцов

Сыворотку транспортируйте при 2...8°С, если есть возможность доставить ее в лабораторию для исследования в течение 72 ч с момента забора, или при -20°С при необходимости более длительного хранения и транспортирования.

Замороженный носоглоточный смыв (соскоб) необходимо доставить в лабораторию для исследования как можно скорее при -70°С (сухой лед). При отсутствии такой возможности допускается кратковременное хранение и транспортирование (до лаборатории, осуществляющей тестирование) при -20°С. Следует учитывать, что эта температура не является оптимальной для хранения и транспортирования клинических образцов для вирусологических исследований на вирус краснухи.

Собранные образцы необходимо поместить в отдельные пластиковые пакеты с замком с небольшим количеством ваты для адсорбции влаги. Нельзя упаковывать клинические образцы от разных людей в один пакет. Несколько клинических образцов от одного пациента могут быть упакованы в один пакет большего размера.

Для транспортирования образцов можно использовать термоконтейнеры, термосы или пенопластовые коробки с хладоэлементами. Образцы надо расположить так, чтобы они со всех сторон были окружены замороженным (охлажденным до 2...8°С) хладоэлементом (можно использовать лед в герметичных пластиковых пакетах или бутылках).

Образцы для выделения вируса и экстракции РНК можно транспортировать при температуре 2...8°С (не более 48 ч с момента забора), используя хладоэлементы, охлажденные до соответствующей температуры, или в замороженном состоянии (-70°С в сухом льду в герметичных укупорках во избежание воздействия на образцы углекислоты).

Под крышку контейнера поместите сопроводительные документы (письмо с указанием вида и количества образцов, времени и даты отправки, направление на исследование).

На контейнере обязательно укажите подробные координаты отправителя и получателя образцов, а также необходимые предупреждающие надписи. Может оказаться полезным сделать следующую надпись "Хранить в холодильнике".

При одновременной отправке замороженных и хранящихся при 2...8°С образцов используйте отдельные контейнеры с хладоэлементами, обеспечивающими соответствующий температурный режим.

IV. Транспортная среда для выделения вирусов

Состав:

- основной раствор Хенкса рН 7,4 с ХЕПЕС буфером;

- бычий сывороточный альбумин;

- раствор антибиотиков;

- 0,4%-й раствор фенолового красного.

Растворите 2,0 г бычьего сывороточного альбумина в 100 мл дистиллированной воды. Добавьте к 80 мл дистиллированной воды 10 мл раствора Хенкса, затем добавьте 10 мл 0,2%-го раствора бычьего сывороточного альбумина (см. выше) и 0,2 мл раствора фенолового красного. Стерилизуйте фильтрованием. Добавьте 1 мл раствора антибиотиков.

Раствор антибиотиков

Растворите  ЕД пенициллина и 1,0 г стрептомицина в 100 мл стерильного фосфатного буферного раствора. Разлейте во флаконы по 5 мл и храните при -20°С. Добавление 1 мл этого раствора к 100 мл питательной среды позволяет получить рабочий раствор с окончательной концентрацией 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина в 1 мл раствора.

Примечание: при отсутствии транспортной среды можно использовать питательную среду для культур клеток (RPMI, ИГЛА и др.)