Приложение 6. Проведение реакции нейтрализации для определения титра нейтрализующих антител к полиовирусу

Приложение 6

Проведение реакции нейтрализации для определения титра нейтрализующих антител к полиовирусу

1. Готовят панели для микротитрования из расчёта 1 панель на каждый тип вируса, маркируют их, обозначая номер исследуемой сыворотки, тип вируса, дату постановки опыта.

2. Вносят 50 мкл питательной среды во все лунки панели, кроме лунок, предназначенных для контроля культуры клеток (ряды А-Н, колонки 11-12). В эти лунки вносят 100 мкл среды (рис. 2а).

3. Необходимый объем сыворотки, приготовленной для исследования, инактивируют в течение 30 мин при 56°С.

4. Готовят разведение 1:4 каждой исследуемой сыворотки, а также референс-сыворотки в поддерживающей среде с добавлением 2% сыворотки плодов коровы. Необходимо иметь как минимум 600 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки.

5. Вносят 50 мкл разведения 1:4 каждой сыворотки в соответствующие лунки колонок 1 и 2 в каждую из трёх панелей (рис. 2а).

6. Используя микропипетку с одноразовым наконечником, аккуратно перемешивают содержимое лунки 2 ряда А, отбирают 50 мкл, переносят в лунку 3, вновь перемешивают, отбирают 50 мкл, переносят в лунку 4 и т.д., включая лунку 10. Из лунки 10, соответствующей разведению 1:2 048, после перемешивания 50 мкл содержимого отбрасывают (рис. 2б).

Повторяют вышеописанные процедуры для ряда В, используя новый наконечник. Таким образом получены двукратные разведения от 1:8 до 1:2 048 сыворотки 1. Лунки колонки 1 рядов А и В служат для контроля токсичности сыворотки, в них не добавляют вирус.

7. Аналогично вышеописанному готовят последовательные разведения второй исследуемой сыворотки и референс-сыворотки. Таким образом, лунки рядов A-F колонок с 1 по 10 предназначены для исследования сывороток.

При титровании сывороток можно использовать многоканальные микропипетки. Следует убедиться, что они хорошо откалиброваны, наконечники соответствуют типу пипетки, в противном случае возможны значительные ошибки опыта.

8. Готовят суспензию нейтрализуемого полиовируса каждого типа с известным заранее титром в поддерживающей среде в количестве, достаточном для исследования намеченного числа сывороток. Разводят каждый вирус так, чтобы в 50 мкл вируссодержащей жидкости содержалось 100 . Для одной панели необходимо примерно 4,0 мл вируса.

8.1. Пример определения рабочего титра вируса.

При предварительном титровании референс-штаммов на культуре клеток Нер-2 был установлен их титр (конечная точка титрования):

полиовирус типа 1 - 9,02 lg/мл;

полиовирус типа 2 - 8,44 lg/мл;

полиовирус типа 3 - 8,66 lg/мл.

Разведение, которое даёт концентрацию 100 - это в 100 раз меньшее разведение, чем конечная точка титрования. Так как в лунку вносят 50 мкл разведения вируса, то его рабочее разведение должно быть в 20 раз (или на 1,3 lg) меньше. Таким образом рабочее разведение референс-штаммов будет следующим:

полиовирус типа 1 - 5,72 lg/мл (можно использовать разведение - 6);

полиовирус типа 2 - 5,14 lg/мл (можно использовать разведение - 5);

полиовирус типа 3 - 5,36 lg/мл (можно использовать разведение - 5).

8.2. Пример приготовления ряда последовательных разведений референс-штаммов.

Разведения	Объём среды для разведения, мл	Объём вирусной суспензии, мл
	0,9	0,1
	0,9	0,1
	0,9	0,1
	0,9	0,1
- рабочее разведение для полиовирусов типов 2 и 3	3,6	0,4
- рабочее разведение для полиовируса типа 1	3,6	0,4
	0,9	0,1
	0,9	0,1

9. Вносят 50 мкл рабочего разведения вируса определённого типа в лунки рядов А2-А10 - F2-F10 соответствующей типу вируса панели. В лунки колонок 1, 11, 12, а также рядов G и H вирус не добавляют (рис. 2в).

Ряды G и H предназначены для титрования референс-вируса для контроля рабочей дозы. Вносят 50 мкл последовательных разведений вируса, начиная с наибольшего (от 9 до 5).

10. Панели заклеивают специальной пластиковой плёнкой, закрывают крышкой, крайне осторожно постукивают пальцем по краю панели для лучшего смешивания ингредиентов в лунках и помещают на 3 ч в термостат при температуре 36°С.

11. Готовят суспензию клеток Нер-2 в ростовой среде в концентрации клеток в 100 мкл.

12. Добавляют по 100 мкл клеточной суспензии во все лунки всех панелей. Заклеивают панели, помещают в термостат при температуре 36°С на 5 дней. Учёт результатов начинают на 3-й день, окончательный учёт - на 5-й день.

При учёте результатов обращают внимание на состояние контролей культуры, токсичность сыворотки, результаты контрольного титрования рабочих разведений референс-вирусов. Для контроля рабочей дозы каждого из использованных в опыте вирусов по формуле Кербера рассчитывают титр вируса (прилож. 5). Если рабочая доза выходит за пределы 50-200 , результаты опыта не считают достоверными.

При учёте результатов обращают внимание на воспроизводимость уже известных титров референс-сыворотки. Если в опыте значения титров резко отличаются от ожидаемых, результаты опыта считают недействительными.

13. Рассчитывают конечную точку нейтрализации по формуле Кербера.

Логарифм 50% нейтрализующего титра = L - d (S - 0,5), где:

L = lоg наименьшего разведения сыворотки в опыте;

d = разница между lоg последовательных разведений;

S = сумма пропорций тест-объектов (лунок с культурой клеток), давших положительный результат (ЦПЭ) во всех испытанных разведениях сыворотки. Переводят разведения сыворотки в логарифмические значения (разведение 1:4 = 2, 1:8 = 3, 1:16 = 4 и т.д.). Титром антител в сыворотке считается её наибольшее разведение, защищающее 50% тест-культур от действия 100 вируса. Титр вируса часто выражают величиной, обратной разведению (т.е. при разведении 1:256 титр антител выражается как 256).

13.1. Пример расчёта титра сыворотки (рис. 2г, сыворотка 1).

Разведение сыворотки (lоg)		Пропорции тест-объектов
1:8	3	0/2 = 0
1:16	4	0/2 = 0
1:32	5	0/2 = 0
1:64	6	1/2 = 0,5
1:128	7	2/2 = 1
1:256	8	2/2 = 1
1:512	9	2/2 = 1
1:1 024	10	2/2 = 1
1:2 048	11	2/2 = 1
		S = 5,5