Приложение 5. Приготовление и титрование референс-штаммов (вакцинных штаммов Сэбина) вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3

Приложение 5

Приготовление и титрование референс-штаммов
(вакцинных штаммов Сэбина) вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3

Вакцинные штаммы Сэбина вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3 получают в НЦ и используют для приготовления рабочих запасов референс-штаммов.

А. Приготовление рабочих запасов референс-штаммов

Все процедуры выполняют в БЗУ 2-го класса защиты, одновременно работают только с вирусом одного типа. Оптимальным является работа с вирусом каждого типа в отдельные дни.

1) Готовят флакон площадью 25 с культурой клеток НЕр-2 (Cincinnati), сформировавшей сливной здоровый монослой в течение 2-3-х дней. Маркируют флакон.

2) Сливают ростовую среду и ополаскивают клеточный слой ФСБ.

3) Вносят во флакон 0,2 мл вируссодержащей жидкости из пробирки с прототипным референс-штаммом, полученным в НЦ. Оставшееся количество прототипного референс-штамма хранят при -20°С.

4) Инкубируют культуру при 36°С в течение 1 ч, периодически осторожно покачивая флакон для лучшей адсорбции вируса.

5) Добавляют поддерживающую среду (около 10 мл), содержащую 5% сыворотки плодов коровы. Флакон помещают в термостат при 36°С.

6) Культуру просматривают ежедневно. После распространения ЦПЭ на 75-100% клеточного монослоя, флакон трижды замораживают и оттаивают для разрушения клеток.

7) Содержимое флакона переносят в центрифужную пробирку, центрифугируют при 1 500 g 20 мин. Надосадочную жидкость по 0,5 мл переносят в пробирки, предназначенные для хранения референс-штамма, с этикетками, на которых чётко указаны тип клеток, вирусный штамм, дата приготовления. Приготовленные таким образом лабораторные референс-штаммы хранят при -20°С.

8) Определяют титр референс-штамма (пункт Б).

9) Эти запасы вируса могут быть использованы для приготовления нужных объёмов для проведения исследований, для проведения процедуры контроля чувствительности клеточных культур и пр. Не следует пассировать вирус в культуре НЕр-2 более 3-х раз.

Б. Определение титра референс-штаммов

1) Готовят разведение исследуемого вируса: 0,1 мл вируса вносят в пробирку, содержащую 0,9 мл среды.

2) Готовят ряд последовательных разведений от до . В маркированные соответствующим образом пробирки разливают по 9,0 мл среды, в первую вносят 1,0 мл разведения исследуемого вируса. Новой пипеткой перемешивают содержимое пробирки, переносят 1,0 мл в следующую, меняют пипетку, вновь перемешивают и переносят 1,0 мл, и т.д.

3) Переносят по 100 мкл разведения вируса из пробирок в лунки рядов А-Н колонок 1-10 панели для микротитрования (рис. 1а). Для получения статистически достоверных результатов определения титра референс-штамма используют разведения , каждое разведение вносят в 20 лунок.

4) Вносят по 100 мкл поддерживающей среды в лунки колонок А-Н рядов 11-12 для контроля клеток.

5) Готовят суспензию клеток в концентрации клеток/1,0 мл, вносят по 100 мкл во все лунки панели. Заклеивают панель плёнкой и помещают в инкубатор при температуре 36°С.

6) Ежедневно микроскопируют панель, наблюдая за появлением ЦПЭ, окончательно учитывают результаты на 5-7-й день. Тест считают действительным при образовании в лунках контроля сплошного монослоя нормальных клеток.

7) Рассчитывают титр вируса по формуле Кербера:

, где

L = lg наименьшего разведения сыворотки в опыте;

d = разница между lg последовательных разведений;

S = сумма пропорций тест-объектов (лунок с культурой клеток), давших положительный результат (ЦПЭ) в каждом разведении.

В данном примере (рис. 1б):

мл.