Методические указания МУК 4.1.2480-09 "Определение остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах" (утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)

Методические указания МУК 4.1.2480-09
"Определение остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах"
(утв. Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Введены впервые

Настоящие методические указания устанавливают методику определения дорамектина в мясе сельскохозяйственных животных и продуктах его переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящиеся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.

Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1. Краткая характеристика препарата

Общепринятое название: дорамектин, ветранал.

Название по номенклатуре ИЮПАК: 25-циклогексил-5-О-диметил-25-ди(1-метил-пропил) авермектин. CAS: 117704-25-3.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: , М.м. 899,11.

Физические свойства: белый порошок, без запаха. Хорошо растворим в ацетонитриле.

Торговая марка: эндектоцид "Дектомакс" ("Dectomax").

Фирма-производитель: "Pfizer",.

Форма выпуска: 1% раствор дорамектина в растительном масле.

Область применения. "Дектомакс" используется в качестве противопаразитарного средства широкого спектра действия для лечения и профилактики заболеваний крупного рогатого скота, овец и свиней. Средство предназначено для парентерального введения крупному рогатому скоту.

2. Методика определения остаточных количеств дорамектина в мясе сельскохозяйственных животных и продуктах его переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием ( нм, - 470 нм) после экстракции дорамектина из образца. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Метрологические характеристики метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой, погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры методики определения дорамектина в тканях сельскохозяйственных животных (р = 0,95, n = 10)

Анализируемый объект	Мышечная ткань, печень, почки, жир
Диапазон загрязнения, мг/кг	0,003-0,1	0,1-2,5
Предел обнаружения, мг/кг	0,001
Среднее значение степени извлечения, %	71,5	84,6
Стандартное отклонение повторяемости, Sr, мг/кг (в % от среднего значения)	0,017 (22,6)	0,078 (15,6)
Предел повторяемости, r, мг/кг (в % от среднего значения)	0,047 (62,6)	0,217 (43,4)
Предел относительной погрешности результата анализа, +-дельта, %	25,5	13,4

2.2. Реактивы

Ацетонитрил, квалификации "для ВЭЖХ";

Тетрагидрофуран, квалификации "ос.ч.";

Метанол, квалификации "для ВЭЖХ";

н-Гексан, квалификации "х.ч.", по ТУ 6-09-4521;

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

Натрия гидроокись, квалификации "ос.ч." по ГОСТ 4328;

Аммиак водный (25-30% ) квалификации "ос.ч." по ГОСТ 24147;

Триэтиламин, % (Sigma), CAS: 121-44-8;

Трифторуксусный ангидрид, % (Sigma);

Дорамектин (UK-67,994), 91,9%, "Pfizer".

2.3. Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы

Хроматографическая система, состоящая из жидкостного хроматографа высокого давления, дегазатора, спектрофлюориметрического детектора и системы для сбора и обработки хроматографических данных.

Колонка для ВЭЖХ, заполненная октадецилсиликагелем  мм, 5 мкм (например, Phenomenex Luna C18 или аналогичная);

Микрошприц объемом 25 мкл для ВЭЖХ (Hamilton, США);

Шприц для инъекций, пластиковый, объемом 25 ;

Виалы стеклянные с закручивающейся крышкой "для автосамплера" (в крышке окошко, герметично закрытое резиновой вкладкой), объемом 2-4 ;

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451;

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью  г;

Ротационный испаритель ИР-1М или аналогичный, ТУ 25-11-917;

Блендер;

Баллон со сжатым азотом квалификации "ПНГ" по ГОСТ 9293;

Воронка делительная на 250  по ГОСТ 25336

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770;

Колбы грушевидные по ГОСТ 25336 с конусом 14/23 вместимостью 100 ;

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 100 ;

Пипетки 4(5)-1-2, 4(5)-2-10, 4(5)-2-25 по ГОСТ 29227;

Фильтры беззольные ФО-ФС-15 "красная лента" и "синяя лента" по ТУ 2642-001-42624157;

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных в МУК.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб". Для длительного хранения образцы продуктов замораживаются и хранятся при -18°С до анализа.

Перед анализом образцы тщательно измельчают в гомогенизаторе или блендере.

2.5. Подготовка к проведению измерений

2.5.1. Приготовление подвижной фазы и кондиционирование хроматографической колонки

В мерную колбу вместимостью 1000  помещают 530  ацетонитрила, 270  тетрагидрофурана, 200  дистиллированной воды, тщательно перемешивают и выдерживают до комнатной температуры. Раствор дегазируют. Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.

2.5.2. Приготовление стандартных растворов дорамектина

0,050_0,001 г кристаллического дорамектина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 , растворяют в 50  ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в ацетонитриле с массовой долей дорамектина 0,5 .

Для построения градуировочной кривой методом последовательного разбавления ацетонитрилом готовят рабочие стандартные растворы с содержанием дорамектина 0,100, 0,010, 0,001 и 0,0001 . Отбирают аликвоты стандартных растворов, упаривают их на ротационном испарителе при температуре не более 40-45°С. Дорамектин переводят во флюоресцирующее производное, хроматографируют в трех повторностях (объем пробы 10 ). Строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации дорамектина в .

Основной и рабочие стандартные растворы дорамектина хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 4°С). Сроки годности основного раствора 12 месяцев, рабочих - 2 месяца.

2.5.3. Подготовка образца

Измельченный образец, массой 2,5 г помещают в 20  ацетонитрила, закрывают емкость пробкой или парафильмом, помещают в теплую (40-50°С) ультразвуковую баню на 20-25 минут. Затем охлаждают, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 5 минут. Супернатант декантируют в делительную воронку и обезжиривают двумя порциями гексана по 10 . Ацетонитрильный экстракт дорамектина собирают в круглодонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40-45°С.

2.5.4. Получение флуоресцирующего производного дорамектина

А.) Приготовление раствора аммиака в метаноле

В виалу (крышка герметичная с резиновой вкладкой, которую можно проколоть иглой) наливают 2-3  метанола, крышку завинчивают. На пластиковый шприц для инъекций надевают иглу, вынимают поршень. Внутрь шприца помещают 4-6 гранул сухого гидроксида натрия, наливают водный аммиак и вставляют поршень. Шприц переворачивают вверх иглой, выделяющийся газ вытесняет из иглы воду, на иглу надевают виалу так, чтобы аммиак барботировал через метанол. Поршень шприца придерживают, насыщение происходит в течение 0,5-1 минуты. Перед каждым анализом рекомендуется готовить свежий раствор аммиака в метаноле.

Б.) Получение флуоресцирующего производного дорамектина

К остатку после упаривания аликвоты стандартного образца или пробы добавляют 0,15  ацетонитрила, 0,1  триэтиламина и 0,05  трифторуксусного ангидрида, смесь перемешивают и отдувают в токе азота на водяной бане. К оставшемуся в колбе маслянистому содержимому добавляют 0,25  свежеприготовленного 2М раствора аммиака в метаноле, снова отдувают в токе азота на водяной бане, добавляют к содержимому 0,4  ацетонитрила (объем пробы V пр = 0,5 ). Аликвоту раствора образца V х (от 0,005 до 0,02 ) вводят в хроматограф.

2.6. Выполнение измерений

Условия хроматографического анализа.

Хроматографическая колонка: Колонка для ВЭЖХ, заполненная октадецилсиликагелем (например, Phenomenex Luna С18,  мм, 5 мкм);

Подвижная фаза:

ацетонитрил - 53%, тетрагидрофуран - 27%, вода - 20% об.;

Скорость подачи элюента: 1,0 .

Детектирование: флюориметрическое, = 360 нм, - 470 нм.

Объем вводимой пробы 5-20 мм Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,1 - 125 нг дорамектина.

Абсолютное время удерживания дорамектина в приведенных условиях -  минут.

Хроматограмма образца сала, добавка дорамектина составляет 10 мкг/кг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза, вычисляют среднюю площадь пика, соответствующего дорамектину.

2.7. Обработка результатов измерения

2.7.1. Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой

Отбирают аликвоты стандартных растворов, упаривают их на ротационном испарителе при температуре не более 40-45°С. Дорамектин переводят во флюоресцирующее производное, хроматографируют в трех повторностях (объем пробы 10 ) (пункт 2.6.). Строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации дорамектина в .

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят при смене колонки и/или предколонки; при замене стандартного образца и/или реактивов; после проведения ремонта; после длительного простоя хроматографа (2 недели и более);

2.7.2. Оформление результатов

Содержание дорамектина можно рассчитать по градуировочному графику или методом внешнего стандарта. В последнем случае для расчетов используют стандартный раствор, площадь пика которого наиболее близка к площади пика дорамектина в образце. Для расчета по методу внешнего стандарта используют формулу:

, где

Х - содержание дорамектина в пробе, мг/кг;

- содержание дорамектина в стандартном растворе, ;

- площадь пика дорамектина в анализируемом образце;

- площадь пика стандарта;

- объем аликвоты стандартного раствора дорамектина, .

Vобр - объем образца (0,5 )

- объем образца, введенный в хроматограф (0,005-0,02 )

3. Оперативный контроль результатов измерений

3.1. Контроль повторяемости результатов определения

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

- предел относительной погрешности (таблица 1), в %.

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

4. Требования техники безопасности

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

5. Требования к квалификации операторов

Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области газожидкостной хроматографии и санитарной химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями, а также с правилами безопасности при работе в химической лаборатории (п. 3).

6. Условия измерений

Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.