Приложение 4.. Методические указания по определению относительного содержания сывороточных белков молока

Приложение 4.

Методические указания
по определению относительного содержания сывороточных белков молока

Настоящие методические указания устанавливают методику, позволяющую идентифицировать белки молочной сыворотки методом хроматографии. Они предназначены для органов и учреждений Роспотребнадзора, а также организаций, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания в соответствии с Федеральным законом от 12.06.2008 г. N 88-ФЗ "Технический регламент на молоко и молочную продукцию". Метод идентификации применим как к сырому молоку коровьему, так и к молоку питьевому (прошедшему термическую обработку).

1. Сущность метода.

Метод идентификации белков молока основан на хроматографическом разделении с помощью эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления белков водорастворимой фракции коровьего молока (предварительно обезжиренного и отфильтрованного).

При проведении исследования определяются: - суммарное содержание альфа-лактоальбумина и бета-глобулина, - суммарное содержание всех белков растворимой белковой фракции, включая ассоциаты казеинов. Анализируется соотношение суммы альфа-лактоальбумина и бета-глобулина к сумме белков водорастворимой фракции и делается заключение о том, является ли входящий в состав продукции белок цельным белком молочной сыворотки.

2. Реактивы.

1. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

2. Натрия хлорид (квалификации не ниже ХЧ) по ГОСТ 4233 Реактивы. Натрий хлористый.

3. Стандартные образцы для калибровки колонки "Protein molecular weight standards" Kit MS II, Serva, Германия (кат. N 39064 по каталогу Serva).

3. Приборы, вспомогательное оборудование, лабораторная посуда.

1. Хроматограф жидкостной изократический высокого давления со спектрофотометрическим проточным детектором с длиной волны 280 нм и системой подготовки элюента и хроматографической, предварительно откалиброванной по стандартным глобулярным водорастворимым белкам известной молекулярной массы.

2. Колонка TSK GEL G2000SWLX ( см) (кат. номер 18674 по каталогу Tosohbioscience)

3. Центрифуга лабораторная (6000 об/мин)

4. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью  г.

5. Пробирки типа "эппендорф" объемом 2,5 .

6. Фильтры капроновые 0,45 мкм или аналогичные.

7. Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

8. Фильтрующие насадки 0,22 мкм.

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими и техническими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных.

4. Отбор проб.

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

5. Подготовка к определению.

Образец молока объемом 5,0  помещают в полиэтиленовую пробирку объемом 6,0 . Пробирку центрифугируют 60 минут при 6000 об/мин и температуре +5°С. Аликвоту прозрачной части фильтруют через фильтрующую шприцевую насадку с размером пор 0,22 мкм в стеклянный флакон. Объем фильтрата должен составлять не менее 2,0 .

6. Условия хроматографии и калибровка хроматографической колонки.

Хроматографическая колонка калибруется по стандартным глобулярным водорастворимым белкам известной молекулярной массы по времени удерживания (или расстоянию максимума пика на ленте самописца). Строится калибровочная кривая зависимости десятичного логарифма молекулярной массы от времени удерживания (или расстояния на ленте самописца), как это показано на рис. 1.

Условия хроматографии следующие: скорость элюирования 0,2 , ультрофиолетовый проточный детектор 115UV(280 нм), объем образца, инжектируемого в колонку 100 мкл.

В качестве элюента используется 0,2М раствор NaCl. Элюент готовится следующим образом: в колбу емкостью 1000  вносится 24,0 г натрия хлорида, добавляется 600  дистиллированной воды. После полного растворения объем доводится до 1000  дистиллированной водой. Полученный раствор отфильтровывается через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

В откалиброванную колонку инжектируется 100  раствора обезжиренного и отфильтрованного, как описано в разделе 5 сырого коровьего молока и получаемая хроматограммма (рис. 2) используется как эталонный образец сырого коровьего молока для сравнения с хроматограммами таким же образом обезжиренного и отфильтрованного коровьего молока анализируемых образцов.

7. Проведение хроматографического анализа.

Исследуемый образец обезжиренного и отфильтрованного молока хроматографируется при условиях, описанных в разделе 6.

Характерные хроматограммы сухого молока приведены на рис. 3 и 4.

8. Обработка результатов измерения.

Интегрирование проводится после определения базовой линии. Определяется площадь пика бета-лактоглобулина (S1), площадь пика альфа-лактоальбумина (S2), площадь пика ассоциата казеина (S3). Рассчитывается соотношение Х, %:

Значение соотношения Х,% для различных видов молока приведено в таблице:

N	Вид молока	Значение Х, %
1.	Сырое молоко	не менее 42
2.	Молоко термообработанное	не более 38

Погрешность определения соотношения Х,% составляет +/- 5% от полученной величины

Условия хроматографии:

TSK GEL G 2000 SWLX ( см) Элюент 0,2MNaCl

Скорость элюирования 0,2  УФ детектор 115UV(280 нм)

По оси абсцисс - молекулярные массы (килодальтон, кД) По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм (отн.ед.)

Условия хроматографии:

Элюент 0,2М NaCl

Скорость элюирования 0,2 

УФ детектор 115UV (280 нм)

По оси абсцисс - молекулярные массы (кД)

По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм (отн.ед.)

Условия хроматографии:

Элюент 0,2М NaCl

Скорость элюирования 0,2 

УФ детектор 115UV(280 нм)

По оси абсцисс - молекулярные массы (кД)

По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм (отн.ед.)

Условия хроматографии:

Скорость элюирования 0,2 

УФ детектор 115UV(280 нм)

По оси абсцисс - молекулярные массы (кД)

По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм (отн.ед.)

Условия хроматографии:

Скорость элюирования 0,2 

УФ детектор 115UV(280 нм)

По оси абсцисс - молекулярные массы (кД)

По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм (отн.ед.)

Условия хроматографии:

Скорость элюирования 0,2 

УФ детектор 115UV(280 нм)

По оси абсцисс - молекулярные массы (кД)

По оси ординат - оптическая плотность при 280 нм (отн.ед.)

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

8. Требования техники безопасности

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на оборудование.

10. Требования к квалификации операторов

Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области аналитической химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями, а также с основными правилами безопасности при работе в химической лаборатории.

11. Условия измерений

Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1-2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.

Температура окружающего воздуха должна быть от 15 до 25°С. Относительная влажность воздуха не более 80% при 25°С. Атмосферное давление 730-760 мм рт. ст. Напряжение электропитания и частота тока - по ГОСТ 13109.