Методические указания МУК 4.1.1919-04 "Определение массовой концентрации авермектиновых комплексов (аверсектина С и аверсектина С_1) в молоке и плазме животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием" (введены в действие Главным государственным санитарным врачом РФ 5 августа 2004 г.)

4.1. Методы контроля. Химические факторы

Методические указания МУК 4.1.1919-04
"Определение массовой концентрации авермектиновых комплексов (аверсектина С и аверсектина ) в молоке и плазме животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием"

(введены в действие Главным государственным санитарным врачом РФ 5 августа 2004 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Введены впервые

1. Область применения

Методические указания по определению массовой концентрации авермектиновых комплексов (аверсектина С и аверсектина ) в молоке и плазме животных предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями Госсанэпидслужбы Российской Федерации, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества пищевых продуктов в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", СанПиН 2.3.2.1078-01 и МДУ ГН 2.3.2.708-98 и аккредитованных в установленном порядке.

2. Общие положения

Аверсектин С и Аверсектин - противопаразитарные препараты, представляющие собой комплексы близких в химическом отношении веществ - авермектинов, образуемых культурой Str. avermitilis. Отличия между ними заключаются в соотношении отдельных авермектиновых компонентов: так, основным компонентом аверсектина С является авермектин , тогда как основные компоненты аверсектина - авермектины и .

Аверсектины С и являются действующими веществами ряда противопаразитарных лекарственных средств, используемых в ветеринарии (1 и 20% аверсекта-2, аверсекта-3, мази аверсектиновой и др.).

Настоящие методические указания устанавливают хроматографическую методику количественного анализа молока и плазмы на содержание авермектинов после применения аверсектинсодержащих препаратов с нижним пределом измерения 0,001 мг/кг.

3. Физико-химические свойства, токсикологическая характеристика

Аверсектины С и включают 4 гомологичных пары авермектинов: ; ; ; , каждая из которых состоит из основного компонента, обозначаемого "а" и минорного - "в".

Авермектины представляют собой 16-ти членные макроциклические лактоны, содержащие по два остатка олеандрозы, соединенных гликозидной связью. Авермектиновые компоненты различаются между собой алкильными заместителями у 5-го и 26-го углеродных атомов и связью между 22 и 23 углеродными атомами (см. формулу).

Авермектины с индексом "в" (содержащие у 26-го углеродного атома радикал ) являются минорными соединениями, их содержание в сумме не превышает 10% всего авермектинового комплекса.

Эмпирическая формула и молекулярная масса авермектиновых компонентов

Группа	Тип авермектина	Регистрационные номера пo CAS (1994 г.)	Эмпирическая формула	Молекулярная масса	Заместители		22X23
					R_5	R_26
А_1	А_1a	- 65195-51-9	С49Н74О14	886	СН3	С2Н5	СН=СН
	A_1b	- 65195-53-1	С48Н72O14	872	СН3	СН3	СН=СН
В_1	B_1a	- 65195-55-33	C48H72О14	872	Н	С2Н5	СН=СН
	В_1b	- 65195-57-2	С47Н70O14	890	Н	СН3	СН=СН
А_2	A_2a	- 65195-52-0	C48H76O15	904	СН3	С2Н5	СН-СНОН
	A_2b	- 65195-54-2	С48Н74O15	890	СН3	СН3	СН-СНОН
В_2	В_2a	- 65195-56-4	С48Н74O15	890	Н	С2Н5	СН-СНОН
	В_2b	- 65195-58-6	C47H72О15	876	Н	CH3	СН-СНОН

Все авермектины хорошо растворяются в низших спиртах: метиловом, этиловом и изопропиловом, бензиловом спирте, ацетоне, хлороформе, этилацетате, изооктане и практически не растворяются в петролейном эфире и воде.

В сухом виде авермектины являются мало устойчивыми соединениями.

Токсикологическая характеристика: все авермектины обладают нервно-паралитическим действием. По параметрам острой токсичности при введении в желудок аверсектин С и аверсектин относятся к соединениям 2-го класса опасности. По острой кожной токсичности аверсектины относятся к соединениям со слабо выраженной кожно-резорбтивной токсичностью.

Аверсектины С и не обладают мутагенным, тератогенным и алергенным действием.

4. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью не превышающей 20% при доверительной вероятности 0,95.

5. Метод измерений

Измерения массовой концентрации авермектинов основаны на использовании ВЭЖХ с применением флуоресцентного детектора на колонке с обращенной фазой после экстракции их органическими растворителями из молока и плазмы с последующей очисткой экстрактов и получения флуоресцирующих производных. Флуоресцирующие производные авермектинов получают путем обработки их уксусным ангидридом в присутствии N-метилимидазола на кипящей бане в течение часа. Указанные условия обеспечивают образование флуоресцирующих производных всех авермектинов, при этом в процессе реакции авермектины группы и дают производные, имеющие одинаковое строение, а так же как и авермектины группы и . Хроматографическое разделение производных ведут на колонке с обращенной фазой, детекцию производных осуществляют по интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно.

При хроматографировании производные авермектинов элюируют из колонки двумя пиками: 1-й по времени удерживания пик соответствует сумме производных и (), второй - сумме производных группы и ().

Примечание: в подобранных условиях хроматографирования производные минорных авермектинов имеют то же время удерживания, что и производные основных компонентов.

Таким образом, общее содержание авермектинового комплекса определяется суммой двух указанных пиков.

Минимальная определяемая концентрация производного, наносимая на колонку составляет 0,35 нг.

6. Средства измерения, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы

6.1. Средства измерения

Аналитический хроматограф, Waters

или аналогичный с флуоресцентным детектором,

инжектором с объемом дозирующей петли -

0,050 мл, с компьютерной системой обработки

хроматографических данных (или с интегратором)

Весы аналитические 2-го класса точности                  ГОСТ 24104-88

Весы микроаналитические, точность взвешивания

до 4-го десятичного знака, Chan (США)

или аналогичные

Автоматические пипетки                                   ТУ 64-1-3329-81

Колбы мерные, вместимостью 100 мл                        ГОСТ 1770-74

Цилиндры градуированные, вместимостью 100 мл             ГОСТ 1770-74

Шприц Гамильтона (Швейцария)

6.2. Вспомогательные устройства

Центрифуга

Ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М

или аналогичный

Миксер или гомогенизатор

Холодильник

Колонка аналитическая Диасорб-130-С16Т

250 х 4, с размером частиц 6 мкм (фирма

БиоХимМак, Россия) или аналогичная

Гомогенизатор (Super-Mixer)

Патроны Диапак С1 (фирма БиоХимМак, Россия)

Аппарат для упаривания - Vortex, Evaporater и др.

Роторный испаритель с колбами

Сушильный шкаф

Сцинтиляционные флаконы ("Сигма", каталог 2001 - 2002 N....)

Баня водяная

6.3. Реактивы

Спирт этиловый                                          ГОСТ 5964-84

Спирт метиловый                                         ГОСТ 6995-67

Ацетонитрил, хроматографически чистый                   ТУ ИРЕА 22-66

или аналогичный

1-метилимидазол импортный;

Уксусный ангидрид, импортный;

Ацетон, чда                                             ГОСТ 1770-74

Гексан, ч                                               ТУ 6-09-33-75-78

Изооктан импортный

Стандартные образцы:

Аверсектин С:    СОП (НБЦ  "Фармбиомед")    20%-ный раствор;  содержание

                 аверсектина С и содержание авермектинов.

                 Содержание авермектинов: (A_1+B_1)  и (А_2+В_2)  в % по

                 отношению к общему  содержанию  авермектинов (указано в

                 паспорте)

Аверсектин С_1:  СОП (НБЦ  "Фармбиомед")   20%-ный  раствор;  содержание

                 аверсектина C_1 и содержание  авермектинов.  Содержание

                 авермектинов: (A_1 + B_1 и (А_2 + В_2) в % по отношению

                 к общему содержанию авермектинов (указано в паспорте)

7. Требования безопасности

7.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88

7.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76

7.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

8. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы на жидкостном хроматографе.

9. Условия измерений

9.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 5)°С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

9.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

10. Подготовка к выполнению измерений

10.1. Приготовление растворов

10.1.1. Готовят основной раствор стандартного образца Аверсектин С в этиловом спирте, таким образом, чтобы в 100 раствора содержалось 10 мкг аверсектина (раствор N 1). Раствор хранят (в герметичной упаковке) в холодильнике 2 недели.

Так же поступают при использовании стандартного образца Аверсектин .

Примечание: использование того или другого стандартного образца обусловлено видом субстанции, содержащейся в препарате.

10.1.2. Раствор элюента готовят путем смешивания метилового спирта с водой в соотношении 98:2.

10.2. Подготовка прибора

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

10.3. Установление градуировочной характеристики

10.3.1. Приготовление градуировочных растворов

Градуировочную характеристику, включающую взаимосвязь величины хроматографического сигнала и массу анализируемого вещества в хроматографируемом объекте, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием серии градуировочных растворов.

Из основного раствора N 1 готовят следующие разведения: в стеклянные пробирки с 0,5 этилового спирта микрошприцем вносят по 0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,05 и 0,1 основного раствора, тщательно промывая микрошприц.

10.3.2. Получение флуоресцирующих производных (дериватизация)

Приготовленные растворы упаривают досуха в вакуумном сушильном шкафу при температуре 55°С.

В пробирки с сухим остатком вносят при помощи градуированной микропипетки или микрошприца 0,005 1-метилимидазола и 0,01 уксусного ангидрида. Пробирки плотно закрывают, тщательно перемешивают, обрабатывают ультразвуком в течение 30 с.

Необходимо следить, чтобы в образцы перед проведением дериватизации не попала влага.

Пробирки с образцами помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 ч. По истечении этого времени образцы извлекают из водяной бани, охлаждают и доводят объем каждого образца до 0,5 , добавляя 0,485 ацетонитрила.

10.3.3. Проведение твердофазной экстракции

Патрон Диапак С1 промывают смесью, содержащей 5,0 ацетонитрила и 0,2 ледяной уксусной кислоты, после чего на патрон наносят дериватизированную пробу. Пробирку, содержащую пробу, промывают 5,0 ацетонитрила, промывку также наносят на патрон, далее патрон промывают 5,0 ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор упаривают в вакууме при 30 - 40°С. Остаток растворяют в 0,1 ацетонитрила. Подготовленную пробу используют для хроматографического анализа.

10.3.4. Проведение анализа ВЭЖХ и построение калибровочного графика

На колонку наносят по 0,05 подготовленных дериватизированных и очищенных стандартных образцов, содержащих 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 5 аверсектина.

Условия хроматографирования

Подвижная фаза - метиловый спирт-вода 98:2.

Скорость потока - 0,8 . Давление - 120 - 160 атм.

Чувствительность детектора Range = 0,02.

Детектирование ведут по интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии соответственно 365 и 470 нм.

На хроматограмме отмечают два пика: 1-й пик, с временем удерживания 8 - 10 мин соответствует сумме авермектинов и ; 2-й пик, с временем удерживания 10 - 13 мин, соответствует сумме авермектинов и .

По результатам анализа образцов строят два калибровочных графика для производных и - на оси абсцисс откладывают количества авермектинов, нанесенных на колонку, а на оси ординат - площадь пиков, соответствующих авермектинам и .

Примечание: содержание авермектинов и для каждого градуировочного раствора рассчитывают исходя из их процентного содержания в каждом стандартном образце.

10.4. Подготовка проб к определению

10.4.1. Отбор проб

Пробы молока до начала анализа хранят в замороженном виде при минус 18 - 20°С.

Кровь отбирают в пробирки с гепарином, центрифугируют. Плазму переносят в чистые пробирки, до начала анализа замораживают и хранят в холодильнике при минус 18 - 20°С.

Допускается хранение проб молока и плазмы в течение 2 месяцев.

10.4.2. Экстракция и очистка образцов

Плазма

1,0 плазмы крови помещают в гомогенизатор, туда же добавляют 3 смеси этиловый спирт-вода в соотношении 1:1. Обработку ведут при 4 500 об./мин в течение 10 мин. Из полученной эмульсии аверсектин экстрагируют этилацетатом 3 раза порциями по 8 мл. Экстракцию ведут в центрифужных пробирках при встряхивании с последующим центрифугированием. Этилацетатные экстракты (верхний слой) отбирают пипеткой и переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 мл. Этилацетат отгоняют в вакууме на роторном испарителе при температуре не выше 50°С. Остаток растворяют в 4 ацетонитрила (растворение ведут на ультразвуковой бане). Раствор переносят в широкую пробирку с притертой пробкой. Колбу, в которой производилась отгонка этилацетата, обмывают 2 ацетонитрила и промывную фракцию также переносят в пробирку. Ацетонитрильный раствор 3 - 5 раз промывают 3 - 4 гексана. Гексановые экстракты (верхний слой) отбирают пипеткой и отбрасывают, а ацетонитрильный раствор упаривают досуха. Сухой остаток используют для получения флуоресцирующих производных.

Молоко

1,0 молока помещают в гомогенизатор, туда же добавляют 5 смеси ацетон-вода в соотношении 1:1 и обрабатывают в течение 5 мин при 4500 об./мин. Из полученной эмульсии аверсектин экстрагируют изооктаном. Экстракцию проводят дважды, беря на каждую экстракцию по 5 изооктана. Экстракцию ведут при встряхивании и последующем центрифугировании. Экстракты объединяют и упаривают на роторном испарителе досуха. Остаток растворяют в 8 ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды экстрагируют 5 - 10 гексана. Гексановые экстракты отбрасывают. Ацетонитрильный раствор переносят в пробирку и упаривают в вакууме досуха. Сухой остаток используют для проведения дериватизации.

10.4.3. Проведение дериватизации и очистка образцов

Дериватизацию исследуемых проб и их очистку проводят так, как это описано для стандартных образцов (раздел 10.3.2 и 10.3.3).

Дериватизацию авермектинов исследуемого образца проводят одновременно с дериватизацией рабочих стандартов. Допускается хранение дериватизированных проб в холодильнике в течение 2 недель.

11. Выполнение измерений

Анализ включает не более 6 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы.

Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 0,05 .

Условия проведения процесса хроматографирования описаны в разделе 10.3.4 для стандартного образца.

12. Обработка результатов

Для обработки результатов хроматографирования используется программа "Мультихром". На хроматограммах исследуемых образцов определяют площадь пиков производных по времени удерживания соответствующих пикам стандарта аверсектина.

По калибровочным графикам находят содержание авермектинов и в объеме инжектированной пробы испытуемого образца.

Содержание аверсектина в исследуемом образце рассчитывают по формуле:

, где

- концентрация аверсектина в образце, нг/;

- содержание авермектинов в объеме инжектированной пробы образца, определяют по графику, нг;

- содержание авермектинов в объеме инжектированной пробы образца, определяют по графику, нг;

- объем пробы, нанесенной на колонку, (0,05 ),

- объем пробы, подготовленной для ВЭЖХ, (0,1 );

- объем пробы молока или плазмы, взятой для экстракции, ;

К - коэффициент, учитывающий степень извлечения аверсектина для данного объекта (получен при постановке модельных опытов с внесением известных количеств аверсектина).

Для молока К = 0,90.

Для плазмы К = 0,7.

13. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

    Протокол   N  количественного  химического  анализа

    1. Дата проведения анализа       __________________

    2. Место отбора пробы            __________________

    3. Название лаборатории          __________________

    4. Юридический адрес организации __________________

    Результаты химического анализа   __________________

Шифр или N пробы	Определяемый компонент	Концентрация, мг/м3	Погрешность измерения, %

Ответственный исполнитель:

Научный руководитель:

14. Контроль погрешности измерений

Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в прилож. 1, 2, 3 в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе С, которую определяют как среднеарифметическое результатов параллельных определений.

15. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения анализов 3 образцов требуется 6 ч.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач

Г.Г. Онищенко