Приложение 2. Методические указания по применению унифицированных клинико-диагностических и бактериологических исследований в диагностике гонореи и трихомониаза

Приложение 2

к приказу Министерства здравоохранения СССР

от 12 июля 1985 г. N 936

Методические указания
по применению унифицированных клинико-диагностических и бактериологических исследований в диагностике гонореи и трихомониаза

Введение

Общие указания к унифицированным методам

В методических указаниях величины выражены в единицах Международной системы единиц (1, 2, 3).

При проведении исследований по унифицированным методам рекомендуется руководствоваться следующими указаниями:

- взвешивание на аналитических весах производят с точностью до 0,0002 г, на технических весах - с точностью до 0,01 г;

- для измерения объемов жидкости и приготовления растворов используют мерную посуду, соответствующую ГОСТам: ГОСТ 1770-74 - "Цилиндры, мензурки, колбы мерные" и ГОСТ 20292-74 - "Бюретки, пипетки" ;

- под "холодной", "прохладной" температурой подразумевают температуру 12°-15°С; под "теплой" - 40°-50°С; под "горячей" - 80°-90°С; под "комнатной" - 18°-20°С; под температурой "кипящей водяной бани" подразумевают температуру 98°-100°С (4);

- если для растворов не указан растворитель, то подразумевают водные растворы;

- под названием "вода", если нет особых указаний, следует понимать дистиллированную воду (4);

- для приготовления раствора реактивов используют дистиллированную воду, соответствующую ГОСТ 6709-72;

- используют химические реактивы, срок хранения которых не истек, а условия хранения и упаковка соответствуют ГОСТ на данный реактив, или указаны на этикетке.

Растворы реактивов для унифицированных методов готовятся в объеме, приемлемом для данной лаборатории, в зависимости от стабильности растворов реактивов и числа проводимых исследований; для большинства реактивов указаны допустимые квалификации. В тех случаях, когда квалификация реактивов не указана, можно пользоваться реактивами квалификации ч, чда или хч.

Для реактивов, которые не производятся отечественной промышленностью, квалификация не указана.

Правила приготовления растворов кислот и щелочей приведены в руководствах по технике лабораторных работ (5, 6).

Описание предварительных операций - очистка, мытье и сушка лабораторной посуды приведены в соответствующих руководствах (5, 7).

В связи с переходом на Международную систему единиц, концентрация растворов реактивов в унифицированных методах выражена в молярной (моль/л) или в массовой (г/л раствора) концентрации.

Литература

1. "Методические указания. Внедрение и применение" СТ СЭВ 1052-78 "Метрология. Единицы физических величин". РД 50-160-79. М., Изд-во Стандартов, 1979.

2. Методические рекомендации по применению в клинической лабораторной диагностике наименований и обозначений единиц физических величин. М., 1977.

3. Единицы СИ в медицине. Подготовлено по предложению Тридцатой Всемирной ассамблеи здравоохранения. Женева, ВОЗ, 1979.

4. Государственная Фармакопея Союза Советских Социалистических Республик. Десятое издание. М., "Медицина", 1968.

5. Воскресенский П.И. Техника лабораторных работ. М., "Химия", 1966.

6. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические реактивы. М., Госхимиздат, 1955.

7. Кац A.M., Канторович А.С. Мерные и дозирующие устройства для клинико-диагностических лабораторий. Л., "Медицина", 1970.

1. Клинико-диагностические исследования

1.1. Обнаружение гонококков и влагалищных трихомонад в исследуемом материале, окрашенном метиленовым синим

Принцип метода основан на обнаружении возбудителей в препаратах, окрашенных метиленовым синим.

Реактивы: 1) 1% водный раствор метиленового синего: 1 г метиленового синего растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр. 2) 96° этиловый спирт.

Специальное оборудование: микроскоп с осветителем, песочные часы, штативы.

Приготовление препаратов. Материал наносят на чистые обезжиренные предметные стекла тонким равномерным слоем, высушивают на воздухе.

Ход окраски. Препарат фиксируют 3 минуты в 96° этиловом спирте, высушивают, затем наносят на него 1% раствор метиленового синего на 1 минуту, тщательно смывают оставшийся краситель под струей холодной воды, высушивают в штативе.

Микроскопия. Исследование проводят под микроскопом с естественным или искусственным освещением: объектив 90 иммерсионный, окуляр 7 или 10. Иммерсионное масло: кедровое. Препарат синего цвета. Ядра клеток окрашены в синий цвет, протоплазма - в голубой цвет разной интенсивности (до бесцветной). Слизь голубого цвета. Бактериальная флора прокрашивается в синий цвет разной интенсивности. Гонококки темно-синего цвета, резко очерчены, бобовидной формы, парные; располагаются внутриклеточно, в слизи и на эпителиальных клетках. Влагалищные трихомонады различной формы (округлой, овальной, полигональной), расположены в слизи, между клеточными элементами: четко просматривается оболочка; ядро расположено эксцентрично, интенсивно окрашено в синий цвет; протоплазма нежная, сетчатая, светло-синяя; вакуоли бесцветны.

Литература

1. Н.М. Овчинников. Гонококк и лабораторная диагностика гонореи. М., Медгиз, 1952.

2. Методическое письмо по бактериоскопической диагностике гонореи, утверждено Министерством здравоохранения СССР 24/XII-70 г. N 10-83/14-83.

3. М.В. Яцуха, В.Г. Шрайберг. Значение бактериоскопического метода исследования при современном течении гонорейной инфекции. Лабораторное дело, 1974, N 5, с. 286-288.

1.2. Обнаружение гонококков и влагалищных трихомонад в исследуемом материале, окрашенном эозином и метиленовым синим*(1)

Принцип метода основан на обнаружении возбудителя в препаратах, окрашенных эозином и метиленовым синим.

Реактивы: 1) 1% раствор эозина в этиловом спирте: 1 г водорастворимого эозина растворяют в 37 мл дистиллированной воды и доливают в раствор 63 мл 96° этилового спирта или 1 г спирторастворимого эозина растворяют в 63 мл 96° этилового спирта и добавляют в раствор 37 мл дистиллированной воды. Растворы фильтруют через бумажный фильтр. 2) 1% водный раствор метиленового синего. Готовят как ранее описано (см. 1.1.).

Специальное оборудование, приготовление препаратов. (см. 1.1.).

Ход окраски. Без предварительной фиксации препараты погружают в 1% раствор эозина на 15-20 секунд, смывают текущей водопроводной водой и заливают 1% раствором метиленового синего на 1-2 минуты, затем тщательно смывают оставшийся краситель под струей холодной водопроводной воды и высушивают в штативе.

Микроскопия: окраска производится для выявления, наряду с гонококками и трихомонадами, эозинофилов. Препарат синего цвета. Ядра клеток окрашены в синий, протоплазма - в голубой цвет разной интенсивности. В протоплазме при наличии эозинофилов имеется зернистость красного или ярко-розового цвета. Слизь голубого цвета. Бактериальная флора окрашена в синий цвет разной интенсивности. Гонококки темно-синего цвета, резко очерчены, бобовидной формы, парные; располагаются внутриклеточно, в слизи и на эпителиальных клетках. Влагалищные трихомонады: ядро синего цвета, расположено эксцентрично, овальное; протоплазма сетчатая светло-синяя; вакуоли бесцветны; четко просматривается оболочка.

Литература (см. 1.1.)

1.3. Обнаружение гонококков и влагалищных трихомонад в исследуемом материале, окрашенном бриллиантовым зеленым*(2)

Принцип метода основан на обнаружении возбудителей в препаратах, окрашенных бриллиантовым зеленым.

Реактивы: 1) 0,5% водной раствор бриллиантового зеленого: 0,5 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр. 2) 96° этиловый спирт.

Специальное оборудование, приготовление препаратов. (см. 1.1.)

Ход окраски. Препарат фиксируют 3 минуты в 96° этиловом спирте, высушивают, затем наносят 0,5% водный раствор бриллиантового зеленого на 1 минуту и тщательно смывают краситель под струей холодной водопроводной воды, высушивают в штативе.

Микроскопия: препарат зеленого цвета: ядра клеток окрашены в зеленый цвет, протоплазма - в светло-зеленый. Слизь зеленого цвета. Бактериальная флора окрашивается в зеленый цвет разной интенсивности. Гонококки темно-зеленого цвета, резко очерчены, бобовидной формы, парные, располагаются внутриклеточно, в слизи и на эпителиальных клетках. Влагалищные трихомонады различают разной формы (округлой, овальной, полигональной), они расположены между клеточными элементами или в слизи: четко просматривается оболочка; ядро интенсивно окрашено в зеленый цвет, расположено эксцентрично; протоплазма сетчатая, светло-зеленого цвета; вакуоли бесцветны.

Литература

1. В.Н. Беднова, Т.Н. Данилова, Т.Е. Вахнина, Г.С. Капцева. Новый краситель для бактериоскопической диагностики гонореи и трихомониаза. Вестник дерматологии и венерологии, 1983, N 2, с. 32-33.

1.4. Обнаружение гонококков и влагалищных трихомонад в исследуемом материале, окрашенном по модифицированному способу Грама

Принцип. Метод основан на свойстве гонококков, влагалищных трихомонад и других грамотрицательных микроорганизмов при обесцвечивании их определенное время в этиловом спирте, отдавать основной фиолетовый краситель и докрашиваться, в дальнейшем, дополнительным оранжево-красным.

Реактивы. 1) 1% водный раствор кристаллвиолета: 1 г кристаллвиолета растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, раствор фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр. 2) Водный люголевский раствор: 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл дистиллированной воды, в полученном растворе растворяют 1 г чистого йода, фильтруют через бумажный фильтр. 3) 96° этиловый спирт. 4) 1% водный раствор нейтрального красного: 1 г нейтрального красного растворяют в 100 мл дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр.

Специальное оборудование, приготовление препаратов. (см. 1.1.).

Ход окраски. Препарат покрывают полоской фильтровальной бумаги и заливают ее 1% водным раствором кристаллвиолета на 1 минуту. Следят, чтобы между фильтровальной бумагой и стеклом не было пузырьков воздуха, их удаляют, придавливая полоску смоченной кристаллвиолетом фильтровальной бумаги стеклянной пипеткой или палочкой. Через 1 минуту бумагу снимают, препарат промывают водопроводной водой и заливают раствором Люголя, который выдерживают в течение нескольких секунд до почернения мазка. Затем остаток люголевского раствора смывают и приступают к обесцвечиванию препарата в 96° этиловом спирте. Обесцвечивание проводят под контролем глаза, поочередно погружая и вынимая препарат из спирта, находящегося в стаканчике. Обесцвечивают препарат до тех пор, пока с его тонких участков перестанут стекать фиолетовые струйки красителя и они станут бледно-серого цвета. Препарат быстро промывают под струей водопроводной воды, а затем докрашивают в течение 3 минут 1% водным раствором нейтрального красного. Препарат тщательно промывают, пока струя воды, стекающая с него, станет прозрачной, и высушивают.

Микроскопия. При правильной окраске препарат оранжево-красного цвета на тонких участках, лилово-фиолетового на толстых. Ядра клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток) должны частично удерживать основную фиолетовую окраску, т.е. в центре они должны быть окрашены в фиолетовый цвет, по периферии в оранжево-красный, а гонококки, расположенные в лейкоцитах и на эпителиальных клетках, будут оранжево-красные. Высокое качество окраски обеспечивается своевременным прекращением обесцвечивания препарата: при недообесцвечивании - когда в фиолетовый цвет интенсивно окрашены ядра клеток, гонококки могут сохранять фиолетовую окраску, в переобесцвеченных препаратах стафилококки и стрептококки могут быть окрашены в оранжево-красный цвет и приняты за гонококки.

Идентификация гонококка производится на основании его свойств: морфологии, расположения и отношения к окраске по способу Грама. Гонококк это парный кокк, имеющий форму кофейного зерна; кокки обращены друг к другу своей вогнутой стороной. Размножаясь делением в разных плоскостях, гонококки не образуют цепочки. Внутри лейкоцитов они располагаются парами или группами так, что одни диплококки лежат по отношению к другим под различными углами. Внеклеточное расположение гонококков также имеет свои характерные особенности. Часто гонококки лежат на клетках плоского эпителия в большом количестве рядами с расположением диплококков перпендикулярно друг к другу внутри ряда. Частота внутри - и внеклеточного расположения гонококков зависит как от периода заболевания, так и от методики взятия материала. При идентификации гонококка необходимо учитывать все три его основных признака. Положительный ответ нужно давать при обнаружении только типичных форм гонококков. Влагалищные трихомонады окрашиваются бледно: оболочка в виде тоненькой полоски окружает сетчатую протоплазму оранжево-красного цвета, ядро сиреневого или фиолетового цвета, жгутики и ундулирующая мембрана не просматриваются.

Литература (см. 1.1.)

1.5. Обнаружение влагалищных трихомонад в исследуемом материале при изучении нативного препарата

Принцип. Возбудителя обнаруживают по его движению среди клеточных элементов и микроорганизмов в препарате, приготовленном ex tempore.

Реактивы: изотонический раствор хлорида натрия: 0,9 г хлорида натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Специальное оборудование: микроскоп с осветителем, предметные и покровные стекла.

Приготовление препаратов: На предметное стекло наносят каплю теплого изотонического раствора хлорида натрия и смешивают в нем исследуемое отделяемое из очага заболевания. Взвесь накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Микроскопия. Исследования проводят под микроскопом с естественным или искусственным освещением немедленно после приготовления препарата: объектив 40, окуляр 7 или 10. Влагалищная трихомонада определяется по грушевидной, округлой или овальной форме тела величиной немного больше лейкоцита, характерным толчкообразным движением ундулирующей мембраны и жгутиков, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным или фазово-контрастным конденсором.

Примечание: При исследовании нативных препаратов влагалищные трихомонады иногда смешивают со жгутиковыми семейства бодонидов, которые могут быть занесены в препарат из воды, загрязненной посуды и т.д. В отличие от трихомонад бодониды имеют лишь 2 жгутика и очень быстро двигаются по прямой. К ошибкам может привести и наличие в препарате подвижных бактерий, которые прикрепляясь к лейкоцитам, создают впечатление большого количества подвижных трихомонад. Ввиду того, что при длительном пребывании препаратов при комнатной температуре трихомонады довольно быстро теряют подвижность, исследование следует проводить возможно быстрее после получения материала.

Литература

1. М.В. Яцуха, Ю.О. Нафтольева, М.О. Танрыбердыева, Г.М. Засыпкина. Культуральная диагностика трихомоноза у женщин и их половых контактов. Вестник дерматологии и венерологии, 1978, N 9, с. 12-14.

2. И.И. Ильин. Негонококковые уретриты у мужчин. М., 1983, с. 167-168.

2. Культуральные исследования

2.1. Выделение и идентификация гонококков в культурах

Принцип. Обнаружение возбудителя производят в культуре, масса которой увеличивается при росте на искусственных питательных средах.

Питательная среда. Необходимо использовать питательную среду для выделения гонококка, сухую, выпускаемую Харьковским предприятием по производству бактерийных препаратов Минздрава СССР.*(3)

Способ приготовления рабочей среды: перед применением во флакон N 1 с основой питательной среды добавляют 100 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживают для набухания агара 1 час, затем флакон переносят в водяную баню и выдерживают при 100°С до растворения среды (обычно около 30 минут), возможен небольшой осадок или опалесценция среды. Во флакон N 2 с обогащающими добавками добавляют 20 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживают 20 минут при комнатной температуре до растворения содержимого флакона, которое затем добавляют к охлажденной до 50° основе питательной среды во флакон N 1 и тщательно перемешивают. Полученную таким образом обогащенную среду разливают по 3-3,5 мл в стерильные пробирки и скашивают, в пробирки со скошенной средой добавляют по 0,5 мл стерильного мясопептонного бульона или изотонического раствора хлористого натрия для увлажнения среды. Проверяют на стерильность при 37° в течение 24 часов.

Оборудование: водяная баня, автоклав, термостат, холодильник, эксикатор, рН-метр, чашки Петри, пробирки, колбы, пипетки, воронки, градуированные и пастеровские бутыли, газовая горелка или спиртовка, скальпели, мясорубка, кастрюли, бактериологические петли.

Реактивы, ход окраски мазков, микроскопия. (см. 1.4.)

Приготовление препаратов. Выросшую в пробирке культуру снимают бактериологической петлей, наносят в каплю водопроводной воды на предметном стекле, эмульгируют и высушивают при комнатной температуре.

Примечание. Выращивание гонококков можно производить в пробирках или чашках Петри, первый способ обеспечивает значительную экономию среды. Для повышения процента высеваемости гонококков засеянные питательные среды помещают в термостат (36-37°) в эксикаторе с 20% содержанием углекислого газа. Колонии гонококков чаще вырастают в течение 1-2 суток, но возможен рост и в последующие 7-8 суток, поэтому обязательным является ежедневное исследование культур. Выросшую культуру исследуют микроскопически: изучают колоний#, проводят исследование на цитохромную оксидазу, готовя из колоний гонококка и другой флоры мазок для микроскопического исследования. Колонии гонококка прозрачные или слегка мутные, цветные или белесоватые, имеют круглые очертания, ровные края, блестящую поверхность. При снятии колоний с поверхности среды петлей и получении суспензии гонококков в изотоническом pacтворе или водопроводной воде на предметном стекле определяется их слизистая консистенция.

Идентификацию гонококков в культурах проводят при исследовании выросших культур в мазках, окрашенных по модифицированному способу Грама.

При бактериологической диагностике гонореи большое значение имеет правильная окраска мазков из культур и квалифицированное исследование. Критерием правильной окраски мазков является наличие недообесцвеченных участков в толстых местах мазка. При этом, при правильной окраске в центре скоплений из оранжево-красных микроорганизмов наблюдаются группы кокков или отдельные участки мазков, окрашенные в фиолетовый цвет.

При исследовании мазков из культур необходимо учитывать морфологию, расположение и окраску гонококков. Они представляют собой, главным образом, не парные, а отдельные кокки, собранные в скопления с более плотным центром и как бы рассыпанные беспорядочно по периферии. Наряду с интенсивно окрашенными в оранжево-красный цвет кокками встречаются бледно окрашенные формы, а также особи неправильно округлых очертаний. Полиморфность гонококков увеличивается по мере старения культуры. Гонококки не образуют в культуре цепочек и гроздей, что свойственно стрептококкам и стафилококкам. Следует отметить, что нередко встречаются штаммы стрептококков, легко теряющие свою первоначальную фиолетовую окраску при обесцвечивании спиртом, и в процессе окраски приобретающие грамотрицательность. Без учета морфологии и расположения кокков в данном случае легко может быть допущена лабораторная ошибка - стрептококки могут быть приняты за гонококки.

Литература

1. Н.М. Овчинников. Гонококк и лабораторная диагностика гонореи. М., Медгиз, 1952.

2. Методическое письмо по культуральной диагностике гонореи, утверждено Министерством здравоохранения СССР 28.03.69 г., N 10-83/14-34.

3. Методические рекомендации по приготовлению безасцитных питательных сред для культуральной диагностики гонореи, утверждены Министерством здравоохранения СССР 15.06.73 г., N 10-83/9-95.

4. В.Н. Беднова, М.В. Яцуха. Лиофильно высушенная безасцитная питательная среда в культуральной диагностике гонореи. Вестник дерматологии и венерологии, 1978, N 2, с. 25-28.

5. В.Н. Беднова, М.В. Яцуха. Приготовление и применение безасцитных питательных сред для диагностики гонореи. Лабораторное дело, 1975, N 1, с. 35-37.

6. В.Н. Беднова, М.В. Яцуха, Т.Н. Данилова, Г.С. Капцева, Г.М. Засыпкина, С.Л. Файнштейн и др. Результаты научно-практической апробации сухих питательных сред для выращивания гонококков. Вестник дерматологии и венерологии, 1981, N 3, с. 38-41.

7. В.Н. Беднова, Т.Н. Данилова, Т.Г. Коликова, А.С. Петрунин. Диагностическая ценность безасцитных питательных сред с антибиотиками для культуральной диагностики гонореи. В кн.: Клиника, патогенез, лечение и профилактика кожных и венерических болезней. Горький, 1979, ч. 11, с. 71-73.

2.2. Выявление в культурах колоний гонококков, продуцирующих цитохромную оксидазу

Принцип. Гонококк в процессе роста вырабатывает фермент цитохромную оксидазу, который выявляется воздействием реактива, изменяющего свой цвет в присутствии указанного фермента.

Реактив. 1% водный раствор диметилпарафенилендиамина*(4): 1 г указанного вещества растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр.

Ход исследования. После того как выросшие в пробирках на питательной среде культуры изучены макроскопически и подозрительные на гонококки колонии (при необходимости) пересеяны на свежую питательную среду для выделения чистой культуры, из оставшихся колоний микроорганизмов необходимо сделать мазки в капле водопроводной воды для дальнейшего исследования в окраске по модифицированному способу Грама. На скошенную поверхность питательной среды с ростом бактерий наслаивают раствор оксидазного реактива пастеровской пипеткой, чтобы он, стекая по поверхности среды, смачивал все выросшие на ней колонии микроорганизмов. Пробирки оставляют при комнатной температуре и просматривают. Оксидазную реакцию считают положительной при окрашивании хотя бы одной колонии микроорганизмов и отрицательной, если через 10-15 минут смоченные раствором оксидазного реактива колонии не окрашивались. Оксидазоположительные колонии снимают петлей, делают из них мазки, которые окрашивают по модифицированному способу Грама и исследуют под микроскопом. Для выделения чистой культуры гонококка лучше производить пересев колоний, не окрашенных оксидазным реактивом, если же дифференцировать их без оксидазной реакции не представляется возможным, то пересевать окрашенную колонию необходимо в первые секунды после начала окрашивания, так как реактив, оказывая токсическое действия на гонококки, снижает их жизнеспособность. Пересев по прошествии нескольких минут после воздействия оксидазного реактива уже не дает роста гонококков.

Учет результатов исследования. Гонококковые колонии уже через несколько секунд после наслоения раствора реактива окрашиваются вначале в розовый, затем в красный, а через несколько минут в черный цвет. Они окрашиваются даже в тех случаях, когда гонококки находятся под колониями других микроорганизмов. Оксидазоотрицательные микроорганизмы не окрашиваются, сохраняя цвет своего пигмента или оставаясь прозрачными. Гонококковые колонии всегда оксидазоположительные, но оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, которые в процессе своей жизнедеятельности выделяют цитохромную оксидазу; поэтому оксидазоположительные колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать в окраске по модифицированному способу Грама.

Литература

1. М.В. Яцуха. О диагностической ценности оксидазной реакции в культуральной диагностике гонореи. Вестник дерматологии и венерологии, 1975, N 12, с. 34-36.

2.3. Идентификация гонококков в чистых культурах методом ферментации сахаров

Принцип. Гонококки способны расщеплять до кислоты находящуюся в питательной среде глюкозу и не расщеплять мальтозу, фруктозу, сахарозу и лактозу. Образовавшаяся в результате расщепления сахара кислота, благодаря наличию в среде индикатора, изменяет цвет среды.

Специальное оборудование. (см. 2.1.) Необходим также столик, обеспечивающий горизонтальный уровень.

Реагенты. 1) мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН = 7,4-7,5); 2) желток свежего куриного яйца; 3) сахара: глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза, лактоза; 4) индикатор феноловый красный водорастворимый; 5) 20% раствор едкого натрия; 6) стерильный изотонический раствор хлорида натрия; 7) стерильная дистиллированная вода; 8) этиловый спирт 96°; 9) чистая односуточная культура гонококка.

Приготовление питательной среды. Для приготовления среды необходима предшествующая подготовительная работа, состоящая из следующих этапов.

1) Приготовление раствора индикатора фенолового красного: 0,2 г порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, доводят рН до 7,8 раствором 20% едкого натрия, стерилизуют автоклавированием при 120° 20 минут.

2) Приготовление растворов сахаров: по 1,5 г сахара (глюкозы, мальтозы, лактозы, фруктозы, сахарозы) помещают в бактериологические пробирки, закрывающиеся ватно-марлевыми пробками, наливают в каждую пробирку по 2 мл стерильной дистиллированной воды, растворяют соответствующий сахар и стерилизуют кипячением в водяной бане в течение 15 минут.

3) Приготовление желточной эмульсии: скорлупу свежего куриного яйца дважды обрабатывают 96° этиловым спиртом, вскрывают скорлупу, отделяют стерильно желток от белка и помещают желток в стерильную колбу. Добавляют стерильный изотонический раствор из расчета 5 мл на 1 желток и тщательно эмульгируют с помощью пипетки.

В каждую из пяти колб емкостью 200 мл вносят 15 мл желточной эмульсии, 6 мл раствора индикатора фенолового красного и приготовленный раствор соответствующего сахара. Перемешивают и добавляют 100 мл мясопептонного агара из кроличьего мяса, предварительно расплавленного и охлажденного до 56°. Перемешивают и разливают в чашки Петри по 20 мл. Застывшую среду, после проверки ее на стерильность в термостате в течение 24 часов при 36-37° можно использовать для опыта, а оставшуюся неиспользованной хранить до 4 недель в холодильнике при 4°.

Ход определения. Чистую культуру грамотрицательных кокков засевают на поверхность предварительно прогретой в термостате среды ферментации в виде двух взаимноперпендикулярных штрихов длиной 1 см (в каждой чашке возможен посев 5-6 штаммов гонококка). Затем чашки помещают в термостат в эксикаторе с влажной ватой на дне без создания в нем атмосферы повышенного содержания .

Оценку результатов производят через сутки. Изменение красного цвета среды в зоне роста исследуемой культуры на желтый оценивают как положительный результат. Если цвет среды остается красным или становится малиновым, то это регистрируется как отрицательный результат.

Второй вариант. С целью экономии питательной среды, в тех случаях, когда необходимо определить ферментативные свойства 1-2 штаммов микроорганизмов, применяют одночашечный модифицированный способ определения сахаролитических свойств грамотрицательных микроорганизмов.

Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:

1) приготовление 0,2% раствора индикатора;

2) приготовление растворов сахаров в растворе индикатора: 7,5 г каждого из пяти сахаров помещают в стерильные колбочки или бактериологические пробирки, наливают в каждую по 10 мл 0,2% стерильного раствора фенолового красного, приготовленного как указано ранее, и стерилизуют кипячением в водяной бане 15 минут. Неиспользованные растворы можно хранить в холодильнике при 4° в течение одного месяца;

3) Приготовление желточной эмульсии производится как указано ранее (см. 2.3.);

4) Приготовление среды ферментации: к 100 мл мясопептонного агара из кроличьего мяса, предварительно расплавленного и охлажденного до 56°, добавляют 15 мл желточной эмульсии, разливают по 20 мл в чашки Петри, которые тотчас же должны быть установлены на строго горизонтальной поверхности. Застывшую среду, после проверки ее на стерильность в термостате в течение 24 часов, можно использовать в опыте, а неиспользованную хранить в холодильнике при 4° в течение одного месяца.

Ход определения: перед посевом исследуемой чистой культуры грамотрицательных кокков чашку со средой прогревают в термостате, после чего дно чашки делят с внешней стороны на пять секторов и устанавливают на горизонтальной плоскости. На поверхность среды каждого сектора стерильной пастеровской пипеткой наносят по 1 капле раствора каждого из 5-ти вышеуказанных сахаров, приготовленных в растворе индикатора, как указано выше. После того, как произойдет полное всасывание нанесенных растворов в среду, производят посев в виде 2-х взаимноперпендикулярных штрихов длиной 1 см исследуемой культуры в зоне нанесения растворов углеводов в растворе индикатора. Эта модификация обеспечивает определение сахаролитических свойств одного штамма при использовании одной чашки со средой вместо пяти. Инкубация посевов и учет результатов осуществляется как указано выше.

Литература

1. Т.Г. Коликова, В.Н. Беднова, Т.Н. Данилова, М.В. Яцуха. Желточная среда для определения ферментативных свойств гонококка. Вестник дерматологии и венерологии, 1978, N 12, с. 59-62.

2. Т.Г. Коликова. Методика приготовления среды с желтком куриного яйца для определения сахаролитических свойств нейссерий. Тезисы докладов X научно-практической конференции врачей дерматовенерологов. Рига, 1980, с. 66-69.

3. Т.Г. Коликова. Модификация методики определения сахаролитических свойств нейссерий. Тезисы докладов на юбилейной научно-практической конференции. Ашхабад, 1982, с. 64-66.

2.4. Определение чувствительности чистой культуры гонококка к антибиотикам

Принцип. Качественное определение чувствительности или устойчивости микроорганизма к антибиотикам методом диффузии их в агар с использованием дисков.

Реагенты: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец, рН = 7,4-7,5; набор дисков, пропитанных антибиотиками.

Специальное оборудование. (см. 2.1.)

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих этапов:

1) выделение чистой культуры гонококка;

2) приготовление чашек Петри с питательной средой.

Чистую культуру возбудителя гонореи суспензируют в изотоническом растворе хлорида натрия. Плотность суспензии должна соответствовать 10 ЕД по оптическому стандарту мутности. 1 мл суспензии наливают на поверхность мясопептонного агара и стеклянным шпателем равномерно распределяют ее по поверхности среды. Избыток жидкости удаляют пипеткой, затем чашки выдерживают 15 минут при комнатной температуре для диффузии жидкости в агар.

Диски с антибиотиками, применяемыми для лечения гонореи, с помощью пинцета накладывают на поверхность засеянной питательной среды на одинаковом расстоянии один от другого и на расстоянии 2 см от края чашки. На одну чашку помещают не более 6 дисков. Чашки в эксикаторе в перевернутом кверху дном положении инкубируют в течение 1-2 суток при температуре 36-37.

Оценку результатов производят с помощью линейки: измеряют диаметры зон сплошной задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самих дисков. Отсутствие зон указывает на отсутствие чувствительности, зоны диаметром до 10 мм - на малую чувствительность, более 10 мм - на чувствительность испытуемых штаммов гонококка к концентрации антибиотика в стандартных дисках. Чем выше чувствительность, тем больше зона ингибиции роста.

Литература

1. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков, утверждены Минздравом СССР 10 марта 1983 года N 2675-83.

2. Н.М. Овчинников, С.С. Лурье, Т.Н. Данилова. Результаты изучения чувствительности гонококков к пенициллину в разных городах СССР. Вестник дерматологии и венерологии, 1974, N 3, с. 39-42.

2.5. Определение бета-лактамазной активности гонококков

Принцип. При использовании чашечного метода по линии роста посева бета-лактамазопродуцирующего микроорганизма происходит искажение зоны задержки роста фонового стафилококка вокруг диска с пенициллином.

Реагенты: 1) питательная среда (см. 2.1.); 2) золотистый стафилококк (штамм 209) чувствительный к пенициллину (для газона); 3) стафилококк, продуцирующий бета-лактамазу (для газона); 4) Чистая культура изучаемого микроорганизма.

Специальное оборудование. (см. 2.1.)

Ход определения: 1) суточную культуру золотистого стафилококка (штамм 209) разводят в изотоническом растворе хлорида натрия по оптическому стандарту мутности до густоты микробных тел. Для этого выросшую культуру на скошенной питательной среде заливают 3 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, смывают культуру стафилококка, 0,5 мл взвеси стафилококка переносят в пустую стерильную пробирку, густоту взвеси изотоническим раствором доводят до 5 ЕД по стандарту мутности, затем полученную взвесь в другой пробирке разводят еще в 10 раз; 2) стафилококк, продуцирующий бета-лактамазу, выращивается на питательной среде и суточная культура его проверяется на чистоту; 3) суточная культура изучаемого микроорганизма также проверяется на чистоту; 4) 6 мл полученной, как указано выше, взвеси золотистого стафилококка (штамм 209) добавляют к 100 мл обогащенной питательной среды и разливают по 20 мл в чашки Петри. После застывания и подсушивания питательной среды в центр чашки помещают стандартный бумажный диск, пропитанный раствором пенициллина. Суточную чистую культуру изучаемых на бета-лактамазу микроорганизмов и контрольного штамма засевают радиальными штрихами, отступая на 1 мм от края диска. После инкубации в течение 24 часов в эксикаторе с 20% содержанием при 36-37° в питательной среде отмечается рост стафилококка за исключением зоны задержки роста вокруг диска, а по засеянным радиусам - сплошной рост испытуемых на бета-лактамазу микроорганизмов.

Оценка результатов. Чувствительные к пенициллину культуры вырастают лишь в той части штриха, которая удалена от диска, тогда как резистентные штаммы развиваются по всему засеянному радиусу, начиная от края диска. Если культуры выделяют бета-лактамазу, то она инактивирует пенициллин, в связи с чем зона задержки роста стафилококка, внесенного в питательную среду, в месте пересечения с ростом изучаемого микроорганизма по штриху искривляется, давая клиновидное втяжение агара с ростом фонового стафилококка по направлению к диску. Величина участков клиновидного втяжения зависит от степени продуцирования микроорганизмами бета-лактамазы. На каждой чашке с питательной средой удается исследовать одновременно до 8 различных культур.

Примечание: Хранить чашки с питательной средой, содержащей стафилококк, можно в течение 10 дней в холодильнике. Перед посевом на них испытуемых микроорганизмов чашки помещают в термостат при температуре 36-37° на 15-20 минут, затем кладут диск, пропитанный раствором пенициллина, засевают изучаемые культуры штрихами по радиусу и помещают на сутки в термостат при той же температуре в эксикаторе для выращивания.

Литература

1. Г.С. Капцева. Диагностика специфического поражения миндалин и глотки у больных гонореей. Автореф. дисс. канд., М., 1981.

2.6. Выделение и идентификация влагалищных трихомонад в культурах

Принцип. Обнаружение влагалищнах# трихомонад в исследуемом материале из мочеполовых органов с помощью увеличения количества возбудителей выращиванием в искусственных питательных средах и идентификации живых культур.

Питательная среда.*(5) 1) Среда СКДС: солевой раствор (хлористый натрий - 6,5 г, хлористый калий - 0,14 г, хлористый кальций - 0,12 г, бикарбонат натрия - 0,2 г, 0,5% раствор метиленового синего - 0,5 мл, дистиллированная вода - 1 л) - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального белкового питания - 10 мл, дрожжевой аутолизат - 10 мл, сыворотка крови лошади или крупного рогатого скота без консерванта - 30 мл, 20% раствор мальтозы - 10 мл, пенициллин и стрептомицин - по 160000 ЕД.

Приведенные в рецептах растворы в указанном объеме сливают в стерильную колбу, смешивают, доводят рН до 6,3, добавляют антибиотики из расчета 1000 ЕД каждого на 1 мл полученной смеси, вновь смешивают, разливают по 5 мл в стерильные пробирки, поверхность среды в которых заливают стерильным вазелиновым маслом (толщина слоя - 5 мм). Хранят до употребления при 4° не более двух недель.

Приготовление препаратов. При выращивании на жидких питательных средах влагалищные трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка, из которого пастеровской пипеткой берут материал для исследования в нативном препарате. Микроскопическое исследование культур и идентификацию следует производить на 3-5, при отрицательных результатах - 7-9, 11-17 день после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от величины посевной дозы. Придонный рост наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Микроскопия. Исследование проводят под микроскопом с естественным или искусственным освещением с объективом 40 или 90, окуляр 7 или 10.

Влагалищные трихомонады в поле зрения могут быть одиночными или большими скоплениями, активно движущиеся, при этом хорошо просматриваются движения жгутиков и ундулирующей мембраны.

Литература

1. Методические рекомендации по приготовлению новых питательных сред для культуральной диагностики трихомоноза, утверждены Министерством здравоохранения СССР 18.04.77 г., N 10-8/23.

2. В.Н. Беднова, М.В. Яцуха, Ю.О. Нафтольева, М.О. Танрыбердыева, Г.М. Засыпкина. Новые питательные среды для диагностики трихомоноза культуральным методом. Вестник дерматологии и венерологии, 1975, N 11, с. 37-40.

3. М.М. Васильев. Диагностика мочеполового трихомоноза с использованием сухой питательной среды из кровезаменителей. Дисс. канд., М., 1980.

4. В.Н. Беднова, Т.Е. Вахнина. Питательная среда для выделения влагалищных трихомонад с использованием жидких кровезаменителей с истекшим сроком годности. Тезисы докладов научно-практической конференции врачей дермато-венерологов. Вильнюс, 1981, с. 48-49.

Работу по унификации клинико-диагностических и бактериологических исследований в диагностике гонореи и трихомониаза и составлению настоящих методических указаний выполнили сотрудники Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института Минздрава СССР: профессор В.Н. Беднова - научный руководитель, канд. мед. наук М.В. Яцуха, канд. мед. наук Т.Н. Данилова, канд. мед. наук Г.С. Капцева, канд. мед. наук М.М. Васильев, научный сотрудник Т.Г. Коликова, научный сотрудник Т.Е. Вахнина.

Работа проводилась под руководством Комиссии по унификации и контролю качества клинических лабораторных методов исследования: председатель - профессор В.В. Меньшиков, зам. председателя - канд. биолог. наук Л.Н. Делекторская; при содействии Консультативного совета по лабораторному делу Минздрава СССР: председатель - проф. В.Т. Морозова.

Начальник Главного управления лечебно-профилактической помощи Минздрава СССР

А.М. Москвичев

______________________________

*(1) Рекомендуется использовать при исследовании материала, взятого у детей.

*(2) Рекомендуется использовать при отсутствии метиленового синего.

*(3) При отсутствии указанной питательной среды для выделения гонококка, сухой разрешается в лаборатории готовить одну из ниже перечисленных питательных сред.

1. Среда КДС-1: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН = 7,4-7,5) - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального белкового питания - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл.

2. Среда ГДС-2: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН = 7,4-7,5) - 100 мл, 5% раствор гемогидролизата - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл.

3. Среда СДС-199: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН = 7,4-7,5) - 100 мл, среда 199 для культур тканей без антибиотиков - 20 мл или 2 мл ее 10 кратного концентрата, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (в указанных средах дрожжевой аутолизат можно заменить 1,5% раствором экстракта кормовых дрожжей).

4. Среда ЖС: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН = 7,4-7,5) - 100 мл, желток свежего куриного яйца - 10 мл, сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл.

5. Асцит-агар: мясопептонный агар из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец (рН = 7,4-7,5) - 100 мл, асцитическая жидкость 25-40 мл.

6. Среды с антибиотиками: к указанным (N 1-5) средам добавляют 20,0 ЕД/мл полимиксина М сульфата и 2 мкг/мл линкомицина гидрохлорида. Для диагностики фарингеальной гонореи к среде с антибиотиками добавляют 1 мкг/мл оротовой кислоты. В связи с малой концентрацией оротовой кислоты ее навеску, равную 1 мг (1000 мкг), разводят в 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (получается рабочий раствор, содержащий 1000 мкг, который может сохраняться в холодильнике в течение 10 дней) и стерилизуют в водяной бане 15 минут, затем отбирают необходимое количество рабочего раствора и добавляют к уже обогащенной другими ингредиентами питательной среде.

*(4) В качестве заменителя может быть использован диэтилпарафенилендиаминсульфат, парааминоэтиланилинсульфат или цветные проявители (Т-34, Т-32, ЦП-2, ЦПВ-1) в такой же концентрации.

*(5) При отсутствии гидролизата казеина рекомендуется использовать другие питательные среды: 1) среда СГДС: содержит в составе 10 мл 5% раствора гемогидролизата для культур тканей вместо гидролизата казеина, остальные ингредиенты берут в тех же количествах, как и в среде СКДС; 2) среда 199-СДС: содержит в своем составе 10 мл среды 199 или 2 мл 10-кратного концентрата среды 199 для культур тканей вместо гидролизата казеина, остальные ингредиенты берут в тех же количествах, как и в среде СКДС; 3) среда из смеси жидких стандартных кровозаменителей гидролизата казеина (8,3 мл) и раствора гидролизина (16,7 мл), 125 мл дистиллированной воды; к смеси добавляют 0,9 г хлорида натрия, по 0,15 г хлорида калия, кальция и бикарбоната натрия, 0,045 г метилтиосульфата натрия, 1,5 г мальтозы, 3,75 мг оротовой кислоты, рН среды доводят до 6,0-6,3, среду стерилизуют при 112° в течениие 20 минут; после охлаждения добавляют 30 мл стерильной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота без консерванта, 100000 ЕД пенициллина, 100000 мкг стрептомицина, 7200 ЕД амфоглюкамина.