Приложение 1. Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы

Приложение 1

Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации возбудителя сибирской язвы

1.1. Селективная дифференциально-диагностическая среда с натрия фенолфталеинфосфатом

В расплавленный питательный агар добавляют полимиксин сульфат М и триметоприм из расчета 25 мкг/мл, хорошо перемешивают. Перед розливом в чашки Петри в остуженную до 45 - 50°С среду добавляют раствор натрия фенол фталеинфосфата, предварительно прогретого при 56°С в течение 20 мин, до конечной концентрации 0,01%. После перемешивания среду разливают в чашки Петри и подсушивают в течение 1,5 ч с открытыми крышками. Чашки с агаром можно хранить в холодильнике 2 - 3 суток.

1.2. Бикарбонатно-сывороточный агар 1%-й

Предварительно готовят 10% раствор Для этого 10 г пищевой соды растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды при легком подогревании на пламени спиртовки. Затем в 100 мл расплавленного и остуженного до 50°С агара Хоттингера добавляют 10 мл 10%-го раствора соды, 10%-й инактивированной при 56°С в течение 30 мин лошадиной сыворотки. После розлива в чашки Петри и подсушивания агар можно использовать для посевов. Хранить агар не следует.

1.3. Среда ГКИ

Среда ГКИ состоит из 60 мл раствора Хенкса и 40 мл бычьей (лошадиной) сыворотки, инактивированной при 56°С в течение 30 мин. Компоненты тщательно перемешивают, доводят бикарбонатом натрия рН до 7,2. Полученную среду стерильно разливают в пробирки по 2 мл и закрывают стерильными резиновыми пробками. Среда может храниться при 4°С длительное время.

1.4. Кровяной агар

У барана из яремной вены кровь стерильно забирают в дефибринатор (флакон со стеклянными бусами) при постоянном его круговом покачивании. После окончательного формирования на бусах плотного сгустка фибрина (15 - 20 мин) кровь фильтруют через стерильную марлевую салфетку. Дефибринированную кровь добавляют в количестве 3 - 5% в расплавленный и остуженный до 45°С агар Хоттингера, который сразу же разливают в чашки Петри.

1.5. Жидкая желточная среда Дрожевкиной

Состоит из 1 части куриного желтка и 9 частей 0,9%-го раствора хлорида натрия. Приготовление и розлив производят стерильно без последующей стерилизации. Помещают на 2 сут. при 37°С для проверки на стерильность.

1.6. Минимальная среда "9АТ"

Для приготовления среды "9АТ" необходимы следующие ингредиенты (в г/л):

К2НРО4 х 3Н2O	-	4,5
КН2РO4	-	0,5
(NH4)2SO4	-	2,0
MgSO4 х 7Н2O	-	0,025
MnSO4 х Н2O	-	0,015
FeSO4 х 7Н2O	-	0,015
СаСl2 х 2Н2O	-	0,05
C6H5O7Na3 х 3H2O	-	0,5
d-глюкоза	-	4,0
l-аланин	-	0,02
l-гистидин	-	0,02
l-глутаминовая кислота	-	0,02
глицин	-	0,02
l-лизин	-	0,02
l-метионин	-	0,02
l-пролин	-	0,02
l-серин	-	0,02
l-треонин	-	0,02
тиамин	-	0,001
агар-агар "Дифко"	-	13
вода дистиллированная	-	до 1 л

1.7. Среда "СОПЭК"

Готовят среду путем растворения ингредиентов в 425 мл дистиллированной воды, в следующем соотношении (г):

l-аланин	-	0,035
l-аргинин HCl	-	0,200
l -аспарагиновая кислота	-	0,250
l-валин	-	0,240
l-гистидин HCl	-	0,074
глицин	-	0,090
l-глутамат натрия	-	0,820
l-изолейцин	-	0,230
l-лейцин	-	0,300
l-лизин	-	0,300
l-метионин	-	0,100
l-пролин	-	0,060
l-серин	-	0,310
l-треонин	-	0,160
l-тирозин	-	0,200
l-триптофан	-	0,047
l-фенилаланин	-	0,170
l-цистин	-	0,034
аденин	-	0,003
урацил	-	0,002
тиамин НС1	-	0,001
СаСl2	-	0,008
MgSO4 х 7H2O	-	0,026
MnSO4 х H2O	-	0,002
FeSO4 х Н2О	-	0,002
К2НРО4 х 3H2O	-	3,920
NaHCO3	-	8,0
d (+) глюкоза	-	2,5

Значение рН готовой среды составляет 8,0.

Полученный раствор питательной основы среды стерилизуется фильтрацией через мембранный фильтр. Навеску агарозы 15 г расплавляют в 500 мл дистиллированной воды и стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 20 мин. К расплавленной и охлажденной до 50°С агарозе стерильно добавляют подогретый до 50°С раствор питательной основы в объеме 425 мл и противосибиреязвенный глобулин жидкий в объеме 75 мл, перемешивают и разливают в чашки Петри по 10 - 12 мл.

1.8. Транспортная среда N 1

1-й вариант: NaCl - 137 М, КСl - 2,7 М, - 10 М, - 2 М, сыворотка крупного рогатого скота 20%;

2-й вариант: сахароза - 0,218 М, - 0,0038 М, - 0,0072 М, БСА - 1%.

1.9. Транспортная среда N 2 (ESP)

Саркозил - 1%; ЭДТА - 0,05 М; свободная от нуклеаз проназа Е - 1 мг/мл.