Приложение 2. Приготовление рабочих растворов и реагентов

Приложение 2

Приготовление рабочих растворов и реагентов

2.1. Фиксирующая жидкость для фиксации мазков

Фиксацию мазков проводят в соответствии с "Методическими рекомендациями по использованию этилового спирта с 3% перекиси водорода для фиксации на предметном стекле возбудителя сибирской язвы" (М., 1984). Для приготовления фиксирующей жидкости с содержанием 3%-го раствора перекиси водорода во флакон наливают 180 мл этилового спирта и 20 мл 30%-го пергидроля. Содержание перекиси водорода в пергидроле необходимо определять по методике, изложенной в Государственной фармакопее СССР (М., 1968). Содержание перекиси водорода в рабочем растворе удобно проверять с применением полосок "ДЕЗИКОНТ-ПВ-01" индикаторных химических одноразовых для экспресс-контроля концентрации перекиси водорода в диапозоне 3 - 6% фирмы ВИНАР или других фирм, производящих аналогичную продукцию. Фиксирующую жидкость можно не менять в течение месяца, при этом флакон должен закрываться притертой пробкой. Для хранения лучше использовать флакон из темного стекла. Флакон из обычного стекла необходимо держать в темном ящике (ящик лабораторного стола, холодильник). Приготовленные мазки из культур высушивают на воздухе, затем опускают во флакон с фиксирующей жидкостью. Через 30 мин стекла с мазками извлекают и просушивают на воздухе. Держать мазки более 30 мин в фиксирующей жидкости нежелательно. Можно хранить фиксированные мазки в закрытой чашке Петри в холодильнике.

2.2. Раствор Ребигера

Растворяют 15-20 г генцианвиолета в 100 мл 40%-го формалина. Раствор выдерживают при комнатной температуре в течение нескольких часов, после чего фильтруют.

2.3. Карболовый фуксин Циля

Тщательно растирают в ступке 1 г основного фуксина и 5 г кристаллической карболовой кислоты с несколькими каплями глицерина. Во время растирания при постоянном помешивании понемногу приливают 10 мл 95°-го этилового спирта и 100 мл дистиллированной воды. Краска готова к употреблению через 2-3 дня после изготовления, сохраняется длительно.

2.4. Раствор Твина-80 0,1 - 0,05%-й и определение концентрации жизнеспособных спор

Определение концентрации жизнеспособных спор проводят в соответствии с методическими рекомендациями "Использование 0,05 - 0,10%-го раствора Твина-80 как разводящей жидкости для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба" (М., 1986). 1 - 3 мл Твина-80 отливают в пробирку и греют на водяной бане при температуре 40 - 50°С в течение 5 - 10 мин. Затем во флакон, содержащий 100 мл стерильной дистиллированной воды, добавляют 1 или 2 капли прогретого Твина-80 и содержимое тщательно перемешивают. Разводящая жидкость готова для употребления и может использоваться в течение 3 - 5 дней. В 7 пробирок вносят по 4,5 мл разводящей жидкости. Делают предварительные 10-кратные разведения споровой взвеси с переносом в пробирки по 0,5 мл с помощью мерных 1 мл пипеток. На каждое разведение используют новую пипетку. При перемешивании в разводящей жидкости не следует допускать образования больших пузырей, так как это может отразиться на точности подсчета. Из разведений и по 0,1 мл взвеси высевают на поверхность подсушенного агара Хоттингера. Для каждого разведения берут не менее 3 чашек. Суспензию распределяют по поверхности агара покачиванием чашек. После впитывания суспензии чашки выдерживают в термостате при 37°С в течение 18 - 20 ч. Среднее значение количества выросших колоний, умноженное на 10 и на кратность разведения, составляет значение концентрации живых спор в исходной взвеси. Суспензию спор, приготовленную на Твине-80, не рекомендуется использовать для заражения или вакцинации животных. Для этих целей вновь готовят разведение спор на 0,9%-м растворе хлорида натрия, исходя из концентрации жизнеспособных спор, установленных описанным способом.

2.5. Лидирующий буфер с гуанидинтиоцианатом (ЛБ)

На 50 мл: гуанидинтиоцианат - 35,4 г, тритон Х-100 - 1,3 г, 0,5 М раствор ЭДТА, рН 7,4 - 4,4 мл, 0,1 М раствор Трис-НСl, рН 6,4 - до 50 мл. С помощью 10 N раствора гидроокиси натрия рН готового раствора доводят до 7,4. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при комнатной температуре до 3 мес., при 4 - 10°С - до 6 мес.

2.6. Раствор для первой отмывки (ОР-1)

На 50 мл: гуанидинтиоцианат (4 М) - 23,6 г, 0,1 М раствор Трис-НСl - до 50 мл. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при комнатной температуре до 3 мес., при 4 - 10°С - до 6 мес.

2.7. Раствор для второй отмывки (ОР-2)

1 М раствор Трис-HCl, рН 8,5 - 1 мл, 5 М раствор натрия хлорида - 1 мл, спирт этиловый - 50 мл, дистиллированная вода - 50 мл. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при комнатной температуре до 3 мес. при 4 - 10°С - до 6 мес.

2.8. Суспензия сорбента (СС)

Готовят 50% (вес/объем) суспензию силикагеля () с размером частиц 0,5 - 10 мкм в деионизованной воде.

2.9. Элюирующий буфер (ЭБ) ТЕ буфер рН 7,4

На 100 мл - 1 М раствор Трис-HCl, рН 8,0 - 1 мл, 0,5 М раствор ЭДТА - 0,2 мл, деионизованная вода - до 100 мл. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при 4 - 10°С - до 6 мес.

2.10. 0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0

Помещают 18,61 г соли в химический стакан на 100 мл, добавляют 80 мл дистиллированной воды, интенсивно размешивают на магнитной мешалке и доводят рН до с помощью натрия гидроокиси. Раствор хранят в темной полипропиленовой посуде при температуре до 3 мес.

2.11.1 М раствор трис-НСl, рН8,0 0,1

Навеску трис-(оксиметил)-аминометана - 6,5 г помещают в химический стакан на 50 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли доводят дистиллированной водой до 50 мл и выставляют рН с помощью концентрированной кислоты соляной. Раствор хранят при температуре до 3 мес.

2.12. 0,1 М раствор трис-НСl, рН 6,4 0,1

Навеску трис-(оксиметил)-аминометана - 1,21 г помещают в химический стакан на 100 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли доводят дистиллированной водой до 100 мл. Доводят рН до с помощью концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят при температуре до 3 мес.

2.13. 5 М раствор натрия хлорида

Навеску натрия хлорида - 2,922 г помещают в химический стакан на 50 мл и добавляют 8 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в стеклянной посуде при температуре до 3 мес.

2.14. 10 N раствор натрия гидроокиси

Навеску натрия гидроокиси - 40 г помещают в мерную колбу на 100 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды. После полного растворения натрия гидроксида доводят дистиллированной водой до 100 мл. Раствор хранят в непрозрачной полипропиленовой посуде при комнатной температуре до 6 мес.