Откройте актуальную версию документа прямо сейчас
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Вход
Купить систему ГАРАНТ
Получить демо-доступ
Узнать стоимость
Информационный банк
Подобрать комплект
Семинары
Приложение 2. Концентрирование ВГА из воды
Приложение 2
Концентрирование ВГА из воды
Оборудование
|
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г |
|
|
РН-метр любой марки с набором электродов с погрешностью измерений +-0,1 |
|
|
Дистиллятор электрический ДЭ-4 |
|
|
Центрифуга лабораторная рефрижераторная, например, ЦЛР - 1МРТУ-42 - 2145 |
|
|
Холодильник бытовой электрический с температурой в камере 4 - 6°С |
|
|
Холодильник бытовой электрический низкотемпературный с температурой в камере - 20°С |
|
|
Проточный мембранный фильтрующий модуль с тангенциально-радиальным движением жидкости МФМ 0142 |
ТУ 3614-005-32915592-05 |
|
Мембрана микропористая капроновая ММК - диаметр пор 0,2 мкм |
ТУ 9471-002-10471723-03 |
|
Шприцы емкостью 20 мл одноразовые, стерильные, отечественного или импортного производства |
|
|
Шприцевые насадки для фильтров (маленькие, разъемные) |
|
|
Реактивы | |
|
Биф-экстракт (Sigma, хч) |
|
|
Трисбуфер (трис(гидроксиметил) аминометан) (Serva, хч) |
|
|
Полиэтиленгликоль (ПЭГ М.в. 6000) импортного или отечественного производства |
|
|
Соляная кислота |
|
|
Натрия гидроокись |
|
|
Вода дистиллированная |
|
|
Спирт этиловый ректификованный |
ГОСТ 5962-67 |
|
Перекись водорода 33% |
|
Приготовление элюента
10-кратный раствор трисбуфера
Раствор готовят на дистиллированной воде. Растворяют в 300-400 мл воды 30,3 г триса (трис(гидроксиметил) аминометан) (Serva, хч), доводят значение рН до 9,1 концентрированной соляной кислотой и оставляют на сутки. Затем проверяют рН и при необходимости доводят еще раз значение рН до 9,1. Конечный объем раствора получают добавлением дистиллированной воды до объема 500 мл.
Рабочее разведение трисбуфера получают добавлением 9 частей стерильной дистиллированной воды к 1 части концентрированного раствора.
Приготовление 3% бифэкстракта на трисбуфере
К 100 мл рабочего раствора трисбуфера добавляют 3 г мясного экстракта (бифэкстракт) (Sigma, хч) и доводят значение рН до 9,1-9,5 однонормальным раствором гидроокиси натрия.
Оптимальным методом концентрирования вирусов в настоящее время является метод мембраной фильтрации различных объемов воды. При этом в немалой степени эффективность концентрирования вирусов зависит от степени загрязнения воды, вида мембран, характеристик фильтровальной установки, типа фильтрации.
Одним из перспективных вариантов фильтровальных установок отечественного производства является проточный мембранный фильтрующий модуль МФМ 0142 с тангенциально радиальным движением жидкости, разработанный ООО НПП "Техно-фильтр" с использованием электропозитивных мембран, которые изготавливаются ООО НПП "Технофильтр" ТУ 3697-002-10471723-03.
В модифицированном варианте модуль состоит из верхней и нижней тарелок, между которыми, зажимается электропозитивная мембрана ММК. Модуль устанавливается на треноге. Штуцер шланга для подачи исходной воды из расходной емкости соединяется со стыковочным штуцером. Фильтрат отводится через отводящую трубку.
Перед проведением исследований верхнюю и нижнюю тарелки фламбируют, между ними (после остывания) помещают электропозитивную мембрану ММК, которую смачивают стерильной дистиллированной водой и зажимают между тарелками специальным устройством. Затем в расходную емкость заливают исследуемую воду и закрывают герметично крышкой, на которой размещается манометр для контроля давления в емкости.
При работе модуля исследуемая вода проходит под давлением вдоль поверхности мембраны в закрытой системе в режиме тангенциального потока, при этом неотфильтрованный продукт возвращается в цикл, а фильтрат удаляется. Накопление вирусов на мембране обеспечивается за счет сепарационных и сорбционных процессов.
После окончания фильтрации вирусы элюируют с поверхности мембраны путем их смыва в закрытом режиме при помощи подсоединения двух стерильных шприцев объемом 20 мл. Смыв вирусов проводится 3-кратно (по 20 мл) общим объемом элюента 60 мл. В качестве элюента используют 3%-й бифэкстракт на трисбуфере с рН 9,0 - 9,4. После проведения элюции рН элюата доводят до значений 7,0 - 7,2 с помощью 1%-го раствора соляной кислоты.
Для получения надежных результатов, свидетельствующих о наличии или отсутствии вирусов в воде, необходимо исследование всего объема элюата, в данном случае 60 мл, т. к. содержание вирусов даже после концентрирования, как правило, может не превышать единичных вирионов в миллилитре элюата. В то же время, существующие методы выделения вирусов на клеточных культурах из-за высокой стоимости и трудоемкости не позволяют исследовать полностью полученный элюат.
В этой связи, с целью максимального уменьшения объема полученного элюата, вводится этап вторичного концентрирования. В настоящее время для вторичного концентрирования наиболее широко применяют метод ультрацентрифугирования или осаждение вирусов полиэтиленгликолем. В соответствии с методикой, в полученный элюат (60 мл) добавляют ПЭГ (М.в. 6000) и хлористый натрий до конечных концентраций соответственно 10% и 0,5 М. Смесь тщательно перемешивают до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10 - 12 ч при 4°С. Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10 000 g в течение 1 ч или при 6 000 g в течение 2 ч. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 6 мл стерильной дистиллированной воды. Полученный объем полностью используют для выделения вирусов на клеточной культуре и РНК/ДНК в ПЦР.
Таким образом, введение этапа вторичного концентрирования вирусов при помощи ПЭГ 6000 позволяет уменьшить объем первичного элюата в 10 раз, который в полном объеме может быть использован для выделения вирусов на различных культурах клеток и определения РНК и ДНК в ОТ-ПЦР. Высокая эффективность выделения вирусов из воды при использовании как фильтрующего модуля МФМ 0142, так и его модификации позволили включить в схему детекции вируса гепатита А оба варианта фильтрационных установок (рис. 1).
/---------------------\
| Проба воды |
\---------------------/
|
/-----------------------------------\
| 1 этап |
| Фильтрация |
\-----------------------------------/
| |
/-------------------------\ /-------------------------------\
| Установка МФМ 0142 | | Установка МФМ 0142 (мод) |
\-------------------------/ \-------------------------------/
| |
/-----------------------------------\
| 2 этап |
| Элюция (модифицированная) |
\-----------------------------------/
| |
/----------------------------------\ /-----------------------\
|- снятие мембраны | |- в закрытом режиме |
|- смыв в условиях ламинарного | | |
|бокса | | |
\----------------------------------/ \-----------------------/
| |
/-----------------------------------\
| 3 этап |
| Вторичное концентрирование |
\-----------------------------------/
|
/-------------------------------------------------\
| 4 этап |
| Выделение антигена в ИФА и РНК в ПЦР |
\-------------------------------------------------/
Рис. 1. Схема детекции вируса гепатита А