Приложение 3. Инструкция по применению набора реагентов для выявления специфических ДНК-маркеров Escherichia COLI О104:Н4 в бактериальных культурах и клиническом материале

Приложение 3

Инструкция
по применению набора реагентов для выявления специфических ДНК-маркеров Escherichia COLI О104:Н4 в бактериальных культурах и клиническом материале

1. Назначение

Набор предназначен для выявления специфических ДНК-маркеров Escherichia coli серотипа О104:Н4 в бактериальных культурах, клиническом материале и пищевых продуктах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

2. Характеристика набора

Набор содержит компоненты, необходимые для проведения ПЦР, в результате которой происходит амплификация специфических фрагментов ДНК Escherichia coli серотипа О104:Н4 - генов stx2 (шига-токсина 2), rfb-О104, контролирующего синтез первичных боковых цепей ЛПС (определяет серогруппу О104), flicH4, определяющего синтез жгутикового антигена Н4.

В качестве внутреннего контроля используется дополнительная пара праймеров на консервативную область гена 16S rRNA. Это позволяет учесть возможное ингибирование реакции и исключить ложно-отрицательный результат.

2.1. Принцип действия

В основе метода лежит полимеразная цепная реакция с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров. Детекция продуктов амплификации осуществляется электрофорезом в агарозном геле.

2.2. Состав набора (на 100 реакций)

-	ПЦР-буфер	-	2 пробирки по 1,2 мл
-	Taq-POL (Taq I-полимераза)	-	40 мкл
-	смесь Мульти О104	-	500 мкл
-	dNTP (смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов)	-	50 мкл
-	(деионизованная вода)	-	400 мкл
-	мин. масло (минеральное масло)	-	2,0 мл
-	О104+ (положительный контроль)	-	100 мкл

3. Оборудование и материалы

ПЦР-бокс или отдельный стол, снабженный УФ-лампой

Твердотельный термостат или водяная баня

Набор автоматических пипеток переменного объема

Одноразовые наконечники для автоматических пипеток

Пробирки для микропроб объемом 1,5 мл

Пробирки для ПЦР на 0,5 мл или 0,2 мл

Вортекс-центрифуга

Центрифуга настольная

Термоциклер

Охладитель проб

Источник тока

Электрофорезная камера

Источник УФ

Весы лабораторные 2 класса точности

Холодильник бытовой с морозильной камерой

Отдельный халат и одноразовые перчатки

Емкость для сброса использованных наконечников

Вода дистиллированная

4. Проведение анализа

4.1. Приготовление образцов для анализа в ПЦР: бактериальные клетки суспендировать в 100 мкл стерильной дистиллированной воды до концентрации в пробирках 1,5 мл типа "Эппендорф". Пробы прогреть при температуре 98°С в течение 15 минут (твердотельный термостат или водяная баня). Центрифугировать 5 минут при 2000 - 3000 g (4000 - 6000 об/мин.). Для многократного использования хранить при температуре минус 20°С.

Для приготовления образцов из клинического материала использовать коммерческие наборы для выделения ДНК из клинического материала, например, "ДНК-сорб-В", "ДНК-экспресс", следуя указаниям инструкции изготовителя.

4.2 Проведение ПЦР

1. Перед проведением ПЦР-анализа внести в одну или обе (в зависимости от объема исследования) пробирки "ПЦР-буфер" по 20 мкл фермента Taql-полимеразы из пробирки "Taq-POL". Полученной смеси "ПЦР-буфер+" в каждой пробирке достаточно для проведения ПЦР-анализа 50 образцов. Смесь ПЦР-буфера с Taql-полимеразой "ПЦР-буфер+" можно хранить при температуре +4°С не более 6 мес. Отдельные компоненты "ПЦР-буфер" и "Taq-POL" можно хранить при температуре минус 20°С в течение 1 года.

2. Перенести содержимое пробирки "dNTP" в пробирку "смесь Мульти О104". Полученную смесь "Мульти О104 с dNTP", рассчитанную на 100 реакций, можно хранить при температуре +4°С в течение 6 мес.

3. Включить охладитель проб (для охлаждения штативов с пробирками можно использовать ледяные блоки).

4. В охлажденный штатив расставить ряд пробирок для ПЦР. Количество пробирок должно соответствовать количеству анализируемых образцов с учетом двух дополнительных пробирок, предназначенных для отрицательного и положительного контролей.

5. Внести на дно каждой пробирки по 20 мкл смеси "ПЦР-буфер+" (ПЦР-буфер с Taq I-полимеразой, п. 1).

6 Добавить во все пробирки по 5 мкл раствора "смесь Мульти О104 с dNTP" (п. 2).

7. Добавить во все пробирки по одной капле (~20 - 30 мкл) минерального масла. Если используется термоциклер с подогреваемой крышкой, то минеральное масло не добавлять.

8. В пробирку для отрицательного контроля внести 5 мкл деионизованной воды -
"".

9. В пробирки для исследуемых образцов внести по 5 мкл лизатов клеток или 5 мкл образцов, выделенных из клинических проб.

10. В пробирку для положительного контроля внести 5 мкл раствора "О104+"

11. Все пробирки встряхнуть на вортексе, жидкость осадить на дно пробирок кратковременным откручиванием на вортекс-центрифуге. Пробирки поместить в блок термоциклера после прогрева прибора в режиме паузы при 95°С (режим горячего старта).

12. Провести реакцию амплификации по программе: 1-й цикл: 95°С - 5 мин, 58°С - 1 мин, 73°С - 1 мин; далее 30 - 40 циклов: 94°С - 30 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 30 сек; в конце: 1 цикл: 72°С - 3 мин, 10°С - охлаждение (хранение). При тестировании лизатов клеток достаточно 25 - 30 циклов реакции.

13. После окончания реакции амплификации пробирки отправить в комнату для анализа продуктов ПЦР. Пробы после амплификации можно хранить в течение нескольких дней при 4 - 8°С и несколько месяцев при минус 20°С.

4.3 Анализ продуктов ПЦР

4.3.1 Приготовление агарозных гелей для электрофореза

Трис-боратный буфер (ТБЕ) для электрофореза: готовится концентрированный (пятикратный) буфер 5xТБЕ (54 г Трис-осн., 27 г борной кислоты, 20 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 растворяется в 1 л дистиллированной воды), который разводится перед проведением анализа (к 200,0 мл 5xТБЕ добавить 800,0 мл дистиллированной воды).

Буфер для нанесения образцов (десятикратный): 0,025 г бромфенолового синего; 4 мл глицерина; 5 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0; довести до 10 мл дистиллированной водой.

Раствор 1,5% агарозы: взвесить 1,5 г агарозы, растворить в 100 мл ТБЕ буфера, поставить в кипящую водяную баню и выдержать 30 минут до полного растворения агарозы. Для приготовления агарозы можно использовать СВЧ-печь. Раствор охладить до 45 - 50°С и залить необходимый гель (длина рабочей зоны геля должна быть не менее 8 см). Агарозные гели можно приготовить за время проведения реакции ПЦР.

4.3.2 Электрофорез в агарозном геле

Детекция продуктов амплификации осуществляется электрофорезом в агарозном геле.

15 - 20 мкл реакционной смеси (ПЦР-продукт) из каждой пробирки смешать с 2 мкл буфера для нанесения образцов, внести в лунки агарозного геля и провести электрофорез при 10 в/см в течение 30 - 60 минут, бромфеноловый краситель должен пройти до нижней границы геля. Гель окрасить в водном растворе бромистого этидия (5 мкг/мл) в течение 30 минут, с последующей 20 минутной отмывкой в дистиллированной воде.

Внимание! Бромид этидия - канцерогенное соединение; работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой.

Документация результатов проводится визуально при просмотре геля на УФ-трансиллюминаторе с длиной волны 254 - 360 нм и фотографировании гелей с использованием оранжевого светофильтра.

5. Учет результатов

Результат ПЦР-анализа учитывается по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических красно-оранжевых флюоресцирующих полос амплифицированной ДНК.

Положительный контрольный образец ДНК. Сигнал от положительного контроля виден как четыре фрагмента следующих размеров: 1250 п.н. (ген 16SrRNA), 480 п.н. (stx2-ген), 407 п.н. (ген rfb-O104), 300 п.н. (ген flicH4) (рис. 1)

Отрицательный контрольный образец: в амплификате отрицательного контрольного образца не должно наблюдаться красно-оранжевых флюоресцирующих полос, соответствующих ампликонам положительного контроля. Наличие таких полос свидетельствует о контаминации используемого набора реагентов. В этом случае необходимо повторное исследование. При проведении ПЦР белее 35 циклов возможно появление фрагмента 1250 п.н. гена 16S rRNA (следствие использования рекомбинантной Taq I-полимеразы).

Анализируемые клинические образцы:

- при наличии в пробе анализируемого образца ДНК E.coli серотипа О104:Н4 в геле должны наблюдаться три красно-оранжевые флюоресцирующие полосы специфических фрагментов ДНК размером 480 п.н. (stx2-ген), 407 п.н. (ген rfb-О104) и 300 п.н. (ген flicH4), а также флюоресцирующая полоса, соответствующая фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA (внутренний контроль) (рис. 1);

- при отсутствии в пробе анализируемого образца ДНК E.coli серотипа О104:Н4 и наличии ДНК других бактерий в геле должна наблюдаться только одна флюоресцирующая полоса, соответствующая фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA (внутренний контроль);

- отсутствие флюоресцирующей полосы, соответствующей фрагменту 1250 п.н. гена 16S rRNA, говорит об ингибировании реакции и необходимости повторного исследования или об отсутствии в данной пробе какой-либо бактериальной ДНК.

6. Меры предосторожности

Организация работ на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, а также обеззараживания проб проводится в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Работа на остальных этапах ПЦР-анализа проводится как с обеззараженным материалом.

7. Условия хранения

Набор необходимо хранить при температуре 2 - 8°С в течение 6 месяцев.

Транспортирование: при температуре от 2°С до 8°С.