Приложение 5. Определение чувствительности культур Е. coli к антибиотикам

Приложение 5

Определение чувствительности культур Е. coli к антибиотикам

Чувствительность штаммов E.coli к антибиотикам диско-диффузионным методом (ДДМ или методом дисков) определяют согласно Методическим указаниям МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам"

Принцип метода

ДДМ определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам основан на способности антибактериальных препаратов (АБП) диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара.

Приготовление питательных сред для определения чувствительности

Для оценки чувствительности культуры E.coli к антибиотикам необходимо использовать только специально предназначенные для этой цели среды. Каждую партию плотных питательных сред перед применением необходимо проверять на пригодность для роста тестируемых микроорганизмов. Для этого используются соответствующие контрольные штаммы, например, E.coli АТСС 25922 или E.coli ATCC 38218. Внутрилабораторный контроль качества среды необходимо проводить при использовании всех известных коммерчески доступных питательных сред, независимо от их производителя.

Выбранная питательная среда для определения чувствительности готовится из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду охлаждают до 48 - 50°С и разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм - 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания агара. Приготовленные указанным образом питательные среды предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при +4 - +8°С в течение 5 суток.

Контроль качества питательных сред, используемых для определения чувствительности E.coli к антибиотикам

Контроль роста

Из суточной культуры E.coli ATCC 25922 или E.coli ATCC 38218 (или другой культуры) готовят микробную взвесь, соответствующую по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда (содержащую приблизительно ), затем из этой взвеси готовят серию последовательных десятикратных разведений. На приготовленные чашки с проверяемой средой высевают по 0,1 мл взвеси -5, -6, -7 разведений, содержащих соответственно , , . При хороших питательных свойствах среды должен отмечаться рост микроорганизмов из -6, -7 разведений.

Интегральный контроль качества определения чувствительности

Наиболее доступным интегральным методом оценки качества определения чувствительности патогенов к антибиотикам является сопоставление результатов определения чувствительности (диаметров зон подавления роста) контрольных (референтных) штаммов микроорганизмов с соответствующими показателями, приведенными в их паспортной характеристике. Тестирование контрольных штаммов проводят в соответствии с описанными выше методами, параллельно тестированию клинических изолятов.

Диски с антибиотиками

Для получения правильных результатов определения чувствительности ДДМ необходимо строго соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может снизиться ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности.

Долговременное хранение дисков с АБП осуществляется в герметичной упаковке в морозильной камере при температуре -18°С и ниже. Небольшие партии дисков, используемые при повседневной работе, можно хранить в холодильнике при температуре +4 - +8°С, плотно укупоренными так, чтобы гарантировать невозможность попадания во флакон влаги, кроме того для дополнительной защиты от влаги во флаконах (картриджах) с дисками коммерческого изготовления содержится специальный влагопоглотитель (силикагель).

Флаконы (картриджи) с дисками следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать герметично закрытыми до достижения ими комнатной температуры, что предотвращает образование конденсата на дисках после открывания флаконов.

Внимание! Для получения достоверных результатов используйте диски отечественных производителей на средах АГВ или типа АГВ производства филиала "Питательные среды г. Махачкала ООО "Микроген" и ФБУН ГНЦПМБ, а среду Мюллер-Хинтона только с импортными дисками.

Приготовление бактериальной суспензии и инокуляция

При определении чувствительности ДДМ используют стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащий примерно . Инокулюм следует использовать в течение 15 минут после приготовления. Для засева приготовленных чашек с питательной средой стандартный инокулюм наносят пипеткой на поверхность агаровой пластинки чашки Петри в объеме 1 - 2 мл, равномерно распределяют взвесь микроорганизмов по поверхности питательной среды покачиванием, после чего удаляют избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин.

Аппликация дисков и инкубация

Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции тестируемого микроба на поверхность питательной среды наносят диски с АБП. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15 - 20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с АБП. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри с посевами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 18 - 24 ч. Увеличение интервала времени между нанесением дисков на поверхность среды и началом инкубации (а соответственно - началом роста исследуемой культуры микроорганизма) приводит к "преддиффузии" АБП в агар и к увеличению диаметра зоны подавления роста.

Учет результатов

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем.

При измерении зон задержки роста испытуемой культуры следует учитывать лишь зону полного подавления видимого роста бактерий. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста тестируемого микроба только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны.

Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста тестируемого микроба, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции микроорганизмов, в этом случае необходимо повторить идентификацию микроорганизма, формирующего эту колонию, и определение чувствительности этого штамма.

В таблице приведена антибиотикограмма штамма E.coli O104:H4 и интерпретация результатов определения чувствительности E.coli к антибиотикам по величине зон подавления роста испытуемого штамма.

Справочная таблица для определения чувствительности к антибиотикам штаммов E.coli, подозрительных на принадлежность их к STEC О104:Н4

Тестируемый антибиотик	Содержание антибиотика в диске, мкг	Чувствительность E.coli O104:H4	Диаметр зон подавления роста, мм
			S	I	R	Контрольных штаммов E.coli АTCC 25922 E.coli ATCC 35218
1	2	3	4	5	6	7
Ампициллин	10	R		14-16		16-22
Амоксициллин/клавуланат	20/10	R		14-17		18-24
Цефуроксим	30	R		15-17		20-26
Цефокситин	30	R		15-17		23-29
Цефподоксим	10	R		18-20		23-28
Цефотаксим	30	R		15-22		29-35
Имипенем	10	S		14-15		26-32
Меропенем	10	S		14-15		28-34
Налидиксовая кислота	30	R		14-18		22-28
Норфлоксацин	10	S		13-16		28-35
Ципрофлоксацин	5	S		16-20		30-40
Амикацин	30	S		15-16		19-26
Гентамицин	10	S		13-14		19-26
Тобрамицин	10	S		13-14		18-26
Канамицин	30	S		14-17		17-25
Хлорамфеникол	30	S		13-17		21-27
Тетрациклин	30	R		12-14		18-25
Нитрофурантоин	300	S		15-16		20-25
Ко-тримоксазол (1/19)	1,25/23,75	R		11-15		23-29
Фосфомицин*	200	S		13-15		22-30

______________________________

* - для фосфомицина в питательную среду необходимо добавить глюкозо-6-фосфат до концентрации 25 мкг/мл