Приложение 2. Инструкция по применению экспресс-теста для определения энтерогеморрагических E.coli

Приложение 2

Инструкция
по применению экспресс-теста для определения энтерогеморрагических E.coli

Иммунохроматографический экспресс-тест, который выявляет наличие веротоксинов (шигоподных токсинов), продуцируемых энтерогеморрагическими (ЕНЕС) патогенными штаммами E.coli (включая E.coli О157:H7), при выделении из пищевых продуктов.

Принцип работы иммунохроматографического теста основан на взаимодействии антигенов, находящихся в образце исследуемого материала с антителами, меченными золотом. Иммунохроматографический тест (Duopath Verotoxins или аналоги) представляет собой диагностическую тест-панель с круглой лункой для добавления образца, овальным окном с тестовыми зонами (VT1) и (VT2) и контрольной (С) зоной.

1) Образец добавляется в круглую лунку.

2) Образец адсорбируется подложкой и взаимодействует со специфичными к веротоксинам (VT1) и (VT2) антителами.

3) В присутствии антигенов (веротоксинов) образуется комплекс с меченными антителами, который мигрирует до зоны связывания в тестовой зоне (VT1) и (VT2).

4) Зоны связывания (VT1) и (VT2) содержат соответствующие антитела к комплексу антиген-антитело. В результате образуется четкая красная линия в одной зоне (VT1) (наличие веротоксинов группы 1) или в другой зоне (VT2) (наличие веротоксинов группы 2) или в двух зонах сразу при наличии веротоксинов обеих групп (VT1) и (VT2).

5) Оставшийся образец продолжает движение к контрольной зоне (С) и образует четкую красную линию, указывающую на то, что тест работает правильно.

Чувствительность метода - нижний предел обнаружения веротоксинов составляет 25 нг/мл для веротоксинов группы 1 (VT1) и 62,5 нг/мл для веротоксинов группы 2 (VT2).

Условия хранения

Иммунохроматографические тесты стабильны до даты, указанной на упаковке, при хранении в условиях +2-8°С.

Проведение анализа

(I) Выявление энтерогеморрагических E.coli в образцах пищевых продуктов

1) Смешать 25 г (мл) образца с 225 мл среды обогащения. Выбор среды обогащения зависит от типа продукта. Среда для молочных продуктов - модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином. Среда для мясных продуктов - модифицированный бульон ЕС с новобиоцином.

2) При необходимости гомогенизировать образец. Инкубировать триптиказо-соевый бульон с новобиоцином в течение 18 - 24 ч при 37°С, а модифицированный бульон ЕС с новобиоцином в течение 18 - 24 ч при 41,5°С.

3) Со среды обогащения посеять на Макконки агар с сорбитолом и инкубировать в течение 18 - 24 ч при 37°С.

4) Выбрать 1 - 5 характерные колонии E.coli со Макконки агара с сорбитолом.

5) Ресуспендировать колонии в 1 мл бульона с добавкой индуктора синтеза веротоксинов.

6) Инкубировать в течение 6 часов при 37°С.

7) Перенести 180 мкл культуральной жидкости бульона с добавлением индукторов синтеза веротоксинов в пластиковую пробирку (эппендорф).

8) К флакону с полимиксином В добавить 1 мл стерильной дистиллированной воды.

9) Добавить 20 мкл раствора полимиксина В к 180 мкл культуральной жидкости с бульоном с добавкой индуктора синтеза веротоксинов и перемешать. Инкубировать в течение 10 минут при 37°С.

10) Дать остыть до комнатной температуры.

Примечание. На агаре Мак-Конки с сорбитолом и селективной добавкой СТ способны расти только штаммы E.coli О157. Для определения синтеза веротоксинов от других сероваров E.coli, должен быть заменен на Макконки агар с сорбитолом или агар с сердечно-мозговой вытяжкой.

Проведение тестирования

1) Перед использованием обогащенный образец и иммунохроматографический тест должны быть комнатной температуры (обычно тесты хранятся в холодильнике).

2) Вскрыть пакет из фольги, в который упакован тест.

3) Положить тест на ровную поверхность и отмаркировать (указать номер исследуемого образца). Тестирование должно быть проведено в течение 2 часов после вскрытия фольги!

4) Используя микропипетку и одноразовый наконечник, добавить 150 мкл охлажденной культуральной жидкости в круглую лунку для образца.

5) Считать результаты через 20 минут после добавления образца.

Интерпретация результатов

1) Результаты теста учитываются только при наличии четкой красной линии в контрольной зоне (С) через 20 минут.

2) Образец считается положительным, если после 20 минут или ранее красные линии образовались как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной (С) зоне.

3) Образец считается отрицательным, если красная линия отсутствует в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), но присутствует в контрольной зоне (С).

4) Тест следует повторить, если красные линии отсутствуют как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной зоне (С) через 20 минут.

(II) Выявление энтерогеморрагических E.coli из клинического материала

1) Посеять клинический материал (фекалии) на агар Мак Конки с сорбитолом и инкубировать 18 - 24 часа при 37°С.

2) Снять тампоном выросшие на агаре колонии, пересекая несколько раз зону сливного роста.

3) Ресуспендировать колонии в 1 мл бульона с добавкой индуктора синтеза веротоксинов. Инкубировать в течение 6 часов при 37°С.

4) Перенести 180 мкл культуральной жидкости бульона с добавкой индуктора синтеза веротоксинов в пластиковую пробирку (эппендорф).

5) К флакону с полимиксином В добавить 1 мл стерильной дистиллированной воды. Добавить 20 мкл раствора полимиксина В к 180 мкл культуральной жидкости с CAYE-бульоном и перемешать. Инкубировать в течение 10 минут при 37°С.

6) Дать остыть до комнатной температуры.

Проведение тестирования

1) Перед использованием обогащенный образец и иммунохроматографический тест должны быть комнатной температуры (обычно тесты хранятся в холодильнике).

2) Вскрыть пакет из фольги, в который упакован тест.

3) Положить тест на ровную поверхность и отмаркировать (указать номер исследуемого образца). Тестирование должно быть проведено в течение 2 часов после вскрытия фольги!

4) Используя микропипетку и одноразовый наконечник, добавить 150 мкл охлажденной культуральной жидкости в круглую лунку для образца.

5) Считать результаты через 20 минут после добавления образца.

Интерпретация результатов

1) Результаты теста учитываются только при наличии четкой красной линии в контрольной зоне (С) через 20 минут.

2) Образец считается положительным, если после 20 минут или ранее красные линии образовались как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной (С) зоне.

3) Образец считается отрицательным, если красная линия отсутствует в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), но присутствует в контрольной зоне (С).

4) Тест следует повторить, если красные линии отсутствуют как в тестовых зонах (VT1) и/или (VT2), так и в контрольной зоне (С) через 20 минут.

Бульон для индукции токсинов энтерогеморрагических E.coli

Принцип действия

Казаминовые кислоты и дрожжевой экстракт ускоряют рост веротоксин-продуцирующих штаммов E.coli. Микроэлементы и высокое значение рН также поддерживают синтез веротоксинов.

Состав среды (г/л) (CAYE-бульон или аналог)

Казаминовые кислоты 20,0; дрожжевой экстракт 6,0; глюкоза 2,5; хлорид натрия 2,5; гидрофосфат калия двузамещенный 8,71; сульфат магния 0,05; хлорид марганца 0,005.

Приготовление

Растворить 7,95 г среды в 200 мл дистиллированной воды и нагреть на кипящей водяной бане регулярно помешивая до полного растворения среды. Автоклавировать при 121°С 15 минут. Охладить среду до комнатной температуры. В асептичных условиях добавить один флакон приготовленной добавки (для индукции синтеза веротоксинов), перемешать; разлить по 1 мл при перемешивании в стерильные пробирки. рН: при 25°С. Приготовленный бульон светло-коричневого цвета, прозрачный. Осадок, который иногда может образоваться, не влияет на качество среды.

Проведение анализа

Отобрать 5 - 6 типичных колоний со среды выделения и инокулировать в пробирки с бульоном. Инкубировать 6 часов при 37°С без перемешивания.

Контроль качества

Тест-штаммы	Продукция веротоксинов
Escherichia coli O157:H7 43889	VT1 (-)	VT2 (+)
Escherichia coli О157.Н7 43890	VT1 (+)	VT2 (-)
Escherichia coli O157:H7 43888	VT1 (-)	VT2 (-)
Escherichia coli O157:H7 43885	VT1 (+)	VT2 (+)