Приложение 2. Методы лабораторной диагностики норовирусной инфекции

Приложение 2

Методы лабораторной диагностики норовирусной инфекции

Безопасность работы в лаборатории, выполняющей диагностические исследования норовирусной инфекции

Выполнение диагностических исследований при подозрении на норовирусную инфекцию проводят в лабораториях, организациях, структурных подразделениях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на выполнение работ с микроорганизмами III - IV групп патогенности, в соответствии с СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", с дополнением СП 1.3.2518-09 от 02.06.2009 N 42.

Правила забора и транспортирования материала от больных и из объектов внешней среды для проведения лабораторных исследований

Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактического учреждения. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры, стерильными инструментами.

Упаковка, условия хранения и транспортирования материала для проведения лабораторной диагностики норовирусной инфекции должны соответствовать требованиям СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности" и СП 1.3.1325-03 "Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом".

Пробы для выделения вируса берут с соблюдением предосторожностей, исключающих контаминацию одной пробы материалом другой этого же больного или материалом пробы другого обследуемого. Для отбора проб используют стерильную пластиковую посуду.

Образцы фекалий (05-1,0 г.) у грудных детей забирают из подгузника, у пациентов старшего возраста - из помещенного в горшок или подкладное судно одноразового полиэтиленового пакета или одноразовой пластиковой емкости (чашка Петри). Затем в количестве 1,0 г (примерно) переносят в специальный стерильный контейнер. Контейнер с материалом доставляется в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 суток в условиях холодовой цепи.

Условия хранения и транспортировки материала:

- при температуре 2-8°С - в течение 1 суток;

- при температуре минус 20°С - в течение 1 недели;

Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Отбор проб из водных источников и их транспортирование проводят в соответствии с МУ 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический контроль водных объектов".

Применение молекулярно-генетических методов исследования, а также сбор, упаковка, хранение и транспортирование биологического материала и образцов объектов окружающей среды (ООС) при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью различной этиологии регламентированы МУК 4.2.2746-10 "Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью".

Объем выборки ООС (продукты питания, смывы с поверхностей, концентраты образцов воды) определяется специалистами, уполномоченными осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор. При исследовании продуктов питания обязательным является исследование смывов с их упаковок, поэтому продукты питания для исследования необходимо предоставлять в целой упаковке.

Приготовление суспензий, осветление, очистка образцов, удаление бактериальной флоры

Подготовка образцов фекалий к исследованию на норовирус включает приготовление 10% суспензии, гомогенизацию, центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 минут для удаления бактериальной флоры. При обследовании объектов внешней среды и пищевых продуктов проводят предварительное концентрирование исследуемого материала в соответствии с МУ 4.2.2029-05 "Санитарно-вирусологический контроль водных объектов".

Электронная микроскопия

Первоначально для детекции норовирусов использовали прямую электронную микроскопию. Детекция кишечных вирусов в образцах стула с использованием прямой ЭМ требует концентрации вирусов, по крайней мере, 106 на 1 мл фекалий. Однако вирионы норовирусов присутствуют в фекалиях в более низких концентрациях и не имеют ярко выраженной морфологии. Это делает затруднительным применение прямой микроскопии для выявления норовирусов. Более эффективно использование электронной микроскопии в отношении саповирусов, обладающих характерной морфологией. Специфичность и чувствительность метода повышается при использовании иммуноэлектронной микроскопии.

Иммуноферментный анализ

Норовирусы человека практически не способны культивироваться в клеточных культурах и пассироваться на лабораторных животных. Разрабатываемые экспериментальные методы культивирования норовирусов пока не дают возможность получать вирус в больших количествах. В связи с этим в качестве источника антигенов для разработки иммунологических методов, таких как радиоиммунный анализ, блокирующий радиоиммунный анализ, иммуноферментный анализ, иммунная адгезия, ранее использовали материалы, полученные от больных или экспериментально инфицированных добровольцев.

Успешное клонирование генома вируса Narwolk привело к разработке новых методов и реагентов для диагностики инфекций, вызванных калицивирусами человека. Путем экспрессии капсидного белка вируса Norwalk в бакуловирусной системе были получены вирусоподобные частицы, морфологически и антигенно подобные нативным вирионам. Вирусоподобные частицы были использованы при иммунизации животных для получения иммунных сывороток, поликлональных и моноклональных антител, на базе которых были разработаны различные варианты иммуноферментных диагностических тест-систем (иммуноферментный анализ с гипериммунной сывороткой животных, иммуноферментный анализ с моноклональными антителами, иммуноферментный анализ с вирусоподобными частицами).

Иммунохроматографический анализ

В настоящее время разработаны коммерческие иммунохроматографические наборы для диагностики норовирусной инфекции, не уступающие по чувствительности и специфичности имеющимся тест-системам для ИФА. Основным их преимуществом является экспрессность, время проведения анализа не превышает 15 минут.

Полимеразная цепная реакция

Клонирование вируса Norwalk и определение последовательности его генома стимулировало развитие генодиагностики калицивирусной инфекции. Были разработаны методики на основе молекулярной гибридизации, которые, однако, не получили широкого распространения в связи с внедрением более чувствительного метода - обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции. С момента разработки первых ОТ-ПЦР анализов для детекции вируса Norwalk эта методология стала одним из основных средств диагностики калицивирусной инфекции человека.

Предложено множество диагностических праймеров для выявления РНК норовирусов. Большинство из них фланкируют участки гена, кодирующего полимеразу, который характеризуется меньшей вариабельностью по сравнению с другими регионами генома. Относительный консерватизм региона полимеразы позволяет сконструировать праймеры для амплификации большинства калицивирусов человека. Праймеры, разработанные на основе других участков генома используются для дифференциации норовирусов I-й и II-й геногрупп и саповирусов.

Для повышения чувствительности обнаружения норовирусов в 10-1000 раз используют "гнездовую" или "полугнездовую" ПЦР. Однако главный недостаток этого подхода - увеличение возможности перекрестной контаминации образцов. Избежать этого недостатка позволяет постановка ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Разработаны методики "реал-тайм"-ПЦР для выявления норовирусов I-й и II-й геногрупп.

Секвенирование участков генома норовирусов

Определение нуклеотидных последовательностей отдельных участков генома норовирусов и последующий филогенетический анализ способствуют решению конкретных эпидемиологических задач. Сравнение участков гена РНК-зависимой РНК-полимеразы и N/S-домена капсидного белка позволяет определить принадлежность норовируса к той или иной геногруппе, генотипу или геноварианту, в частности, зафиксировать появление в популяции нового эпидемического варианта. Появление нового геноварианта генотипа GII.4 в последние годы коррелировало с ростом заболеваемости норовирусным гастроэнтеритоми, и, вероятно, может в дальнейшем служить прогностическим признаком осложнения эпидситуации по норовирусной инфекции.

Эпидемиологическим маркером при расследовании вспышек и установлении взаимосвязей в очагах инфекции является анализ наиболее вариабельного участка генома норовирусов, кодирующего субдомен P2 основного капсидного белка. Показана 100%-ная идентичность данного участка у норовирусов, выделенных в ходе одной вспышки. Анализ этого штаммоспецифичного участка является инструментом для отслеживания передачи вируса, оценки единства или множественности источников инфекции.

В настоящее время в рамках международного проекта Noronet функционирует интернет-система, позволяющая провести генотипирование штамма на основе сравнения полученной нуклеотидной последовательности соответствующего участка с имеющимися в базе данных последовательностями типовых штаммов [http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/ typingtool]. В случае выявления нового генотипа для определения наиболее близких нуклеотидных последовательностей может быть использован алгоритм BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/].

Для проведения молекулярно-генетических исследований материалы, положительные на норовирусы, могут быть направлены по согласованию в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций ФБУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора, в референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора.