Приложение. Правила получения биологического материала

Приложение
к приказу
Минздрава
Республики Хакасия
от 19 сентября 2017 г. N 1001

Правила
получения биологического материала

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей при подозрении на ВП исследуется мокрота при глубоком откашливании, мокрота, полученная при индукции ингаляцией стерильного 5%-го раствора натрия хлорида через небулайзер, мокрота, полученная аспирацией из трахеи с помощью хирургического вакуумного или электрического отсоса, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), получаемый с помощью фибробронхоскопии, а также кровь и плевральная жидкость.

В случае невозможности получения материала из нижних дыхательных путей при исследовании на респираторные вирусы, микроплазму и хламидию допустимо использование мазков из верхних дыхательных путей (из нижнего носового хода и с задней стенки глотки), которые берут у пациента как можно раньше от момента появления симптомов ОРЗ в одну пробирку и исследуют как один образец.

При подозрении на легионеллезную или паразитарную этиологию инфекции нижних дыхательных путей исследуются прижизненный БАЛ или биоптаты ткани легких.

У госпитализированных пациентов материал для исследования следует собирать как можно раньше при поступлении (не позднее вторых суток), поскольку в более поздние сроки не исключена возможность супер инфекции при контакте с другими пациентами.

Сбор биологического материала для бактериологического исследования следует проводить до назначения антибиотиков.

В случае летального исхода исследуется посмертный (аутопсийный) материал.

Правила получения свободно отделяемой мокроты для бактериологического и ПЦР-исследования

Для сбора мокроты необходимо использовать стерильные герметично закрывающиеся пластиковые контейнеры. Перед сбором мокроты необходимо попросить пациента тщательно прополоскать рот кипяченой водой. Сбор мокроты осуществляется натощак или не ранее 2 ч после еды.

Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть, что способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. Затем пациента просят хорошо откашляться и собрать отделяемое из нижних дыхательных путей (не слюну!) в стерильный контейнер. Объем образца мокроты должен быть не менее 3 мл для взрослых и около 1 мл для детей.

До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование следует хранить в холодильнике при температуре 4 - 8 °С. Продолжительность хранения мокроты при комнатной температуре не должна превышать 2 ч. Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца мокроты в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 ° С, более длительно - при температуре не выше - 16 °С.

Правила получения венозной крови для бактериологического исследования

Для сбора крови с целью бактериологического исследования используются коммерческие герметично закрывающиеся стеклянные флаконы или флаконы из ударопрочного автоклавируемого пластика двух видов (содержащие питательную среду для выделения аэробов и анаэробов). Забор крови производится шприцем, кровь асептически переносится во флакон с транспортной средой непосредственно через резиновую пробку.

Забираются 2 образца венозной крови с интервалом 20 - 30 мин из различных периферических вен - например, левой и правой локтевой вены. Один образец помешается во флакон для выделения аэробов, другой для выделения анаэробов. Объем крови при каждой венепункции должен составлять не менее 10 мл для взрослых и 3 мл для детей.

Непосредственно перед венепункцией производится дезинфекция кожи в месте венепункции циркулярными движениями от центра к периферии дважды 70%- м раствором спирта или 1 - 2%-м раствором йода. Необходимо дождаться полного высыхания дезинфектанта, и провести манипуляцию, не касаясь места обработки кожи.

После венепункции следует удалить оставшийся йод с поверхности кожи, чтобы избежать ожога.

До момента транспортирования с целью бактериологического исследования образец вместе с направлением хранится при комнатной температуре (не более 2 ч) или в термостате.

Правила получения венозной крови для ПЦР-исследования

Взятие крови следует производить натощак или через 3 ч после приема пищи из локтевой вены в положении сидя. Взятие крови осуществляют в пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА).

Непосредственно перед венепункцией производится дезинфекция кожи в месте венепункции циркулярными движениями от центра к периферии дважды 70%- м раствором спирта или 1 - 2%-м раствором йода. Необходимо дождаться полного высыхания дезинфектанта, и провести манипуляцию, не касаясь места обработки кожи. После венепункции следует удалить оставшийся йод с поверхности кожи, чтобы избежать ожога.

После взятия крови пробирку следует несколько раз плавно перевернуть вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась. Пробирку поместить в штатив.

До момента транспортирования в лабораторию с целью ПЦР-исследования образец вместе с направлением хранится при температуре 20 - 25 °С в течение 6 ч с момента получения материала - для количественного определения нуклеиновых кислот, и в течение 12 ч - для качественного определения нуклеиновых кислот; при температуре 2 - 8 °С - не более одних суток для качественного и количественного определения ДНК/РНК инфекционных объектов. Замораживание образцов цельной крови недопустимо.

Правила получения плевральной жидкости для бактериологического и ПЦР-исследования.

Взятие материала осуществлять в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки объемом 10-15 мл.

Перед манипуляцией производится дезинфекция кожи 70%-м этиловым спиртом, затем 1 - 2%-м раствором йода, избыток йода удаляется марлевой салфеткой, смоченной 70%-м спиртом во избежание ожога кожи пациента.

После этого выполняется через кожная аспирация для получения пробы плевральной жидкости при тщательном соблюдении правил асептики. Объем пробы должен составлять не менее 5 мл. Из шприца удаляются все пузырьки воздуха, после чего проба немедленно переносится в стерильный пластиковый контейнер. Контейнер плотно закрывается крышкой.

До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование хранится в холодильнике при температуре 4 - 8 °С. Продолжительность хранения плевральной жидкости при комнатной температуре не должна превышать 2 ч. Для исследования методом ПЦР допускается хранение образца в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно - при температуре не выше -16 °С.

Правила получения бронхоальвеолярного лаважа при подозрении на легионеллезную или паразитарную этиологию тяжелой ВП Бронхоскопия выполняется в условиях оксигенотерапии (ингаляция кислорода через носовые катетеры, с помощью маски Вентури либо маски с резервуаром). Если не удается обеспечить достаточную оксигенацию крови, бронхоскопия выполняется в условиях неинвазивной вентиляции легких. У больных на искусственной вентиляции легких процедура выполняется под общей анестезией в условиях миоплегии через адаптер респиратора, снабженный клапаном для бронхоскопа. Бронхоальвеолярный лаваж проводят по принятым правилам. вибробронхоскоп проводят в бронх до его заклинивания, после чего вводят подогретый до 37 °С 0,9%-й раствор натрия хлорида с помощью одноразовых шприцев 8 порций по 20 мл (150 - 160 мл). С целью предотвращения коллапса альвеол отсасывание проводят при 50 - 80 мм рт. ст. Данная процедура позволяет получить необходимое количество альвеолярных макрофагов, в которых размножается возбудитель ВП.

Правила получения материала для паразитологического исследования

С целью выяснения этиологического агента (агентов) инфекции нижних дыхательных путей при подозрении на паразитарную этиологию исследуется прижизненный (биоптаты) и посмертный материал.

При жизни легочную ткань получают трансбронхиальной биопсией с помощью бронхоскопа, что позволяет выявить пневмоцисты в 66 - 98%, однако этот метод забора материала показан далеко не всем больным. Получение материала для исследования возможно и при открытой биопсии легкого или с помощью чрезкожной интраторакальной аспирации легочной иглой у больных, которым противопоказано проведение транс бронхиальной биопсии при прогрессирующем течении заболевания. Метод открытой биопсии легкого дает наилучшие (100%) результаты и приравнивается по результату к хирургическому вмешательству, при этом получается достаточно большой объем материала для исследования и ложноотрицательный результат полностью исключается.

В настоящее время в клиниках стали активно исследовать бронхоальвеолярный лаваж для выявления цист и трофозоитов.

Посмертный материал собирают в течение первых суток после гибели больного, приготавливают мазки-отпечатки легкого или мазки из пенистого содержимого альвеол.

Правила получения трахеального аспирата для ПЦР-исследования

Манипуляцию проводят натощак после чистки зубов и полоскания полости рта водой. Пациента просят сделать несколько глубоких вдохов с задержкой дыхания на несколько секунд, затем с силой выдохнуть. Это способствует появлению продуктивного кашля и очищению верхних дыхательных путей от мокроты. После присоединения мукус-экстрактора через трубку-переходник к отсосу катетер для забора трахеального аспирата вводился в глотку через полость рта. Вследствие раздражения слизистой в области голосовой щели провоцируется кашлевой рефлекс и проводится извлечение трахеального содержимого через стерильный катетер (6-го или 7-го размера) с помощью отсоса. Объем трахеального аспирата должен составлять не менее 3-5 мл.

Правила получения индуцированной мокроты для бактериологического и ПЦР-исследования

Перед процедурой пациенты получают сальбутамол (дети - 200 мкг) через дозирующий ингалятор для предотвращения бронхоспазма. Затем в течение 15 мин через струйный небулайзер (аэрозольный аппарат) подается кислород со скоростью 5 л/мин с 5 мл 5%-го стерильного раствора NaCl. После этого проводится постукивание по передней и задней стенкам грудной клетки с целью стимуляции отхождения мокроты.

Затем пациента просят хорошо откашляться и собрать отделяемое из нижних дыхательных путей (не слюну!) в стерильный контейнер. Объем образца мокроты должен быть не менее 3 мл для взрослых и около 1 мл для детей.

В случае если мокрота не откашливается, процедуру рекомендуется комбинировать с последующим получением аспиратов из трахеи с целью отсасывания содержимого из трахеи с помощью стандартного отсоса с использованием стерильного катетера 6-го или 7-го размера.

До момента транспортирования образец вместе с направлением на бактериологическое исследование хранится в холодильнике при температуре 4-8 °С. Продолжительность хранения мокроты при комнатной температуре не должна превышать 2 ч. Для исследования методом ПЦР допускается хранение в течение 1 суток при температуре от 2 до 8 °С, более длительно - при температуре не выше-16 °С.

Правила получения мазков из верхних дыхательных путей для ПЦР-исследования

Материал берут после полоскания полости рта кипяченой водой комнатной температуры. Если полость носа заполнена слизью, перед процедурой рекомендуется провести высмаркивание. В течение 6 ч перед процедурой нельзя использовать медикаменты, орошающие носоглотку или ротоглотку и препараты для рассасывания во рту.

Мазки у пациента берут двумя разными зондами сначала со слизистой нижнего носового хода, а затем из ротоглотки, при этом концы зондов с тампонами после взятия мазков последовательно помещаются в одну пробирку объемом 1,5 - 2,0 мл с 0,5 мл транспортной среды.

Мазки со слизистой носоглотки у детей берут сухим стерильным назофарингеальным велюр-тампоном на пластиковом аппликаторе. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2 - 3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3 - 4 см для детей и 5 - 6 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой до места слома, при этом гибкая часть зонда сворачивается спиралью, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают.

Мазки со слизистой носоглотки у взрослых допустимо брать также сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2- 3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (5 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают на глубину 1 см в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой и отламывают, придерживая крышкой пробирки. Пробирку герметично закрывают.

Мазки из ротоглотки берут сухим стерильным зондом из полистирола с вискозным тампоном вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем. После забора материала рабочую часть зонда с тампоном помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой и зондом с мазком из носоглотки. Конец зонда с тампоном (1 см) отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Допускается хранение в течение трех суток при температуре 2-8 °С, более длительно - при температуре не выше -16 °С.

Правила получения материала для серологической диагностики (Выявление специфических антител)

Для серологического исследования (определение антител) необходимы две пробы сыворотки крови, 1-я проба берется в день постановки первичного диагноза, 2-я проба - через 2-3 недели после первой. Взятие крови осуществляется из вены в объеме 3-4 мл, или из третьей фаланги среднего пальца в объеме 0,5 - 1,0 мл в одноразовую пластиковую пробирку без антикоагулянта. Пробы крови отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин или помещают в термостат при 37 °С на 15 мин. После центрифугирования (10 мин при 3 ООО об./мин) сыворотку переносят в стерильные пробирки, используя для каждого образца отдельный наконечник с аэрозольным барьером. Срок хранения цельной крови - не более 6 ч, замораживание недопустимо. Срок хранения сыворотки крови при комнатной температуре - в течение 6 ч, при температуре 2 - 8 °С - в течение 5 суток, более длительно - при температуре не выше -16 °С (многократное замораживание/размораживание недопустимо).

Правила получения аутопсийного материала для ПЦР-исследования Посмертный материал собирают в течение первых суток после гибели больного стерильным индивидуальным инструментом (индивидуально для каждого органа) из зоны поврежденной ткани объемом 1 - 3 см , помещают в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры с герметично завинчивающейся крышкой, замораживают и хранят при температуре не выше - 16 °С.

Правила получения и транспортирования мочи для определения антигена легионелл или пневмококка

Образцы мочи для исследования объемом 5 - 10 мл помещают в стандартные пластиковые контейнеры и хранят при комнатной температуре (15 - 30 °С) не более 24 ч после забора перед постановкой реакции. В случае необходимости образцы могут храниться при температуре 2 - 8 °С до 14 дней или при -20 °С в течение длительного времени для первичного или повторного исследования. В качестве консерванта может быть использована борная кислота. Перед постановкой реакции охлажденные или замороженные образцы мочи исследуют на наличие антигена после достижения комнатной температуры.

Требования к маркировке материала для лабораторного исследования

На этикетке пробирок (контейнеров) с материалом указывается: фамилия и имя обследуемого, дата взятия материала, тип материала.

В сопроводительном документе (направлении) к материалу, собранному для исследования в лаборатории, необходимо указать:

- наименование учреждения, которое направляет материал на исследования, и телефон;

- фамилию и имя обследуемого больного;

- возраст;

- дату заболевания или контакта с больным;

- предполагаемый диагноз, тяжесть заболевания или повод к обследованию;

- степень тяжести заболевания;

- данные о вакцинации против гриппа в текущем эпидемическом сезоне (вакцинирован / не вакцинирован / нет данных);

- дату и подпись медицинского лица.

Транспортирование материала производится в термоконтейнерах при рекомендованной для хранения температуре. Образцы от каждого пациента дополнительно упаковываются в индивидуальный герметичный пакет с адсорбирующим материалом.

Обработка биологического материала перед проведением лабораторных исследований

В лаборатории перед началом проведения ПЦР-исследований биологического материала вязкой консистенции (мокрота, аспираты из трахеи) необходима его предобработка с целью снижения вязкости, например с помощью препарата типа "Муколизин", согласно инструкции. Аутопсийный материал подвергается гомогенизации с последующим приготовлением 20%-й суспензии с использованием буферного раствора (физиологического раствора натрия хлорида или фосфатного буфера).