Приложение 5. Правила забора материала для лабораторного исследования от больного (тела умершего) при подозрении на заболевание чумой, холерой, ТОРС, человеческим гриппом, вызванным новым подтипом, полиомиелитом

Приложение 5
к Инструкции

Правила
забора материала для лабораторного исследования от больного (тела умершего) при подозрении на заболевание чумой, холерой, ТОРС, человеческим гриппом, вызванным новым подтипом, полиомиелитом

1. Общие требования к забору проб биологического материала

Для предохранения от инфицирования при заборе проб биологического материала и доставке их в лабораторию медицинский работник должен соблюдать следующие требования:

- не загрязнять наружную поверхность посуды при заборе и доставке проб;

- не загрязнять сопроводительные документы (направления);

- свести к минимуму непосредственный контакт пробы биоматериала с руками медицинского работника, забирающего и доставляющего пробы в лабораторию;

- использовать стерильные одноразовые или разрешенные к применению для этих целей в установленном порядке контейнеры (емкости) для забора, хранения и доставки проб, для проб крови вакуумные системы забора крови соответствующего типа;

- транспортировать пробы, дважды упакованные, в запирающихся контейнерах или укладках с раздельными гнездами;

- соблюдать асептические условия в процессе выполнения инвазивных мероприятий для предотвращения инфицирования пациента;

- забирать пробы в чистую стерильную посуду, не имеющую дефектов.

2. Требования к забору проб при подозрении на заболевание чумой

В соответствии с МУК 4.2.2940-11 "Порядок организации и проведения лабораторной диагностики чумы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 14 июля 2011 г.), СП 3.1.7.2492-09 "Профилактика чумы"

Согласно действующим нормативным документам все виды диагностических работ с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителя чумы, проводятся только в специализированных лабораториях противочумных учреждений, имеющих на это соответствующее разрешение, персоналом, окончившим курсы специализации по особо опасным инфекциям и допущенным к работе с таким материалом приказом руководителя учреждения. Во всех случаях выявления больного (подозрительного, тела умершего), подозрительного на чуму, незамедлительно должны быть вызваны консультанты из противочумного учреждения. Забор материала от больных производится специалистами отдела надзора за особо опасным инфекциям Управления Роспотребнадзора по г. Москве и/или ФКУЗ "Противочумный центр" Роспотребнадзора.

В зависимости от формы проявления заболевания для исследования берут следующий материал:

- при кожной форме чумы - содержимое везикул, пустул, карбункулов, отделяемое язв, содержимое плотного инфильтрата, кровь;

- при бубонной - пунктат из бубона, кровь;

- при септической - кровь;

- при легочной - мокрота (слизь из зева), кровь.

Пунктат бубона (везикул, пустул, карбункулов) берут шприцем емкостью не менее 5 мл. Кожу на участке, намеченном для прокола, обрабатывают 70% спиртом, а затем смазывают 5%-ным раствором йода и вновь протирают спиртом. Иглу с толстым просветом вводят с таким расчетом, чтобы ее острие достигало центральной части бубона, после чего, немного оттянув поршень, медленно вытягивают иглу. Экссудат в чумном бубоне расположен между плотными тканями, количество его незначительно и часто заполняет только просвет иглы. Поэтому полезно перед пункцией бубона в шприц набрать 0,1-0,2 мл стерильного питательного бульона или изотонического раствора хлористого натрия. После извлечения иглы из бубона через нее набирают в шприц 0,5 мл того же бульона (рН 7,2) и содержимое выливают в стерильную пробирку, закрывают резиновой стерильной пробкой. Последние капли материала из шприца наносят на 2 предметных стекла. После высыхания капли стекла помешают в фиксатор с 96% этиловым спиртом. При невозможности получить материал в бубон вводят 0,3 мл стерильного физиологического раствора, а затем отсасывают его и помещают в стерильную пробирку. При вскрывшемся бубоне материал берут из периферической плотной части, как указано выше, и отдельно - отделяемое свища. Обе порции берут и исследуют раздельно. Пунктат из отека набирают в шприц и переносят в стерильную пробирку.

При подозрении на легочную форму мокроту для исследования собирают в стерильные широкогорлые банки с притертыми или завинчивающимися крышками. При отсутствии мокроты материал получают стерильным тампоном из зева.

При всех формах чумы берут кровь из вены в количестве 10 мл, засевая сразу 5 мл в 50 мл питательного бульона (рН 7.2), остальной материал используют в дальнейшем для посева на агар, заражения биопробных животных, а также постановки серологических реакций, приготовления мазков.

Забор материала от тела умершего для лабораторного исследования производят в соответствии с МУ 3.4.2552-09 Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения", (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 17 сентября 2009 г.).

3. При подозрении на заболевание холерой

(Выписка из Методических указаний МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры", Методических указаний МУК 4.2.2870-11 Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней")

Материал от больного (подозрительного) холерой забирает медицинский работник медицинской организации немедленно после выявления больного и до начала лечения антибиотиками (при наличии естественных выделений). Диагностические исследования на холеру проводит отделение особо опасных инфекций микробиологической лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве".

Для отбора проб используют чистую стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов (или однократного применения). Материал для исследования должен быть доставлен не позже чем через 2 часа после его взятия. В случае удлинения сроков доставки используются транспортные среды (наиболее удобной и достаточно эффективной является 1% пептонная вода).

Способы отбора проб от больных холерой, вибрионосителей и контактных с ними лиц:

- испражнения и рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в стерильную посуду стерильными ложками или стеклянными трубками с резиновой грушей из индивидуального судна, на дно которого помещают меньший по размеру сосуд (лоток), удобный для обеззараживания кипячением;

- для взятия материала у больных с обильным водянистым стулом можно использовать резиновый катетер, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опускают в банку. Жидкие испражнения стекают в сосуд свободно или при легком массаже брюшной стенки;

- стерильный ректальный ватный тампон из гигроскопической ваты вводят в прямую кишку на глубину 5-6 см и собирают им содержимое со стенок кишечника. Тампон опускают во флакон или пробирку с 1% пептонной водой, обломив часть деревянного стержня;

- при отсутствии испражнений материал забирают стандартной стерильной петлей из алюминиевой проволоки. Перед забором материала петлю смачивают стерильным 0,9% раствором натрия хлорида и вводят в прямую кишку на 5-6 см. Взятый материал переносят во флакон или пробирку с 1% пептонной водой;

- желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Материал доставляют нативным;

- от умерших с подозрением на холеру берут отрезки (длиной около 10 см) верхней, средней и нижней частей тонкой кишки, разрез производят двойными лигатурами, предварительно наложенными на оба конца изымаемого участка кишечника. Желчный пузырь после перевязки протока извлекают целиком. Содержимое кишечника и желчь от трупа можно взять стерильным шприцем с толстой иглой в объем до 10 мл и перенести в емкость с 1% пептонной водой. Взятые образцы органов трупа укладывают раздельно в стерильные банки.

Банки, пробирки в штативе с материалом закрывают непромокаемыми пробками и пергаментной бумагой, тщательно обрабатывают снаружи салфеткой, смоченной дезинфицирующим раствором, избегая затекания его внутрь. Все пробы этикетируют, укладывают в специально подготовленную для транспортирования металлическую тару и перевозят на служебном транспорте с сопровождающим.

Требования по упаковке и транспортировке материала

В строгом соответствии с санитарными правилами СП 3.1.1.2521-09 "Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации"

Каждую пробирку, банку или другую посуду, в которую помещен материал от больного (подозрительного или тела умершего) плотно закрывают резиновыми (корковыми, стеклянными, притертыми пробками, полиэтиленовыми или завинчивающимися крышками), обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором. После этого пробки заклеивают лейкопластырем или покрывают колпачком из хлорвиниловой пленки (целлофановой, вощеной бумаги или пергамента) и плотно завязывают. Затем пробирки помещают в металлический пенал, края между крышкой и корпусом пенала заклеивают лейкопластырем. Пенал заворачивают в целлофановую (вощеную) бумагу, делают пометку "Верх" и помещают в бикс. Каждую банку отдельно заворачивают в хлорвиниловую пленку, целлофановую, вощеную бумагу или марлю и помещают в бикс или металлический ящик, который опечатывают и отправляют в сопровождении 2-х человек - один из которых - медицинский работник, в отделение особо опасных инфекций микробиологической лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве" специально выделенным транспортом стационара по адресу: Графский переулок д. 4/9, ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве" Роспотребнадзора, микробиологическую лабораторию отделения особо опасных инфекций телефон 8 (495) 687-40-47 (исследования на холеру).

К посылке прилагают сопроводительный документ, в котором указывается фамилия, имя, отчество, возраст больного, диагноз, дата начала заболевания, дата смерти, вскрытия и взятия материала, часы забора, характер материала для исследования, примененные антибиотики (дата и доза), фамилия и должность врача, забравшего материал (МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры").

Биологический материал, взятый у больных (подозрительных) на чуму и другие инфекционные болезни I группы патогенности, доставляется в лабораторию ФКУЗ "Противочумный центр" Роспотребнадзора по адресу: ул. Мусоргского д. 4, телефон лаборатории 8 (499) 202-99-34, директор: 8 (499) 202-90-01, заместитель директора 8 (499) 745-26-60, 8 (499) 745-27-62. В нерабочее время, охрана - 8 (499) 202-20-64.

                    Бланк сопроводительного документа

                        Направление проб от людей

     в лабораторию _______________________________________________

     для исследования на ______________ от "__" __________ 20__ г.

Рег. номер	N пробы	Первичная или повторная	Характер материала	Ф.И.О.	Возраст	Диагноз	Адрес места жительства	Место работы	Время отбора пробы
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10

* Регистрационный номер проставляют в лаборатории

** Указать принимал(а) ли антибиотики (если да - то какие, когда и сколько)

     Пробы отбирали _____________________________________________________

                    _____________________________________________________

                    (Ф.И.О. должность)                          (Подписи)

     Пробы доставил _____________________________________________________

                    _____________________________________________________

                    (Ф.И.О. должность)                          (Подпись)

     Время доставки проб ________________________________________________

                                   (дата, время - часы, минуты)

4. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ТОРС

(выписка из МУ 1.3.1877-04 "Порядок сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторного анализа биологического материала от больных (умерших) пациентов с подозрением на тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)")

Все работы по забору, транспортировке и подготовке проб клинического материала должны осуществляться в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)", СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности", МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности".

Наиболее эффективно обследование методом ПЦР пациентов в первые 2 недели от начала заболевания, соблюдая, при этом, следующие правила:

- осуществлять забор материала только стерильными одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые флаконы, пробирки. Все виды работ проводят в одноразовых медицинских перчатках;

- забор материала должен производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой - производителем тест-систем;

- сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек;

- при переносе клинического материала из пробирок, флаконов в новые использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами;

- строго соблюдать правила хранения и транспортирования клинических проб. Охлаждающие элементы перед транспортированием клинического материала желательно замораживать при температуре минус 70°С.

Кровь

Забор материала	Для исследования методом ПЦР необходимо использовать плазму крови. Для проведения ИФА с тест-системой "ИФА-АНТИ-SARS-Coe" возможно использование сыворотки или плазмы крови. Для получения плазмы забор крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему "Venoject" (с ЭДТА), "Vacuett" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА). При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образовании пены) переносят в одноразовую пластиковую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом). Для получении сыворотки забор крови проводят натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или стеклянную пробирку типа "Vacuett" без антикоагулянта. При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносят в одноразовую стеклянную пробирку.
Предобработка проб	Проводится в лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве"
Условия хранения материала и предварительно обработанных проб	Образцы цельной крови: - при температуре 2-25°С - в течение 12 часов - для качественного определения нуклеиновых кислот. Недопустимо замораживание образцов цельной крови!
Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб	Транспортирование клинического материала и предобработанных проб осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. Образцы крови: при температуре 2-8°С - в течение 12 час - для качественного определения нуклеиновых кислот. Образцы плазмы и сыворотки: при температуре 2-8°С - в течение 3 суток. В замороженном виде - в течение 1 суток.

Фекалии

Забор материала	Используют пробы фекалий массой (объемом) 1-3 г (1-3 мл). Исследование мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 грамма (примерно) отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.
Предобработка проб	Проводится в лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве"
Условия хранения материала и предварительно обработанных проб	Образцы нативных фекалий: при температуре 2-8°С - в течение 1 суток. Фекальная суспензия с глицерином: при температуре минус 20°С в течение 1 недели; при температуре минус 70°С - длительно Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала.
Условия транспортирования материала и предварительно обработанных проб	Транспортирование клинического материала и предобработанных проб осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или термосе со льдом: Образцы нативных фекалий: при температуре 2-8°С в течение 6 часов. Предобработанные пробы: в замороженном виде - в течение 1 суток.

Мазки из полости носа

Забор материала	Мазки (слизь) берут сухими стерильными тампонами. Тампон вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с транспортной средой. Погрузив рабочую часть зонда в транспортную среду, вращают зонд в течение 10-15 сек., избегая разбрызгивания растворов. Вынимают зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки и, отжав избыток жидкости, удаляют зонд и закрывают пробирку.
Предобработка проб	Не требуется
Условия хранения материала	при комнатной температуре - в течение 6 часов; при температуре - 2-8°С в течение 1 недели; при температуре минус 20°С в течение 1 месяца; при температуре минус 70°С - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала	Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: при температуре 2-8°С в течение 1 суток; в замороженном виде - в течение 1 суток.

Смывы из полости носа

Забор материала	Забор материала проводят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью зонда или одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого изотонического раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного автоклавирования.
Предобработка проб	Не требуется.
Условия хранения материала	при температуре 2-8°С - в течение 6 часов; при температуре минус 20°С - в течение 1 недели; при температуре минус 70°С - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала	Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: при температуре 2-8°С в течение 6 часов; в замороженном виде - в течение 1 суток.

Смывы из ротоглотки

Забор материала	Перед забором смывов из ротоглотки проводят предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-15 сек.) 8-1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного автоклавирования.
Предобработка проб	Не требуется
Условия хранения материала	при температуре 2-8°С - в течение 6 часов; при температуре минус 20°С - в течение 1 недели; при температуре минус 70°С - длительно. Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала.
Условия транспортирования материала	Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: при температуре 2-8°С в течение 6 часов; в замороженном виде - в течение 1 суток.

Мокрота

Забор материала	Забор материала осуществляется в количестве не менее 0,5 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы (пробирки) с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50 мл.
Предобработка проб	Проводится в лабораториях ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве
Условия хранения материала и предварительно обработанных проб	при температуре 2-8°С - в течение 1 суток; при температуре минус 20°С - в течение 1 недели; при температуре минус 70°С - длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.
Условия транспортирования материала	Транспортирование клинического материала осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: при температуре 2-8°С в течение 6 часов; в замороженном виде - в течение 1 суток.

Упаковка и транспортировка образцов

1. Все материалы, доставляемые в лабораторию, должны быть последовательно "дважды упакованы":

- в транспортную емкость (плотно закрывающиеся пробирки или флаконы с завинчивающимися крышками). Плотно закрытый верхний конец транспортной емкости вместе с крышкой для надежности заклеивают парафинизированным полиэтиленом;

- в пластиковый пакет подходящего размера вместе с небольшим количеством адсорбирующего материала (вата). Пластиковый пакет следует заклеить или запаять.

2. Два или более образца одного пациента могут быть упакованы в один пластиковый пакет. Не допускается упаковывать образцы материалов от разных людей в один и тот же пакет.

3. Заклеенные пакеты с образцами помещают внутрь дополнительного пластикового контейнера с завинчивающейся крышкой. Строго дважды упакованные образцы материалов от разных пациентов могут быть транспортированы в одном дополнительном контейнере. В дополнительный контейнер также следует положить некоторое количество адсорбирующего материала.

4. Описание особенностей конкретного образца, полную информацию и добавочные сведения, касающиеся образцов, а также способ транспортирования и название лаборатории назначения приклеивают к наружной к наружной стенке дополнительного контейнера.

5. Плотно закрытые пластиковые контейнеры с заклеенными крышками помещают в термоизолирующий контейнер (термос), приспособленный для транспортирования биологических материалов.

6. Термоконтейнеры и термосы укомплектовывают охлаждающими элементами или льдом. Сроки и условия транспортирования упакованных проб клинического материала указы в таблице (см. выше).

7. Каждую пробу материала сопровождают бланком направления по форме, прикрепленным к наружной стенке контейнера.

8. Транспортирование проб клинического материала в референтную лабораторию (референс-центр) для дальнейшего исследования с целью подтверждения результатов осуществляется нарочным, информированным о правилах доставки материала.

Куда направлять: в отделение особо опасных инфекций микробиологической лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве".

Упаковка и транспортирование опасного биологического материала производить в строгом соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I-IV групп патогенности".

                        Наименование направляющей медицинской организации

                                     адрес ______________________________

                                     телефон ____________________________

                Направление на лабораторное исследование

                        с целью диагностики ТОРС

                                                   N ______ от __________

Фамилия, имя, отчество
Дата, месяц и год рождения
Домашний адрес
Предварительный диагноз
Материал
Дата и час взятия материала
Дата и час отправки материала в лабораторию
Необходимый температурный режим транспортирования
Дата и час доставки материала в лабораторию
Дата заболевания
Результат предварительного исследования (в случае отправки материала на подтверждение)	ПЦР фекалии
	ПЦР мазки\смывы
	ПЦР мокрота
	ПЦР плазма
	ИФА

ФИО ответственного лица __________________________ Подпись ______________

Дата

5. Сбор проб от больных полиомиелитом

В соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.2410-08 "Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП)"

Во всех случаях с диагнозом полиомиелита или с подозрением на полиомиелит или с симптомами острого вялого паралича, где диагноз полиомиелита не исключается, для вирусологического исследования берут две пробы фекалий, а для серологического исследования - две пробы сыворотки. В летальных случаях для подтверждения или отклонения диагноза полиомиелита берут пробы секционных материалов.

Пробы для выделения вируса

Пробы фекалий. От каждого больного берут две пробы фекалий. Первую пробу необходимо взять сразу после того, как предварительный диагноз ПМ (подозрение на ПМ) или ОВП будет установлен. Вторую пробу фекалий берут с интервалом в 24-48 часов. В летальных случаях секционные пробы необходимо взять в первые часы после смерти.

Оптимальный объем пробы фекалий - 4-8 г (соответствует величине ногтя большого пальца). Пробу помещают в стерильную (прокипяченную) сухую пробирку или пенициллиновый флакон с резиновой пробкой. В отдельных случаях, когда фекалии получить затруднительно, допускается взятие пробы из прямой кишки. Для этого стерильный ватный тампон вводят в прямую кишку и протирают слизистую оболочку так, чтобы захватить больше фокального материала. Тампон, отломив палочку, помещают в стерильную пробирку или флакон с резиновой пробкой. До отправки в лабораторию пробы хранят при 0 - +8°С.

Секционные пробы. В летальных случаях для вирусологического исследования, возможно раньше после наступления смерти, берут кусочки ткани (примерно 1 см3) из шейного и поясничного отделов спинного мозга, продолговатого мозга и Варолиева моста, а также из нисходящей толстой кишки. Ткани иссекают стерильным инструментом и помещают в отдельные стерильные пробирки или флаконы. Из толстой кишки иссекают сегмент длиной 3-5 см, содержащий фекальные массы. До отправки в лабораторию пробы хранят при 0 - +8°С. Двумя основными методами лабораторного подтверждения энтеровирусной инфекции являются выделение вируса и обнаружение РНК энтеровирусов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР используют при исследовании спинномозговой жидкости и материалов из верхних дыхательных путей.

Пробы крови для серологических исследований

Для диагностического исследования необходимы 2 пробы крови. Первая проба должна быть взята в день поступления больного и постановки предварительного диагноза, вторую пробу берут 2-3 недели спустя. Кровь берут стерильным шприцем из вены (5 мл) и помещают в стерильную пробирку со стерильной ватной пробкой. В отдельных случаях допустимо взять кровь, уколом пальца, собирая ее стерильной пипеткой в маленькую стерильную пробирку с резиновой пробкой (0,3-0,4 мл). Пробы крови (без добавления антикоагулянтов или консервантов) оставляют для свертывания при комнатной температуре (2 часа). После этого сгусток отделяют от стекла стерильной пастеровской пипеткой ("обводят") или отбивают от стекла двумя пальцами. Затем пробирку с кровью помещают в холодильник (на ночь), а затем стерильно отделяют сыворотку от сгустка. Сыворотку освобождают от остатка эритроцитов низкоскоростным центрифугированием (10 мин при 500-1000 об/мин) или отстаиванием и переносят в стерильную пробирку стерильной пипеткой. Соблюдение стерильности при взятии пробы крови и последующей ее обработке является необходимым условием, так как серологические исследования при полиомиелите проводятся в культуре ткани, и загрязнение сыворотки посторонней микрофлорой может исказить результаты.

До отправки в лабораторию пробы сыворотки хранят при 0 - +8°С.

Этикетировка проб

Вирусологические и серологические пробы снабжаются этикеткой (обычно для этой цели используют лейкопластырь), на которой четко обозначают фамилию больного, тип пробы и дату взятия. Одновременно с пробами в лабораторию направляются следующие сведения о каждой пробе от каждого больного: фамилия, имя, отчество, адрес, возраст, пол, данные о предшествующих вакцинациях против ПМ (тип вакцины, даты прививок), клинический диагноз, дата начала болезни, тип пробы, дата взятия. Обязательно сообщается фамилия, имя, отчество и адрес врача (медицинского работника), направляющего пробы и запрашивающего результаты исследований.

Хранение и пересылка проб

При хранении и транспортировании проб количества вируса и антител могут уменьшаться, что может значительно повлиять на результаты лабораторных исследований. Поэтому при хранении и пересылке пробы прежде всего, защищают от нагревания и высыхания. Пробы необходимо хранить и транспортировать при 0 - +8°С.

Пересылку проб осуществляют в термоизолирующих контейнерах (коробках, сумках) с охлаждающими пакетами. Пробы помещают в пластиковый мешок или коробку с достаточным количеством адсорбирующего материала на случай непредвиденной утечки жидкости. Сопровождающие документы помещают в водонепроницаемый пакет и вкладывают в контейнер.

Более подробно транспортирование лабораторных проб и оборудование для этой цели описаны в Руководстве по вирусологическим исследованиям при полиомиелите.

Выделенные в лаборатории штаммы типируют как I, II и III типы вируса полиомиелита и определяют их принадлежность к "диким" или вакцинно-родственным вариантам. При оценке результатов серологического обследования сывороток следует учитывать, что диагностическое значение имеет не менее чем 4-х кратное нарастание титра специфических антител. При отрицательных результатах вирусологического исследования значение серологических данных приобретает особое значение. В случае получения 1-ой пробы сыворотки в поздние сроки можно не выявить четкого нарастания титра антител. В этих случаях косвенное диагностическое значение приобретают высокие титры (1:64 и выше), особенно, если это монореакция, т.е. высокие титры к какому-то одному типу вируса полиомиелита.

6. Правила забора и транспортирования материалов от больных энтеровирусными заболеваниями для проведения серологических исследований

Для подтверждения диагноза проводят забор соответствующих материалов: тканей, фекалий, носоглоточных смывов, крови, везикулярной жидкости, спинномозговой жидкости и транспортирование их в лабораторию. Для успешного лабораторного исследования необходимо проводить как можно более ранний забор проб. Для забора проб используют стерильную стеклянную или пластиковую посуду.

Две пробы фекалий и для выделения вируса отбирают в течение 7 дней после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24-48 часов.

Носоглоточные\глоточные смывы отбирают в первые 3-4 дня от начала заболевания. Для получения смывов можно использовать стерильную дистиллированную воду, бульон или солевой раствор. Отбор материала с помощью глоточного тампона производят в те же сроки. Тампоном протирают заднюю стенку глотки, миндалин и небных дужек. Тампоны помещают в пробирку с 1-2 мл раствора Хэнкса; пробу исследуют сразу или хранят в замороженном виде.

Спинномозговую жидкость берут в первые дни болезни в асептических условиях стерильным шприцом только по клиническим показаниям.

Пробы крови для серологической диагностики следует брать утром натощак. На всех этапах взятия и обработки крови принимают меры для предотвращения гемолиза. Первую пробу крови (5 мл) берут как можно раньше после начала болезни, вторую - на 3-4 неделе, в стадии реконвалесценции. Параллельно кровь исследуют на выделение вируса - возбудителя болезни.

В случае летального исхода для исследования забирают секционные материалы - ткани головного, спинного и продолговатого мозга и Варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки.

Собранные пробы немедленно отправляют в лабораторию. Все пробы, кроме фекалий, спинномозговой жидкости и крови сразу же после взятия помещают в транспортировочную среду. Если отправка проб задерживается, их помещают в холодильник при температуре +4 - +8°С. Если время отправки превышает 24 часа пробы замораживают при температуре -20°С или ниже. Повторное замораживание и оттаивание сывороток (больше 4-х раз) может оказать неблагоприятное влияние на титр антител. Пробы помещают в пластиковые мешки, так чтобы избежать протечек и повреждений.

Материал для исследований направлять на безвозмездной основе:

1. От детей до 18 лет с диагнозом "серозный менингит" в вирусологическое отделение микробиологической лаборатории Управления Роспотребнадзора по городу Москве по адресу: Москва, Графский пер. д. 6/8, тел. 8 (495) 687-36-16.

2. От взрослых в ФГБУ "Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова" Российской академии медицинских наук, тел. 8 (495) 841-90-07, факс 8 (495) 841-93-30.

7. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики вируса гриппа птиц (МУК.4.2.2136-06)

Мазки из ротоглотки

1.1. Сбор материала	Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой. После взятия материала тампон помещают в стерильную одноразовую пробирку с 50 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствор фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают, чтобы плотно закрыть пробирку
1.2. Предобработка проб	Не требуется.
1.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
1.4. Условия хранения материала	При температуре от 2 до 8°С в течение 3-х суток. При температуре минус 70°С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала. Температура хранения минус 20°С не допускается.
1.5. Условия транспортирования материала	В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом: - при температуре 0-4°С не более трех суток; - при температуре минус 70° или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20°С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.

Мазки из носа

2.2. Сбор материала	Мазки (слизь) берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. Зонд с ватным тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Для метода иммунофлюоресценции забор материала производят перед другими манипуляциями. После взятия материала тампон помещают в пробирку с 2-3 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Для получения суспензии клеток тампоны в пробирке тщательно отжимают о стенки пробирки. Тампон удаляют. Пробирку закрывают. Для ПЦР-анализа - после взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую микропробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Конец зонда отламывают, чтобы можно было плотно закрыть крышку пробирку.
2.3. Предобработка проб	Для метода иммунофлюоресценции клетки осаждают центрифугированием в течение 5-6 мин при 3000 об\мин. Надосадочную жидкость удаляют, а клеточный осадок ресуспендируют в нескольких каплях и наносят на предметные стекла (не менее 3 шт.) раздельными каплями. Препарат высушивают и фиксируют 10 мин. в охлажденном до 2-8°С химически чистом ацетоне. Для ПЦР-анализа не требуется.
2.4. Метод исследования	МФА, ОТ-ПЦР
2.5. Условия хранения материала	Для метода иммунофлюоресценции фиксированные неокрашенные мазки можно хранить при температуре от 2 до 8°С в течение 6-7 дней, при температуре минус 20°С - до 6 мес.
2.6. Условия транспортирования	Для метода иммунофлюоресценции в термоконтейнере с охлаждающими элементами при температуре от 0 до 4°С. Для ПЦР см. п. 1.5.

Смывы из полости носа

3.1. Сбор материала	Сбор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа оба носовых хода поочередно с помощью одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.
3.2. Предобработка проб.	Не требуется.
3.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
3.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
3.5. Условия транспортирования материала.	См. п. 1.5.

Смывы из ротоглотки

4.1. Сбор материала	Перед сбором материала необходимо предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-16 сек.) 8-10 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.
4.2. Предобработка проб	Не требуется.
4.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
4.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
4.5. Условия транспортирования материала	См. п. 1.5.

Носоглоточное отделяемое

5.1. Сбор материала	Производится натощак после взятия мазков из полости носа. Осуществляется двумя способами: 1. Больной в три приема прополаскивает горло 10-15 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Смыв собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающими крышками объемом 50 мл. Ватными тампонами, зажатыми пинцетом протирают заднюю стенку глотки и носовые ходы. Ватные тампоны опускают во флакон со смывом. 2. Сухим или слегка увлажненным 0,9% раствором натрия хлорида тампоном, который удерживают с помощью пинцета, протирают заднюю стенку глотки и опускают его в пробирку с 5 мл стабилизирующей среды Процедуру повторяют 2 раза. Все тампоны от одного больного собирают в одну пробирку. После взятия материала тщательно протирают носовые ходы небольшими ватными тампонами и опускают их в туже пробирку. Пробирку закрывают.
5.2. Предобработка проб	Тампоны прополаскивают в стабилизирующей среде, в которой они содержались, отжимают о стенку сосуда и удаляют. Смыв отстаивают в холодильнике 40-60 мин. Центрифугирование и фильтрацию не проводят. Для выделения вируса используют среднюю часть отстоя, которую небольшими порциями переносят в 3 стерильные пробирки. Одну используют для выделения вируса. Остальные замораживают при температуре минус 70% или в жидком азоте.
5.3. Метод исследования	Выделение вируса
5.4. Условия хранения	При температуре от 2 до 8°С - не более 3-х дней. При температуре минус 70° или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала. Температура хранения минус 20°С не допускается.
5.5. Условия транспортирования	См. п. 1.5.

Фекалии

6.1. Сбор материала	Используют пробы фекалий массой 1-3 г (1-3 мл). Исследования мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 гр. отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.
6.2. Предобработка проб	При исследовании нативных фекалий без предшествующего замораживания готовят фекальную суспензию (при водянистой консистенции фекалий в виде прозрачной жидкости фекальную суспензию не готовят). Приготовление фекальной суспензии: В соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносят 0,8 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида. В каждую пробирку отдельным наконечником с аэрозольным барьером (или одноразовыми лопатками вносят 0,1 г (0,1 мл) фекалии и тщательно ресуспендируют на вортексе до образования гомогенной суспензии. При невозможности исследования материала в течение суток и\или необходимости длительного хранения к 10-20% суспензии фекалии в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида добавляют глицерин в конечной концентрации 10-15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30-40 мин. Приготовление осветленного экстракта фекалий: Для приготовления осветленного экстракта фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию подвергавшуюся замораживанию с глицерином. Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе.
6.3. Метод исследования	ОТ-ПЦР
6.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
6.5. Условия транспортирования	См. п. 1.5.

Секционный материал

7.1. Сбор материала	В качестве секционного материала используются ткани легких, трахеи, сегментарных бронхов, селезенки. Секционный материал собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл.
7.2. Предобработка проб	Кусочки органов гомогенизируют в стерильных фарфоровых ступках и готовят 10% суспензию на стерильном 0,9% растворе натрия хлорида или фосфатном буфере. Суспензию переносят в микропробирку на 1,5 мл и центрифугируют при 10000 оборотах в течение 30 сек. Супернатант используют для выделения РНК.
7.3. Метод исследования	ОТ - ПЦР
7.4. Условия хранения материала	См. п. 1.4.
7.5. Условия транспортирования	См. п. 1.5.